Name: construction of cyclic cell-penetrating peptides for enhanced penetration of biological barriers
Uploaded: 2022-09-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers at JoVE.com

이 연구는 중국 자연 과학 재단 (21708031), 중국 박사후 과학 재단 (BX20180264, 2018M643519) 및 중앙 대학 기초 연구 기금 (2682021ZTPY075)의 지원을 받고 있습니다.

1. 장비 준비
알림: 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 작동 흄 후드에서 모든 절차를 수행하십시오.
<ol><li>흄 후드에 수동 펩타이드 합성 장치를 조립합니다(그림 1). 3방향 마개(재료 표 참조)를 진공 매니폴드(재료 표 참조)에 놓고 질소(N2)에 연결합니다. 사용하지 않는 입구를 막아야 합니다.</li>
	<li>10mL ?...

<ol>
	<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-targeted+dual+site-selective+functionalized+poly(&#946;-amino+esters)+delivery+platform+for+nerve+regeneration.">Brain-targeted dual site-selective functionalized poly(&#946;-amino esters) delivery platform for nerve regeneration.</a> Nano Letters. 21 (7), 3007-3015 (2021).</li><li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+BBB+permeability+of+osmotically+active+poly(mannitol-co-PEI)+modified+with+rabies+virus+glycoprotein+via+selective+stimulation+of+caveolar+endocytosis+for+RNAi+therapeutics+in+Alzheimer's+disease.">Enhanced BBB permeability of osmotically active poly(mannitol-co-PEI) modified with rabies virus glycoprotein via selective stimulation of caveolar endocytosis for RNAi therapeutics in Alzheimer's disease.</a> Biomaterials. 38, 61-71 (2015).</li><li>Bian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cell-based+intercellular+delivery+of+transcription+factor+GATA4+on+ischemic+cardiomyopathy.">Effect of cell-based intercellular delivery of transcription factor GATA4 on ischemic cardiomyopathy.</a> Circulation Research. 100 (11), 1626-1633 (2007).</li><li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+low+molecular+weight+protamine+chemical+chimera+to+enhance+monomeric+insulin+intestinal+absorption.">The use of low molecular weight protamine chemical chimera to enhance monomeric insulin intestinal absorption.</a> Biomaterials. 34 (31), 7733-7743 (2013).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+STAT3-binding+peptide+exerts+antiproliferative+effects+and+antitumor+activity+by+inhibiting+STAT3+phosphorylation+and+signaling.">A specific STAT3-binding peptide exerts antiproliferative effects and antitumor activity by inhibiting STAT3 phosphorylation and signaling.</a> Cancer Research. 74 (8), 2144-2151 (2014).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEGylated+liposomes+with+NGR+ligand+and+heat-activable+cell-penetrating+peptide-doxorubicin+conjugate+for+tumor-specific+therapy.">PEGylated liposomes with NGR ligand and heat-activable cell-penetrating peptide-doxorubicin conjugate for tumor-specific therapy.</a> Biomaterials. 35 (14), 4368-4381 (2014).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+paclitaxel+delivery+facilitated+by+a+dual-functional+CPP+with+a+hydrophobic+hairpin+tail.">Intracellular paclitaxel delivery facilitated by a dual-functional CPP with a hydrophobic hairpin tail.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (4), 4853-4860 (2021).</li><li>Vasan, N., Baselga, J., Hyman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+on+drug+resistance+in+cancer.">A view on drug resistance in cancer.</a> Nature. 575 (7782), 299-309 (2019).</li><li>Cong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment-induced+in+situ+self-assembly+of+polymer-peptide+conjugates+that+attack+solid+tumors+deeply.">Microenvironment-induced in situ self-assembly of polymer-peptide conjugates that attack solid tumors deeply.</a> Angewandte Chemie International Edition. 131 (14), 4680-4685 (2019).</li><li>Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+nanoparticle+design+for+overcoming+biological+barriers+to+drug+delivery.">Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery.</a> Nature Biotechnology. 33 (9), 941-951 (2015).</li><li>Tian, Y., Zhou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+cell-penetrating+peptides+and+their+functionalization+of+polymeric+nanoplatforms+for+drug+delivery.">Advances in cell-penetrating peptides and their functionalization of polymeric nanoplatforms for drug delivery.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (2), 1-12 (2021).</li><li>Milletti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides:+Classes,+origin,+and+current+landscape.">Cell-penetrating peptides: Classes, origin, and current landscape.</a> Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).</li><li>Turner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptide+conjugates+of+peptide+nucleic+acids+(PNA)+as+inhibitors+of+HIV-1+Tat-dependent+trans-activation+in+cells.">Cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids (PNA) as inhibitors of HIV-1 Tat-dependent trans-activation in cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (21), 6837-6849 (2005).</li><li>Tunnemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+analysis+of+cell+penetration+ability+and+toxicity+of+oligo-arginines.">Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines.</a> Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).</li><li>Shi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stapling+of+short+cell-penetrating+peptides+for+enhanced+tumor+cell-and-tissue+dual-penetration.">Stapling of short cell-penetrating peptides for enhanced tumor cell-and-tissue dual-penetration.</a> Chemical Communications. 58 (14), 2299-2302 (2022).</li><li>Komin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peptide+for+transcellular+cargo+delivery:+Structure-function+relationship+and+mechanism+of+action.">A peptide for transcellular cargo delivery: Structure-function relationship and mechanism of action.</a> Journal of Controlled Release. 324, 633-643 (2020).</li><li>Dietrich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+permeable+stapled+peptide+inhibitor+of+Wnt+signaling+that+targets+&#946;-catenin+protein-protein+interactions.">Cell permeable stapled peptide inhibitor of Wnt signaling that targets &#946;-catenin protein-protein interactions.</a> Cell Chemical Biology. 24 (8), 958-968 (2017).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stapling+of+unprotected+helical+peptides+via+photo-induced+intramolecular+thiol-yne+hydrothiolation.">Stapling of unprotected helical peptides via photo-induced intramolecular thiol-yne hydrothiolation.</a> Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).</li><li>De Araujo, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+&#945;-helicity+of+cyclic+pentapeptides+in+water.">Comparative &#945;-helicity of cyclic pentapeptides in water.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (27), 6965-6969 (2014).</li><li>Chu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+understanding+cell+penetration+by+stapled+peptides.">Towards understanding cell penetration by stapled peptides.</a> Medicinal Chemistry Communications. 6 (1), 111-119 (2015).</li><li>Bock, J. E., Gavenonis, J., Kritzer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+in+shape:+Controlling+peptide+bioactivity+and+bioavailability+using+conformational+constraints.">Getting in shape: Controlling peptide bioactivity and bioavailability using conformational constraints.</a> ACS Chemical Biology. 8 (3), 488-499 (2013).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+stapling+architecture+on+physiochemical+properties+and+cell+permeability+of+stapled+&#945;-helical+peptides:+A+comparative+study.">Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled &#945;-helical peptides: A comparative study.</a> ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).</li><li>White, C. J., Yudin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contemporary+strategies+for+peptide+macrocyclization.">Contemporary strategies for peptide macrocyclization.</a> Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).</li><li>Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+tumor+vasculature:+An+emerging+concept+in+antiangiogenic+therapy.">Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy.</a> Science. 307 (5706), 58-62 (2005).</li><li>Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+synthesis+of+short+&#945;-helices+stabilized+by+the+hydrogen+bond+surrogate+approach.">Solid-phase synthesis of short &#945;-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach.</a> Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).</li><li>Baek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+stapled+p53+peptide+bound+to+Mdm2.">Structure of the stapled p53 peptide bound to Mdm2.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (1), 103-106 (2012).</li><li>Traboulsi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrocyclic+cell+penetrating+peptides:+A+study+of+structure-penetration+properties.">Macrocyclic cell penetrating peptides: A study of structure-penetration properties.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (3), 405-411 (2015).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proline-derived+transannular+N-cap+for+nucleation+of+short+&#945;-helical+peptides.">A proline-derived transannular N-cap for nucleation of short &#945;-helical peptides.</a> Chemical Communications. 52 (59), 9275-9278 (2016).</li><li>Muppidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+proteolytically+stable,+cell-permeable+peptide-based+selective+Mcl-1+inhibitors.">Rational design of proteolytically stable, cell-permeable peptide-based selective Mcl-1 inhibitors.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (36), 14734-14737 (2012).</li><li>Wiradharma, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+cationic+amphiphilic+&#945;-helical+peptides+as+antimicrobial+agents.">Synthetic cationic amphiphilic &#945;-helical peptides as antimicrobial agents.</a> Biomaterials. 32 (8), 2204-2212 (2011).</li><li>Jones, A. T., Sayers, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+entry+of+cell+penetrating+peptides:+Tales+of+tails+wagging+dogs.">Cell entry of cell penetrating peptides: Tales of tails wagging dogs.</a> Journal of Controlled Release. 161 (2), 582-591 (2012).</li></ol>

구조적 제약을 통합함으로써 펩티드의 화학적 안정화는 펩티드26의 안정성 및 세포 투과성을 개선하기 위한 효과적인 전략인 것으로 입증되었다. 이 프로토콜에서는 방향족 가교를 갖는 고리형 CPP의 합성 및 생물학적 장벽에 걸친 투과성 평가를 위한 단계별 절차가 설명됩니다. 친수성 락탐 또는 트리아 졸 가교 결합22,27과 비교하여, ...

지난 수십 년 동안 약물 전달을 위한 세포 침투 펩타이드(CPP) 개발이 급속히 발전했습니다. CPP는 신경 질환 1,2, 심장 질환3, 당뇨병4, 피부병5 및 암 6,7을 포함한 다양한 생명을 위협하는 질병의 치료를위한 분자 수송체로 널리 사용되었습니다. 암은 광범위한 연구 노력에도 불구하고 높은 이환율과 사망률을 동반하는 전 세계적인 건강 부담으로 남아 있습니다8. 암 치료의 심각한 장애물은 조밀한 세포외 기질(ECM), 비정상적인 종양 혈관 구조, 다막 장벽 및 높은 간질액 압력(IFP)과 같은 생리학적 장벽으로 인해 더 깊은 종양 세포에 대한 치료제의 제한된 접근입니다9. 따라서 생물학적 장벽을 넘어 화물을 운송할 수 있는 우수한 능력을 가진 새로운 CPP를 개발하는 것은 암 치료를 위한 필수 전략으로 간주됩니다10,11.
CPP는 물리화학적 특성12의 관점에서 양이온성, 양친매성 및 소수성 CPP로 분류할 수 있습니다. 이 중 양전하를 띤 HIV-TAT 펩타이드와 합성 폴리아르기닌은 생물의학 연구에서 상당히 중요하며 세포 내 약물 전달을 촉진하기 위해 광범위하게 연구되었습니다13. Tunnemann et al.은 R3 내지 R12 펩티드를 사용하여 수행된 세포 투과성 연구에 기초하여, 합성 폴리아르기닌 펩티드의 효율적인 세포 침투를 위해 8개의 아르기닌의 최소 길이가 필수적이라고 보고하였다14. 그러나, 이들 CPP는 일반적으로 생체 내에서 이들의 빠른 가수분해로 인해 짧은 혈장 반감기를 갖는다. 또한, 다중 세포막을 관통하는 것이 어렵기 때문에 이들의 트랜스-배리어 능력을 증가시키기 위한 CPP의 화학 구조의 최적화에 관해서는 알려진 바가 거의 없다(15). 따라서, 약물 전달 효율을 향상시키기 위해 생물학적 장벽을 관통할 수 있는 신규한 분자 수송체의 개발이 강력히 요구되고 있다. 2020년 Komin 등16 은 상피 단층을 가로지르는 나선 모티프(RLLRLLR)와 폴리아르기닌 꼬리(R7)를 포함하는 CL 펩타이드라는 CPP를 발견했습니다. CL 펩티드 변이체 세트는 또한 나선형 패턴을 변경하여 합성되었습니다. 이 탐사는 생물학적 장벽을 넘어 화물을 운송하기 위한 새로운 CPP 개발을 위한 중요한 지침이 될 수 있습니다. 또한, Dietrich et al. StAX 펩티드의 세포 투과성을 최적화하여 펩티드17의 전반적인 소수성을 증가시킴으로써 Wnt/β-카테닌 신호전달 경로를 억제하였다.
고리화에 의한 구조화되지 않은 선형 펩티드의 구조적 제한은 그들의 단백질 분해 안정성 및 투과성을 향상시키는 효과적인 방법이다18,19,20. 구조적 강화는 고리형 펩타이드의 프로테아제 저항성을 증가시켜 선형 펩타이드에 비해 생체 내에서 더 안정적으로 만듭니다. 또한, 펩티드의 고리화는 분자내 수소 결합을 촉진함으로써 잠재적으로 극성 펩티드 골격을 가릴 수 있고, 따라서 펩티드(21)의 막 투과성을 증가시킬 수 있다. 지난 20년 동안 화학선택적 고리화 방법은 모든 탄화수소, 락탐, 트리아졸, m-자일렌, 퍼플루오로아릴 및 기타 가교 결합과 같은 다양한 구조를 가진 고리형 펩타이드의 구성을 위한 효과적인 전략이 되었습니다22,23. 정교한 종양 미세 환경에 의해 부과된 생물학적 장벽은 고형 종양에서 약물의 침투를 감소시킬 수 있다24. 우리는 이전에 순환 CPP가 선형 CPP에 비해 효소 소화에 대해 우수한 저항성을 나타냈다는 것을 발견했다20. 또한, 펩타이드의 전반적인 소수성은 세포 투과성 향상에 매우 중요하다22. 위에서 논의한 연구를 기반으로 양전하를 띤 패턴, 증가된 전체 소수성 및 향상된 단백질 분해 안정성의 조합이 생물학적 장벽을 가로질러 CPP의 투과성을 증가시키는 가설을 세울 수 있습니다. 최근 연구에서, 우리는 위치 i와 i+7에서 방향족 가교결합을 갖는 두 개의 순환 CPP를 확인했는데, 이는 선형 CPP에 비해 종양 세포와 조직에서 향상된 투과성을 나타낸다15. 여기에서는 형광 표지된 순환 CPP의 합성을 위한 간결한 합성 프로토콜과 투과성을 조사하기 위한 주요 단계를 제시합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-ethanedithiol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>K1722093</td>
			<td>stench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU)</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>A-0443697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,4&#39;-bis(bromomethyl)biphenyl</td>
			<td>TCI</td>
			<td>B1921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>4T1 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 &#176;C humidified incubator containing 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile&#160;</td>
			<td>Adamas</td>
			<td>1484971</td>
			<td>toxicity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Energy</td>
			<td>W330229</td>
			<td>skin harmful</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>673811</td>
			<td>flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST038</td>
			<td>skin harmful</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrospray Ionization Mass Spectrometer</td>
			<td>Waters</td>
			<td>G2-S Tof</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CytoFLEX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate isomer (FITC)</td>
			<td>Energy</td>
			<td>E0801812500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axio Observer 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-Arg(Pbf)-OH</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>F-81070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>GLS201115-35202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-&#946;Ala-OH</td>
			<td>Adamas</td>
			<td>51341C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 &#176;C humidified incubator containing 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 1260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Poroshell EC-C18 120, 4.6 &#215; 150 mm (pore size 120 &#197;, particle size 4 &#956;m)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>SP Scientific</td>
			<td>Vir Tis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>9758</td>
			<td>toxicity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter plate</td>
			<td>Thermo &#956;drop plate</td>
			<td>N12391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpholine</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>M99040</td>
			<td>irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-technology microplate reader</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>VARIOSKAN LUX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>E-81416</td>
			<td>irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethyl formamide</td>
			<td>Energy</td>
			<td>B020051</td>
			<td>harmful to skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7321010</td>
			<td>polypropylene chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rink Amide MBHA resin (0.572 mmol/g)</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>GLS180301-49101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-way stopcocks</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7328107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate insert</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>14211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>T63278</td>
			<td>corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>T-0284475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7231</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of cyclic cell-penetrating peptides for enhanced penetration of biological barriers

암은 세계 보건에서 큰 도전이었습니다. 그러나 복잡한 종양 미세 환경은 일반적으로 더 깊은 종양 세포에 대한 치료제의 접근을 제한하여 종양 재발을 유발합니다. 생물학적 장벽의 제한된 침투를 극복하기 위해 세포 침투 펩타이드(CPP)가 우수한 막 전위 능력을 가지고 발견되었으며 다양한 화물을 세포로 전달하는 데 유용한 분자 수송체로 부상했습니다. 그러나 기존의 선형 CPP는 일반적으로 단백질 분해 안정성이 손상되어 생물학적 장벽을 가로지르는 투과성을 제한합니다. 따라서, 생물학적 장벽을 뚫을 수 있고 향상된 단백질 분해 안정성을 나타낼 수 있는 신규한 분자 수송체의 개발은 생물의학 응용에서 약물 전달 효율을 촉진하기 위해 매우 요구되고 있다. 우리는 이전에 방향족 가교결합을 가진 짧은 고리형 CPP 패널을 합성했으며, 이는 선형 CPP에 비해 암세포와 조직에서 우수한 투과성을 나타냈습니다. 여기에서는 형광 표지된 고리형 폴리아르기닌 R8 펩타이드 및 그 선형 대응물의 합성과 세포 투과성을 조사하기 위한 주요 단계에 대한 간결한 프로토콜이 설명되어 있습니다.

이 프로토콜에서는 선형 폴리아르기닌 R8을 고리형 형태로 제한하는 합성 절차가 제시되었습니다. SPPS는 간단한 장치를 사용하여 수동으로 수행되었습니다(그림 1). SPPS의 상세한 합성 공정은 그림 2에 나와 있습니다. 간략하게, 수지를 충분히 팽윤시키고, 이어서 N α-Fmoc 보호기의 탈보호가 뒤따랐다. 이어서, N α-Fmoc-보호?...

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Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers

이 프로토콜은 방향족 가교를 갖는 고리형 세포 침투 펩타이드의 합성과 생물학적 장벽을 통한 투과성 평가를 설명합니다.

생물학적 장벽의 침투 강화를 위한 순환 세포 침투 펩타이드의 구성

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper ...

암 치료의 심각한 장애물은 생리학적 장벽으로 인해 더 깊은 종양 세포에 대한 치료제의 접근이 제한된다는 것입니다. 따라서, 약물 전달 효율을 향상시키기 위해 생물학적 장벽을 치료할 수 있는 신규한 분자 수송체의 개발이 강력히 요구되고 있다. 이 절차의 목적은 향상된 세포 간 침투를 위해 순환 세포 침투 펩타이드를 합성하는 것입니다.이 방법의 장점은 금속 촉매 없이 시스테인 및 수지와의 치환 반응을 통해 펩타이드 고리화를 쉽게 달성할 수 있다는 것입니다. 방향족 가교결합의 혼입은 친수성 락탐 또는 트리아졸 가교결합에 비해 펩티드의 전반적인 소수성을 향상시켜 투과성을 향상시킵니다. 시작하려면 흄 후드에 수동 펩타이드 합성 장치를 조립하십시오.3방향 스톱콕을 진공 매니폴드에 놓고 질소에 연결합니다. 사용하지 않는 입구를 막아야 합니다. 10밀리리터 폴리프로필렌 컬럼을 3방향 마개에 부착하고 고무 피펫 전구 또는 폐기물 트랩을 통해 진공을 사용하여 폴리프로필렌 컬럼에서 반응 혼합물 또는 용매를 배출합니다.펩타이드 합성을 위한 수지를 준비하기 위해 필요한 양의 수지에 4-5밀리리터의 DMF를 첨가하고 30분 동안 부드러운 질소 버블링으로 폴리프로필렌 컬럼으로 옮겨 수지를 적절하게 팽창시킵니다. DMF를 배출하고 수지에 4-5 밀리리터의 50 % 모르 폴린 / DMF를 첨가하십시오. 질소를 30분 동안 부드럽게 버블링하여 N-말단 Fmoc 그룹을 제거한 다음 혼합물을 배출합니다.컬럼에 4 내지 5 밀리리터의 DMF를 첨가하고 매번 적어도 1 분 동안 질소로 버블 링하여 수지를 3 회 철저히 세척한다. 같은 방법으로 수지를 디클로로메탄으로 3회, DMF로 3회 세척한다. 다음으로, 648.8 밀리그램의 Fmoc 및 PBF 보호 아르기닌과 372.6 밀리그램의 HATU를 5 밀리리터의 DMF에 원심분리기 튜브에 용해시킨다.348.4 마이크로리터의 DIPEA를 첨가하여 커플링 반응을 활성화하고, 반응 혼합물을 수지와 함께 폴리프로필렌 컬럼으로 옮긴다. 혼합물을 질소 버블링으로 1 내지 2시간 동안 부드럽게 교반한 다음, 커플링 반응을 한 번 반복한다. 반응 혼합물을 배출하고 DMF, 디클로로메탄, 그리고 다시 DMF로 순차적으로 적어도 1분 동안 각각 3회 세척한다.Fmoc 보호기를 제거하고 다음 아미노산 결합을 진행하기 전에 앞서 표시된 절차에 따라 수지를 세척합니다. 다음으로, 아미노산 결합에 대해 표시된 것과 동일한 공정을 사용하여 FITC 라벨링용 스페이서로 베타 알라닌을 결합한 후, FITC, DIPEA 및 DMF의 혼합물을 암실에서 폴리프로필렌 컬럼에 추가하여 수지에 대한 펩타이드의 FITC 라벨링을 수행합니다. 반응에는 거의 8 시간이 걸립니다.선형 펩타이드의 고리화를 수행하기 위해 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실란 및 디클로로메탄의 혼합물을 폴리프로필렌 컬럼에 2분 동안 첨가하여 시스테인의 트리틸 보호기를 선택적으로 제거한다. 혼합물을 배출하고 황색 용액이 무색이 될 때까지 절차를 반복하여 삼중 수소 보호기를 완전히 제거한다. DMF와 디클로로메탄으로 수지를 3회 이상 순차적으로 세척하고 DIPEA로 DMF에 4,4'비스-브로모메틸-비페닐을 용해시킵니다.용액을 컬럼에 넣고 4시간 동안 반응시킵니다. 수지를 4 내지 5 밀리리터의 메탄올로 각각 5 분 동안 2 회 세척하고, 질소의 연속 흐름으로 건조시킨다. 시스테인을 함유하는 펩타이드의 경우, 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실란 및 물 또는 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실란, 1,2-에탄디티올 및 물의 효과적인 절단 칵테일로 수지를 처리합니다.펩티드 결합 수지를 2 내지 3시간 동안 처리하여 펩티드를 절단한 다음, 질소 스트림으로 트리플루오로아세트산을 조심스럽게 제거한다. 조 펩티드를 얻기 위해, 4 내지 5 밀리리터의 디 에틸 에테르를 쪼개진 펩티드 제제에 첨가하여 조 펩티드를 침전시키고, 10, 000 x g에서 4 분 동안 원심 분리한다. 상층액을 조심스럽게 버리고 효과적인 흄 후드에서 3분 동안 펩타이드를 자연 건조합니다.소규모 조잡한 펩타이드를 800 마이크로 리터의 아세토 니트릴에 용해시킨 다음 역상 고성능 액체 크로마토 그래피 및 액체 크로마토 그래피 질량 분석법을 사용하여 분석합니다. 조직 배양 플레이트 삽입물이 있는 12웰 챔버에서 DMEM 2밀리리터에 100, 000개의 HeLa 세포를 접종하고 5% 이산화탄소를 함유하는 섭씨 37도의 가습 배양기에서 24시간 동안 배양합니다. 배지를 제거하고, FBS가 없는 DMEM에서 10 마이크로몰 FITC-R8 또는 FITC-sR8-4와 함께 챔버에서 세포를 1시간 동안 인큐베이션한다.그 후, 펩타이드가 포함된 배지를 제거하고 1 밀리리터의 PBS로 세포를 3회 세척하였다. 1밀리리터의 신선한 FBS가 없는 DMEM을 챔버에 추가한 다음 조직 배양 플레이트 삽입물과 함께 챔버에서 HeLa 세포를 공동 배양하고 HeLa 세포를 바닥의 둥근 커버슬립에 2시간 동안 함께 배양합니다. HeLa 세포를 2.5% 글루타르알데히드로 15분 동안 둥근 커버슬립에 고정한 다음 DAPI로 15분 동안 세포를 염색합니다.마지막으로 형광 현미경으로 커버슬립의 HeLa 세포를 관찰합니다. FITC 표지된 선형 R8 펩타이드 및 FITC 표지된 스테이플 R8 펩타이드의 합성에 대한 개략도가 여기에 제시되어 있습니다. 선형 R8 펩타이드 및 스테이플 R8 펩타이드의 HPLC 및 MS 스펙트럼이 이 그림에 나와 있습니다.스테이플 펩티드의 머무름 시간은 선형 유사체의 머무름 시간보다 실질적으로 더 길었으며, 이는 소수성 가교결합을 이용한 고리화 후 펩티드의 향상된 전체 소수성을 나타냅니다. 이 그래픽 이미지는 25% FBS가 존재할 때 선형 펩타이드와 스테이플 펩타이드의 안정성을 나타냅니다. 고리형 R8은 4시간 동안 FBS와 함께 배양한 후 77.3%의 온전한 상태를 유지하는 반면, 선형 R8은 대부분 분해되어 고리형 R8 펩타이드의 향상된 단백질 분해 안정성을 시사합니다.3 마이크로몰 FITC 표지 선형 R8 펩타이드 및 FITC 표지 스테이플 R8 펩타이드와 함께 1시간 배양한 후 HeLa 세포 및 4T1 세포의 라이브 셀 형광 현미경 이미지가 여기에 표시됩니다. 방향족 가교결합을 갖는 고리형 R8로 처리된 세포는 선형 반응물로 처리된 세포보다 더 높은 세포내 형광을 나타냈다는 것을 알 수 있다. 유세포 분석에서도 유사한 결과가 얻어졌다.순환 R8이 향상된 세포 간 침투를 제공하는지 여부를 추가로 조사하기 위해 트랜스웰 모델을 사용하여 한 세포층에서 다른 세포층으로 펩타이드의 장벽 투과성을 시뮬레이션했습니다. 사이클릭 R8은 선형 R8 펩타이드보다 더 높은 트랜스-배리어 침투를 분명히 나타냈으며, 이는 세포 내 형광의 현저한 증가에 의해 나타났다. 시스테인 및 수지의 트리틸 그룹의 완전한 탈보호는 다음의 고리화 단계에서 중요하다.게다가, 고리화 효율은 또한 입체 효과로 인한 펩타이드의 특정 서열과 길이에 따라 달라집니다. 이러한 경우, 더 낮은 로딩 용량 또는 고리화를 가진 수지를 사용하여 용액 상에서 희석된 농도 하의 펩타이드를 사용하는 것이 도움이 될 것입니다. 이러한 고리형 펩타이드는 선형 펩타이드에 비해 향상된 세포 간 투과성을 보여주었습니다.우리는 그들이 생물학적 장벽을 정복할 수 있는 큰 가능성을 가지고 있으며 약물 전달 분야의 추가 응용 분야를 위한 분자에 사용될 것이라고 믿습니다.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Microwave-assisted Functionalization of Polyethylene glycol and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

전자 레인지를 이용한 폴리의 기능화 (에틸렌 글리콜) 및 체인 중합 및 하이드로 겔 형성에있는 사용을위한 온 수지 펩티드

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large ...

연구

화학

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

짧은 펩타이드의 자기 조립에 의해 주문 생체 고분자 구조의 형성

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Preparation of Hydrophobic Metal-Organic Frameworks via Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition of Perfluoroalkanes for the Removal of Ammonia

플라즈마 통해 소수성 유기 금속 프레임 워크의 제조 암모니아의 제거에 대한 퍼플 루오로 알칸의 화학 증착을 강화

Plasma enhanced chemical vapor deposition (PECVD) of perfluoroalkanes has long been studied for tuning the wetting properties of surfaces. For high ...

Preparation of Highly Porous Coordination Polymer Coatings on Macroporous Polymer Monoliths for Enhanced Enrichment of Phosphopeptides

포스 포의 향상된 농축을위한 거대 다공성 고분자 모노리스에 다공성 조정 폴리머 코팅의 제조

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous ...

A Filter-based Surface Enhanced Raman Spectroscopic Assay for Rapid Detection of Chemical Contaminants

화학 오염 물질의 신속 검출을위한 라만 분광 분석 향상된 필터 기반의 표면

We demonstrate a method to fabricate highly sensitive surface-enhanced Raman spectroscopic (SERS) substrates using a filter syringe system that can be ...

Construction of Models for Nondestructive Prediction of Ingredient Contents in Blueberries by Near-infrared Spectroscopy Based on HPLC Measurements

HPLC 측​​정을 바탕으로 근적외선 분광법에 의한 블루 베리의 성분 내용의 비파괴 예측을위한 모델의 건설

Nondestructive prediction of ingredient contents of farm products is useful to ship and sell the products with guaranteed qualities. Here, near-infrared ...

Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level

단일 분자 수준에서 순환 고분자의 합성 및 용융 상태에서 그들의 확산 운동의 특성

We demonstrate a method for the synthesis of cyclic polymers and a protocol for characterizing their diffusive motion in a melt state at the single ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

단일 분자 힘 분광학을 사용하여 무기 재료와 아미노산 및 펩타이드의 상호 작용에 대한 통찰력

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Observation and Analysis of Blinking Surface-enhanced Raman Scattering

관찰 및 깜박이 표면 강화 된 라만 산란의 분석

From a single molecule at a silver nanoaggregate junction, blinking surface-enhanced Raman scattering (SERS) is observed. Here, a protocol is presented on ...