Name: construction of cyclic cell-penetrating peptides for enhanced penetration of biological barriers
Uploaded: 2022-09-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers at JoVE.com

Diese Arbeit wird von der Natural Science Foundation of China (21708031), der China Postdoctoral Science Foundation (BX20180264, 2018M643519) und den Fundamental Research Funds for the Central Universities (2682021ZTPY075) unterstützt.

1. Vorbereitung der Ausrüstung
Anmerkungen: Führen Sie alle Vorgänge in einem Betriebsabzug mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung durch.
<ol><li>Montieren Sie die manuelle Peptidsynthesevorrichtung im Abzug (Abbildung 1). Setzen Sie die Dreiwegehähne (siehe Materialtabelle) auf den Vakuumverteiler (siehe Materialtabelle) und schließen Sie sie an den Stickstoff (N2) an. Stellen Sie sicher...

<ol>
	<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-targeted+dual+site-selective+functionalized+poly(&#946;-amino+esters)+delivery+platform+for+nerve+regeneration.">Brain-targeted dual site-selective functionalized poly(&#946;-amino esters) delivery platform for nerve regeneration.</a> Nano Letters. 21 (7), 3007-3015 (2021).</li><li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+BBB+permeability+of+osmotically+active+poly(mannitol-co-PEI)+modified+with+rabies+virus+glycoprotein+via+selective+stimulation+of+caveolar+endocytosis+for+RNAi+therapeutics+in+Alzheimer's+disease.">Enhanced BBB permeability of osmotically active poly(mannitol-co-PEI) modified with rabies virus glycoprotein via selective stimulation of caveolar endocytosis for RNAi therapeutics in Alzheimer's disease.</a> Biomaterials. 38, 61-71 (2015).</li><li>Bian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cell-based+intercellular+delivery+of+transcription+factor+GATA4+on+ischemic+cardiomyopathy.">Effect of cell-based intercellular delivery of transcription factor GATA4 on ischemic cardiomyopathy.</a> Circulation Research. 100 (11), 1626-1633 (2007).</li><li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+low+molecular+weight+protamine+chemical+chimera+to+enhance+monomeric+insulin+intestinal+absorption.">The use of low molecular weight protamine chemical chimera to enhance monomeric insulin intestinal absorption.</a> Biomaterials. 34 (31), 7733-7743 (2013).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+STAT3-binding+peptide+exerts+antiproliferative+effects+and+antitumor+activity+by+inhibiting+STAT3+phosphorylation+and+signaling.">A specific STAT3-binding peptide exerts antiproliferative effects and antitumor activity by inhibiting STAT3 phosphorylation and signaling.</a> Cancer Research. 74 (8), 2144-2151 (2014).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEGylated+liposomes+with+NGR+ligand+and+heat-activable+cell-penetrating+peptide-doxorubicin+conjugate+for+tumor-specific+therapy.">PEGylated liposomes with NGR ligand and heat-activable cell-penetrating peptide-doxorubicin conjugate for tumor-specific therapy.</a> Biomaterials. 35 (14), 4368-4381 (2014).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+paclitaxel+delivery+facilitated+by+a+dual-functional+CPP+with+a+hydrophobic+hairpin+tail.">Intracellular paclitaxel delivery facilitated by a dual-functional CPP with a hydrophobic hairpin tail.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (4), 4853-4860 (2021).</li><li>Vasan, N., Baselga, J., Hyman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+on+drug+resistance+in+cancer.">A view on drug resistance in cancer.</a> Nature. 575 (7782), 299-309 (2019).</li><li>Cong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment-induced+in+situ+self-assembly+of+polymer-peptide+conjugates+that+attack+solid+tumors+deeply.">Microenvironment-induced in situ self-assembly of polymer-peptide conjugates that attack solid tumors deeply.</a> Angewandte Chemie International Edition. 131 (14), 4680-4685 (2019).</li><li>Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+nanoparticle+design+for+overcoming+biological+barriers+to+drug+delivery.">Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery.</a> Nature Biotechnology. 33 (9), 941-951 (2015).</li><li>Tian, Y., Zhou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+cell-penetrating+peptides+and+their+functionalization+of+polymeric+nanoplatforms+for+drug+delivery.">Advances in cell-penetrating peptides and their functionalization of polymeric nanoplatforms for drug delivery.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (2), 1-12 (2021).</li><li>Milletti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides:+Classes,+origin,+and+current+landscape.">Cell-penetrating peptides: Classes, origin, and current landscape.</a> Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).</li><li>Turner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptide+conjugates+of+peptide+nucleic+acids+(PNA)+as+inhibitors+of+HIV-1+Tat-dependent+trans-activation+in+cells.">Cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids (PNA) as inhibitors of HIV-1 Tat-dependent trans-activation in cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (21), 6837-6849 (2005).</li><li>Tunnemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+analysis+of+cell+penetration+ability+and+toxicity+of+oligo-arginines.">Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines.</a> Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).</li><li>Shi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stapling+of+short+cell-penetrating+peptides+for+enhanced+tumor+cell-and-tissue+dual-penetration.">Stapling of short cell-penetrating peptides for enhanced tumor cell-and-tissue dual-penetration.</a> Chemical Communications. 58 (14), 2299-2302 (2022).</li><li>Komin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peptide+for+transcellular+cargo+delivery:+Structure-function+relationship+and+mechanism+of+action.">A peptide for transcellular cargo delivery: Structure-function relationship and mechanism of action.</a> Journal of Controlled Release. 324, 633-643 (2020).</li><li>Dietrich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+permeable+stapled+peptide+inhibitor+of+Wnt+signaling+that+targets+&#946;-catenin+protein-protein+interactions.">Cell permeable stapled peptide inhibitor of Wnt signaling that targets &#946;-catenin protein-protein interactions.</a> Cell Chemical Biology. 24 (8), 958-968 (2017).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stapling+of+unprotected+helical+peptides+via+photo-induced+intramolecular+thiol-yne+hydrothiolation.">Stapling of unprotected helical peptides via photo-induced intramolecular thiol-yne hydrothiolation.</a> Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).</li><li>De Araujo, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+&#945;-helicity+of+cyclic+pentapeptides+in+water.">Comparative &#945;-helicity of cyclic pentapeptides in water.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (27), 6965-6969 (2014).</li><li>Chu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+understanding+cell+penetration+by+stapled+peptides.">Towards understanding cell penetration by stapled peptides.</a> Medicinal Chemistry Communications. 6 (1), 111-119 (2015).</li><li>Bock, J. E., Gavenonis, J., Kritzer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+in+shape:+Controlling+peptide+bioactivity+and+bioavailability+using+conformational+constraints.">Getting in shape: Controlling peptide bioactivity and bioavailability using conformational constraints.</a> ACS Chemical Biology. 8 (3), 488-499 (2013).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+stapling+architecture+on+physiochemical+properties+and+cell+permeability+of+stapled+&#945;-helical+peptides:+A+comparative+study.">Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled &#945;-helical peptides: A comparative study.</a> ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).</li><li>White, C. J., Yudin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contemporary+strategies+for+peptide+macrocyclization.">Contemporary strategies for peptide macrocyclization.</a> Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).</li><li>Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+tumor+vasculature:+An+emerging+concept+in+antiangiogenic+therapy.">Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy.</a> Science. 307 (5706), 58-62 (2005).</li><li>Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+synthesis+of+short+&#945;-helices+stabilized+by+the+hydrogen+bond+surrogate+approach.">Solid-phase synthesis of short &#945;-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach.</a> Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).</li><li>Baek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+stapled+p53+peptide+bound+to+Mdm2.">Structure of the stapled p53 peptide bound to Mdm2.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (1), 103-106 (2012).</li><li>Traboulsi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrocyclic+cell+penetrating+peptides:+A+study+of+structure-penetration+properties.">Macrocyclic cell penetrating peptides: A study of structure-penetration properties.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (3), 405-411 (2015).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proline-derived+transannular+N-cap+for+nucleation+of+short+&#945;-helical+peptides.">A proline-derived transannular N-cap for nucleation of short &#945;-helical peptides.</a> Chemical Communications. 52 (59), 9275-9278 (2016).</li><li>Muppidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+proteolytically+stable,+cell-permeable+peptide-based+selective+Mcl-1+inhibitors.">Rational design of proteolytically stable, cell-permeable peptide-based selective Mcl-1 inhibitors.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (36), 14734-14737 (2012).</li><li>Wiradharma, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+cationic+amphiphilic+&#945;-helical+peptides+as+antimicrobial+agents.">Synthetic cationic amphiphilic &#945;-helical peptides as antimicrobial agents.</a> Biomaterials. 32 (8), 2204-2212 (2011).</li><li>Jones, A. T., Sayers, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+entry+of+cell+penetrating+peptides:+Tales+of+tails+wagging+dogs.">Cell entry of cell penetrating peptides: Tales of tails wagging dogs.</a> Journal of Controlled Release. 161 (2), 582-591 (2012).</li></ol>

Die chemische Stabilisierung von Peptiden unter Einbeziehung von Konformationsbeschränkungen hat sich als effektive Strategie zur Verbesserung der Stabilität und Zellpermeabilität des Peptids26 erwiesen. In diesem Protokoll wird ein schrittweises Vorgehen für die Synthese zyklischer CPPs mit aromatischen Querverbindungen und die Bewertung ihrer Permeabilität über biologische Barrieren hinweg beschrieben. Im Vergleich zu den hydrophilen Lactam- oder Triazol-Quervernetzungen2...

In den letzten Jahrzehnten gab es rasante Fortschritte bei der Entwicklung von zellpenetrierenden Peptiden (CPPs) für die Verabreichung von Medikamenten. CPPs werden häufig als molekulare Transporter zur Behandlung einer Reihe von lebensbedrohlichen Krankheiten eingesetzt, darunter neurologische Erkrankungen1,2, Herzerkrankungen3, Diabetes4, Dermatose5 und Krebs 6,7. Krebs ist nach wie vor eine globale Gesundheitsbelastung, die mit einer hohen Morbiditäts- und Mortalitätsrate einhergeht, trotz breit angelegter Forschungsbemühungen8. Ein ernsthaftes Hindernis für die Behandlung von Krebs ist der eingeschränkte Zugang von Therapeutika zu tieferen Tumorzellen aufgrund physiologischer Barrieren wie der kompakten extrazellulären Matrix (EZM), abnormen Tumorgefäßen, multiplen Membranbarrieren und hohem interstitiellen Flüssigkeitsdruck (IFP)9. Daher wird die Entwicklung neuartiger CPPs mit überlegener Fähigkeit, Ladungen über biologische Barrieren hinweg zu transportieren, als eine wesentliche Strategie für die Krebsbehandlung angesehen10,11.
CPPs können hinsichtlich ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften in kationische, amphipathische und hydrophobe CPPs eingeteilt werden12. Unter diesen sind das positiv geladene HIV-TAT-Peptid und das synthetische Polyarginin von erheblicher Bedeutung in der biomedizinischen Forschung und wurden ausgiebig untersucht, um die intrazelluläre Wirkstoffverabreichung zu erleichtern13. Tunnemann et al. berichteten, dass eine Mindestlänge von acht Argininen für eine effiziente Zellpenetration der synthetischen Polyarginin-Peptide unerlässlich ist, basierend auf einer Zellpermeabilitätsstudie, die mit R3- bis R12-Peptiden durchgeführt wurde14. Diese CPPs haben jedoch aufgrund ihrer schnellen Hydrolyse in vivo in der Regel kurze Plasmahalbwertszeiten. Darüber hinaus ist wenig über die Optimierung der chemischen Struktur von CPPs bekannt, um ihre Transbarrierefähigkeit zu erhöhen, da es schwierig ist, mehrere Zellmembranen zu durchdringen15. Daher ist die Entwicklung neuartiger molekularer Transporter, die in der Lage sind, biologische Barrieren zu durchdringen, dringend erwünscht, um die Effizienz der Wirkstoffabgabe zu verbessern. Im Jahr 2020 entdeckten Komin et al.16 ein CPP namens CL-Peptid, das ein Helix-Motiv (RLLRLLR) und einen Polyarginin-Schwanz (R7) zur Durchquerung der Epithel-Monoschicht enthält. Eine Reihe von CL-Peptidvarianten wurde ebenfalls synthetisiert, indem das helikale Muster verändert wurde. Diese Erkundung könnte ein wichtiger Leitfaden für die Entwicklung neuartiger CPPs für die Lieferung von Ladungen über biologische Barrieren hinweg sein. Darüber hinaus optimierten Dietrich et al. die Zellpermeabilität des StAX-Peptids, indem sie den Wnt/β-Catenin-Signalweg hemmten, indem sie die Gesamthydrophobie der Peptide erhöhten17.
Die Konformationsrestriktion von unstrukturierten linearen Peptiden durch Cyclisierung ist ein effektiver Weg, um ihre proteolytische Stabilität und Permeabilität zu verbessern18,19,20. Die strukturelle Verstärkung erhöht die Proteaseresistenz zyklischer Peptide und macht sie in vivo im Vergleich zu ihren linearen Gegenstücken stabiler. Darüber hinaus kann die Cyclisierung von Peptiden potenziell das polare Peptidrückgrat maskieren, indem sie intramolekulare Wasserstoffbrückenbindungen fördert und so die Membranpermeabilität der Peptide21 erhöht. In den letzten zwei Jahrzehnten haben sich chemoselektive Cyclisierungsmethoden zu effektiven Strategien für die Konstruktion zyklischer Peptide mit unterschiedlichen Architekturen entwickelt, wie z. B. reiner Kohlenwasserstoff, Lactam, Triazol, m-Xylol, Perfluoraryl und anderen Querverbindungen22,23. Die biologische Barriere, die durch die ausgeklügelte Tumormikroumgebung auferlegt wird, könnte das Eindringen von Medikamenten in solide Tumore verringern24. Wir haben bereits festgestellt, dass die zyklischen CPPs eine überlegene Resistenz gegen enzymatische Verdauung aufwiesen als ihre linearen Gegenstücke20. Darüber hinaus ist die Gesamthydrophobie der Peptide entscheidend für ihre verbesserte Zellpermeabilität22. Basierend auf den oben diskutierten Studien kann die Hypothese aufgestellt werden, dass die Kombination aus einem positiv geladenen Muster, einer erhöhten Gesamthydrophobie und einer verbesserten Proteolysestabilität die Permeabilität von CPPs über biologische Barrieren hinweg erhöht. In einer kürzlich durchgeführten Studie haben wir zwei zyklische CPPs mit aromatischen Vernetzungen an den Positionen i und i+7 identifiziert, die im Vergleich zu ihren linearen Gegenstücken eine verbesserte Permeabilität in Tumorzellen und -geweben aufweisen15. In dieser Arbeit werden ein prägnantes Syntheseprotokoll für die Synthese fluoreszenzmarkierter zyklischer CPPs und die wichtigsten Schritte zur Untersuchung ihrer Permeabilität vorgestellt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-ethanedithiol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>K1722093</td>
			<td>stench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU)</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>A-0443697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,4&#39;-bis(bromomethyl)biphenyl</td>
			<td>TCI</td>
			<td>B1921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>4T1 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 &#176;C humidified incubator containing 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile&#160;</td>
			<td>Adamas</td>
			<td>1484971</td>
			<td>toxicity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Energy</td>
			<td>W330229</td>
			<td>skin harmful</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>673811</td>
			<td>flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST038</td>
			<td>skin harmful</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrospray Ionization Mass Spectrometer</td>
			<td>Waters</td>
			<td>G2-S Tof</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CytoFLEX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate isomer (FITC)</td>
			<td>Energy</td>
			<td>E0801812500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axio Observer 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-Arg(Pbf)-OH</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>F-81070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>GLS201115-35202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-&#946;Ala-OH</td>
			<td>Adamas</td>
			<td>51341C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 &#176;C humidified incubator containing 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 1260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Poroshell EC-C18 120, 4.6 &#215; 150 mm (pore size 120 &#197;, particle size 4 &#956;m)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>SP Scientific</td>
			<td>Vir Tis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>9758</td>
			<td>toxicity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter plate</td>
			<td>Thermo &#956;drop plate</td>
			<td>N12391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpholine</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>M99040</td>
			<td>irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-technology microplate reader</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>VARIOSKAN LUX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>E-81416</td>
			<td>irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethyl formamide</td>
			<td>Energy</td>
			<td>B020051</td>
			<td>harmful to skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7321010</td>
			<td>polypropylene chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rink Amide MBHA resin (0.572 mmol/g)</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>GLS180301-49101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-way stopcocks</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7328107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate insert</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>14211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>T63278</td>
			<td>corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>T-0284475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7231</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of cyclic cell-penetrating peptides for enhanced penetration of biological barriers

Krebs ist eine große Herausforderung für die globale Gesundheit. Die komplexe Mikroumgebung des Tumors schränkt jedoch im Allgemeinen den Zugang von Therapeutika zu tieferen Tumorzellen ein, was zu einem Tumorrezidiv führt. Um die begrenzte Durchdringung biologischer Barrieren zu überwinden, wurden zellpenetrierende Peptide (CPPs) mit ausgezeichneter Membrantranslokationsfähigkeit entdeckt und haben sich als nützliche molekulare Transporter für den Transport verschiedener Frachten in Zellen erwiesen. Konventionelle lineare CPPs weisen jedoch im Allgemeinen eine beeinträchtigte proteolytische Stabilität auf, was ihre Permeabilität über biologische Barrieren hinweg einschränkt. Daher ist die Entwicklung neuartiger molekularer Transporter, die biologische Barrieren durchdringen können und eine verbesserte proteolytische Stabilität aufweisen, sehr wünschenswert, um die Effizienz der Wirkstoffabgabe in biomedizinischen Anwendungen zu fördern. Wir haben zuvor eine Reihe von kurzen zyklischen CPPs mit aromatischen Vernetzungen synthetisiert, die im Vergleich zu ihren linearen Gegenstücken eine überlegene Permeabilität in Krebszellen und -geweben aufwiesen. In dieser Arbeit wird ein prägnantes Protokoll für die Synthese des fluoreszenzmarkierten zyklischen Polyarginin-R8-Peptids und seines linearen Gegenstücks sowie wichtige Schritte zur Untersuchung ihrer Zellpermeabilität beschrieben.

In diesem Protokoll wurde ein Syntheseverfahren vorgestellt, um das lineare Polyarginin R8 in seine cyclische Form zu bringen. Die SPPS wurde manuell mit einer einfachen Apparatur durchgeführt (Abbildung 1). Der detaillierte Syntheseprozess von SPPS ist in Abbildung 2 dargestellt. Kurzzeitig war das Harz ausreichend aufgequollen, gefolgt von der Entschützung der N α-Fmoc-Schutzgruppe. Anschließend wurde die N α-Fmoc-geschützte A...

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Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers

Dieses Protokoll beschreibt die Synthese von zyklischen zellpenetrierenden Peptiden mit aromatischen Querverbindungen und die Bewertung ihrer Permeabilität über biologische Barrieren hinweg.

Konstruktion zyklischer zellpenetrierender Peptide zur verbesserten Durchdringung biologischer Barrieren

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper ...

Ein gravierendes Hindernis für die Krebsbehandlung ist der eingeschränkte Zugang von Therapeutika zu tieferen Tumorzellen aufgrund physiologischer Barrieren. Daher ist die Entwicklung neuartiger molekularer Transporter, die in der Lage sind, biologische Barrieren zu behandeln, dringend erwünscht, um die Effizienz der Wirkstoffabgabe zu verbessern. Der Zweck dieses Verfahrens besteht darin, die zyklischen zellpenetrierenden Peptide für eine verbesserte Zell-zu-Zell-Penetration zu synthetisieren.Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass die Peptidcyclisierung einfach durch Substitutionsreaktionen mit Cystein und Harz erreicht werden kann, ohne dass Metallkatalysatoren erforderlich sind. Der Einbau aromatischer Vernetzungen verbessert die Gesamthydrophobie der Peptide im Vergleich zu den hydrophilen Lactam- oder Triazol-Querverbindungen und erhöht dadurch deren Permeabilität. Montieren Sie zunächst die manuelle Peptidsyntheseapparatur im Abzug.Setzen Sie die Dreiwegehähne auf den Vakuumverteiler und schließen Sie sie an Stickstoff an. Stellen Sie sicher, dass Sie die ungenutzten Einlässe verschließen. Befestigen Sie eine 10-Milliliter-Polypropylensäule an den Dreiwegehahnen und lassen Sie das Reaktionsgemisch oder die Lösungsmittel mit einem Gummipipettenkolben oder einem Vakuum über einen Abfallabscheider aus der Polypropylensäule ab.Um das Harz für die Peptidsynthese vorzubereiten, fügen Sie 4 bis 5 Milliliter DMF zur erforderlichen Harzmenge hinzu und überführen Sie es 30 Minuten lang mit sanftem Stickstoffsprudeln in die Polypropylensäule, um das Harz ausreichend aufzuquellen. Lassen Sie das ZMS ab und fügen Sie dem Harz 4 bis 5 Milliliter 50%Morpholin/DMF hinzu. Sprudeln Sie den Stickstoff 30 Minuten lang vorsichtig, um die N-terminale Fmoc-Gruppe zu entfernen, und lassen Sie die Mischung dann abtropfen.Waschen Sie das Harz dreimal gründlich, indem Sie 4 bis 5 Milliliter DMF in die Säule geben und jedes Mal mindestens 1 Minute lang mit Stickstoff sprudeln. Waschen Sie das Harz auf die gleiche Weise dreimal mit Dichlormethan und dreimal mit DMF. Als nächstes werden 648,8 Milligramm Fmoc und PBF-geschütztes Arginin und 372,6 Milligramm HATU in 5 Millilitern DMF in einem Zentrifugenröhrchen gelöst.Fügen Sie 348,4 Mikroliter DIPEA hinzu, um die Kupplungsreaktion zu aktivieren, und übertragen Sie das Reaktionsgemisch mit Harz in die Polypropylensäule. Rühren Sie das Gemisch 1 bis 2 Stunden lang vorsichtig mit sprudelndem Stickstoff und wiederholen Sie dann die Kupplungsreaktion einmal. Lassen Sie das Reaktionsgemisch ab und waschen Sie das Harz nacheinander mit DMF, Dichlormethan und erneut DMF jeweils dreimal für jeweils mindestens 1 Minute.Entfernen Sie die Fmoc-Schutzgruppe und waschen Sie das Harz gemäß dem zuvor gezeigten Verfahren, bevor Sie mit der Kopplung der nächsten Aminosäure fortfahren. Als nächstes koppeln Sie das Beta-Alanin als Abstandshalter für die FITC-Markierung mit dem gleichen Verfahren, das für die Aminosäurekopplung gezeigt wird, und fügen Sie dann im Dunkeln eine Mischung aus FITC, DIPEA und DMF zur Polypropylensäule hinzu, um eine FITC-Markierung von Peptiden auf dem Harz durchzuführen. Die Reaktion würde fast 8 Stunden dauern.Um die Cyclisierung des linearen Peptids durchzuführen, wird der Polypropylensäule 2 Minuten lang eine Mischung aus Trifluoressigsäure, Triisopropylsilan und Dichlormethan zugegeben, um die Trityl-schützende Gruppe von Cystein selektiv zu entfernen. Lassen Sie die Mischung abtropfen und wiederholen Sie den Vorgang, bis die gelbliche Lösung farblos wird, um die Trityl-Schutzgruppe vollständig zu entfernen. Führen Sie das Harz mindestens dreimal nacheinander mit DMF und Dichlormethan aus und lösen Sie 4 ,4'Bis-Brommethyl-biphenyl in DMF mit DIPEA auf.Geben Sie die Lösung in die Säule und reagieren Sie 4 Stunden lang. Waschen Sie das Harz zweimal für jeweils fünf Minuten mit 4 bis 5 Millilitern Methanol und trocknen Sie es mit einem kontinuierlichen Stickstoffstrom. Bei Cysteinhaltigen Peptiden behandeln Sie das Harz mit einem wirksamen Spaltcocktail aus Trifluoressigsäure, Triisopropylsilan und Wasser oder Trifluoressigsäure, Triisopropylsilan, 1 ,2-Ethanedithiol und Wasser.Behandeln Sie das peptidgebundene Harz 2 bis 3 Stunden lang, um das Peptid zu spalten, und entfernen Sie dann die Trifluoressigsäure vorsichtig mit einem Stickstoffstrahl. Um die rohen Peptide zu erhalten, werden 4 bis 5 Milliliter Diethylether zu der gespaltenen Peptidzubereitung hinzugefügt, um die rohen Peptide auszufällen, und bei 10.000 x g für 4 Minuten zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und lassen Sie das Peptid 3 Minuten lang in einem wirksamen Abzug an der Luft trocknen.Lösen Sie das kleine Rohpeptid in 800 Mikrolitern Acetonitril auf und analysieren Sie es anschließend mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie. 100.000 HeLa-Zellen in 2 Millilitern DMEM in einer 12-Well-Kammer mit Gewebekulturplatteneinsatz beimpfen und 24 Stunden lang in einem bei 37 Grad Celsius befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid inkubieren. Entfernen Sie das Medium und inkubieren Sie die Zellen in den Kammern mit 1 Milliliter 10 mikromolaren FITC-R8 oder FITC-sR8-4 in FBS-freiem DMEM für 1 Stunde.Entfernen Sie danach das Medium mit den Peptiden und waschen Sie die Zellen dreimal mit 1 Milliliter PBS. Geben Sie 1 Milliliter frisches FBS-freies DMEM in die Kammern und inkubieren Sie dann die HeLa-Zellen in der Kammer mit dem Gewebekulturplatteneinsatz für 2 Stunden mit den HeLa-Zellen auf den runden Deckgläsern am Boden. Fixieren Sie die HeLa-Zellen 15 Minuten lang mit 2,5 % Glutaraldehyd auf den runden Deckgläsern und färben Sie die Zellen dann 15 Minuten lang mit DAPI an.Zum Schluss werden die HeLa-Zellen auf den Deckgläsern unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Eine schematische Darstellung der Synthese von FITC-markiertem linearem R8-Peptid und FITC-markiertem geklammertem R8-Peptid wird hier vorgestellt. Die HPLC- und MS-Spektren des linearen R8-Peptids und des geklammerten R8-Peptids sind in dieser Abbildung dargestellt.Die Retentionszeit des geklammerten Peptids war wesentlich länger als die des linearen Analogons, was auf eine erhöhte Gesamthydrophobie des Peptids nach der Cyclisierung mit der hydrophoben Quervernetzung hinweist. Dieses grafische Bild stellt die Stabilität des linearen Peptids und des geklammerten Peptids in Gegenwart von 25%FBS dar. Das zyklische R8 bleibt nach 4-stündiger Inkubation mit FBS zu 77,3 % intakt, während sein lineares Gegenstück größtenteils abgebaut wurde, was auf eine verbesserte proteolytische Stabilität des zyklischen R8-Peptids hindeutet.Lebendzell-Fluoreszenzmikroskopie-Aufnahmen von HeLa-Zellen und 4T1-Zellen nach 1-stündiger Inkubation mit 3 mikromolaren FITC-markierten linearen R8-Peptid- und FITC-markierten geklammerten R8-Peptiden werden hier gezeigt. Es zeigt sich, dass die Zellen, die mit zyklischem R8 mit aromatischer Vernetzung behandelt wurden, eine höhere intrazelluläre Fluoreszenz aufwiesen als diejenigen, die mit ihrem linearen Gegenstück behandelt wurden. Ähnliche Ergebnisse wurden mit der durchflusszytometrischen Analyse erzielt.Um weiter zu untersuchen, ob zyklisches R8 eine verbesserte Zell-zu-Zell-Penetration verleiht, wurden Transwell-Modelle verwendet, um die Barrierepermeabilität der Peptide von einer Zellschicht zur anderen zu simulieren. Das zyklische R8 zeigte deutlich eine höhere Transbarriere-Penetration als das lineare R8-Peptid, was durch eine signifikante Zunahme der intrazellulären Fluoreszenz angezeigt wird. Die vollständige Entschützung der Tritylgruppe von Cystein und Harz ist wichtig für den nachfolgenden Cyclisierungsschritt.Außerdem hängt die Cyclisierungseffizienz aufgrund sterischer Effekte auch von den spezifischen Sequenzen und den Längen der Peptide ab. In einem solchen Fall wäre die Verwendung eines Harzes mit geringerer Beladungskapazität oder Cyclisierung der Peptide unter verdünnten Konzentrationen in der Lösungsphase hilfreich. Diese zyklischen Peptide zeigten eine verbesserte Zell-zu-Zell-Permeabilität im Vergleich zu ihren linearen Gegenstücken.Wir glauben, dass sie ein großes Potenzial für die Überwindung biologischer Barrieren darstellen und für weitere Anwendungen im Bereich der Medikamentenverabreichung verwendet werden.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Microwave-assisted Functionalization of Polyethylene glycol and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Mikrowellen-unterstützte Funktionalisierung von Poly (Ethylenglycol) und On-Harz Peptide zur Verwendung in Kettenpolymerisationen und Hydrogelierung

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large ...

Forschung

Chemie

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Bildung geordneter Strukturen Biomolekulare durch die Selbstorganisation von kurzen Peptiden

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Preparation of Hydrophobic Metal-Organic Frameworks via Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition of Perfluoroalkanes for the Removal of Ammonia

Herstellung von hydrophoben Metall-organische Gerüste über Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition von Perfluoralkanen für die Beseitigung von Ammoniak

Plasma enhanced chemical vapor deposition (PECVD) of perfluoroalkanes has long been studied for tuning the wetting properties of surfaces. For high ...

Preparation of Highly Porous Coordination Polymer Coatings on Macroporous Polymer Monoliths for Enhanced Enrichment of Phosphopeptides

Vorbereitung hoch poröser Koordinationspolymerbeschichtungen auf makroporösen Monoliths für verbesserte Anreicherung von Phosphopeptiden

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous ...

A Filter-based Surface Enhanced Raman Spectroscopic Assay for Rapid Detection of Chemical Contaminants

Ein Filter-basierten oberflächenverstärkter Raman-spektroskopische Assay zum schnellen Nachweis von chemischen Verunreinigungen

We demonstrate a method to fabricate highly sensitive surface-enhanced Raman spectroscopic (SERS) substrates using a filter syringe system that can be ...

Construction of Models for Nondestructive Prediction of Ingredient Contents in Blueberries by Near-infrared Spectroscopy Based on HPLC Measurements

Der Bau der Modelle für die zerstörungsfreie Vorhersage von Ingredient Inhalt in Heidelbeeren durch Nahinfrarotspektroskopie Basierend auf HPLC-Messungen

Nondestructive prediction of ingredient contents of farm products is useful to ship and sell the products with guaranteed qualities. Here, near-infrared ...

Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level

Synthese cyclischer Polymere und Charakterisierung ihrer Diffusionsbewegung im geschmolzenen Zustand auf der Einzelmolekülebene

We demonstrate a method for the synthesis of cyclic polymers and a protocol for characterizing their diffusive motion in a melt state at the single ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Einblicke in die Wechselwirkungen von Aminosäuren und Peptide mit anorganischen Materialien Verwendung von Einzelmolekülkraftspektroskopie

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Observation and Analysis of Blinking Surface-enhanced Raman Scattering

Beobachtung und Analyse der Oberfläche-enhanced Raman-Streuung zu blinken

From a single molecule at a silver nanoaggregate junction, blinking surface-enhanced Raman scattering (SERS) is observed. Here, a protocol is presented on ...