Name: construction of cyclic cell-penetrating peptides for enhanced penetration of biological barriers
Uploaded: 2022-09-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers at JoVE.com

Dette arbeidet støttes av Natural Science Foundation of China (21708031), China Postdoctoral Science Foundation (BX20180264, 2018M643519) og Fundamental Research Funds for the Central Universities (2682021ZTPY075).

1. Forberedelse av utstyr
MERK: Utfør alle prosedyrene i en avtrekkshette med egnet personlig verneutstyr.
<ol><li>Monter det manuelle peptidsynteseapparatet i avtrekksdekselet (figur 1). Plasser treveis stoppekraner (se materialfortegnelse) på vakuummanifolden (se materialfortegnelse) og koble til nitrogenet (N2). Sørg for å sette lokk på de ubrukte innløpene.</li>
	<li>Fest en 10 ml polypropyl...

<ol>
	<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-targeted+dual+site-selective+functionalized+poly(&#946;-amino+esters)+delivery+platform+for+nerve+regeneration.">Brain-targeted dual site-selective functionalized poly(&#946;-amino esters) delivery platform for nerve regeneration.</a> Nano Letters. 21 (7), 3007-3015 (2021).</li><li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+BBB+permeability+of+osmotically+active+poly(mannitol-co-PEI)+modified+with+rabies+virus+glycoprotein+via+selective+stimulation+of+caveolar+endocytosis+for+RNAi+therapeutics+in+Alzheimer's+disease.">Enhanced BBB permeability of osmotically active poly(mannitol-co-PEI) modified with rabies virus glycoprotein via selective stimulation of caveolar endocytosis for RNAi therapeutics in Alzheimer's disease.</a> Biomaterials. 38, 61-71 (2015).</li><li>Bian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cell-based+intercellular+delivery+of+transcription+factor+GATA4+on+ischemic+cardiomyopathy.">Effect of cell-based intercellular delivery of transcription factor GATA4 on ischemic cardiomyopathy.</a> Circulation Research. 100 (11), 1626-1633 (2007).</li><li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+low+molecular+weight+protamine+chemical+chimera+to+enhance+monomeric+insulin+intestinal+absorption.">The use of low molecular weight protamine chemical chimera to enhance monomeric insulin intestinal absorption.</a> Biomaterials. 34 (31), 7733-7743 (2013).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+STAT3-binding+peptide+exerts+antiproliferative+effects+and+antitumor+activity+by+inhibiting+STAT3+phosphorylation+and+signaling.">A specific STAT3-binding peptide exerts antiproliferative effects and antitumor activity by inhibiting STAT3 phosphorylation and signaling.</a> Cancer Research. 74 (8), 2144-2151 (2014).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEGylated+liposomes+with+NGR+ligand+and+heat-activable+cell-penetrating+peptide-doxorubicin+conjugate+for+tumor-specific+therapy.">PEGylated liposomes with NGR ligand and heat-activable cell-penetrating peptide-doxorubicin conjugate for tumor-specific therapy.</a> Biomaterials. 35 (14), 4368-4381 (2014).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+paclitaxel+delivery+facilitated+by+a+dual-functional+CPP+with+a+hydrophobic+hairpin+tail.">Intracellular paclitaxel delivery facilitated by a dual-functional CPP with a hydrophobic hairpin tail.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (4), 4853-4860 (2021).</li><li>Vasan, N., Baselga, J., Hyman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+on+drug+resistance+in+cancer.">A view on drug resistance in cancer.</a> Nature. 575 (7782), 299-309 (2019).</li><li>Cong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment-induced+in+situ+self-assembly+of+polymer-peptide+conjugates+that+attack+solid+tumors+deeply.">Microenvironment-induced in situ self-assembly of polymer-peptide conjugates that attack solid tumors deeply.</a> Angewandte Chemie International Edition. 131 (14), 4680-4685 (2019).</li><li>Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+nanoparticle+design+for+overcoming+biological+barriers+to+drug+delivery.">Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery.</a> Nature Biotechnology. 33 (9), 941-951 (2015).</li><li>Tian, Y., Zhou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+cell-penetrating+peptides+and+their+functionalization+of+polymeric+nanoplatforms+for+drug+delivery.">Advances in cell-penetrating peptides and their functionalization of polymeric nanoplatforms for drug delivery.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (2), 1-12 (2021).</li><li>Milletti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides:+Classes,+origin,+and+current+landscape.">Cell-penetrating peptides: Classes, origin, and current landscape.</a> Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).</li><li>Turner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptide+conjugates+of+peptide+nucleic+acids+(PNA)+as+inhibitors+of+HIV-1+Tat-dependent+trans-activation+in+cells.">Cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids (PNA) as inhibitors of HIV-1 Tat-dependent trans-activation in cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (21), 6837-6849 (2005).</li><li>Tunnemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+analysis+of+cell+penetration+ability+and+toxicity+of+oligo-arginines.">Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines.</a> Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).</li><li>Shi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stapling+of+short+cell-penetrating+peptides+for+enhanced+tumor+cell-and-tissue+dual-penetration.">Stapling of short cell-penetrating peptides for enhanced tumor cell-and-tissue dual-penetration.</a> Chemical Communications. 58 (14), 2299-2302 (2022).</li><li>Komin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peptide+for+transcellular+cargo+delivery:+Structure-function+relationship+and+mechanism+of+action.">A peptide for transcellular cargo delivery: Structure-function relationship and mechanism of action.</a> Journal of Controlled Release. 324, 633-643 (2020).</li><li>Dietrich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+permeable+stapled+peptide+inhibitor+of+Wnt+signaling+that+targets+&#946;-catenin+protein-protein+interactions.">Cell permeable stapled peptide inhibitor of Wnt signaling that targets &#946;-catenin protein-protein interactions.</a> Cell Chemical Biology. 24 (8), 958-968 (2017).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stapling+of+unprotected+helical+peptides+via+photo-induced+intramolecular+thiol-yne+hydrothiolation.">Stapling of unprotected helical peptides via photo-induced intramolecular thiol-yne hydrothiolation.</a> Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).</li><li>De Araujo, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+&#945;-helicity+of+cyclic+pentapeptides+in+water.">Comparative &#945;-helicity of cyclic pentapeptides in water.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (27), 6965-6969 (2014).</li><li>Chu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+understanding+cell+penetration+by+stapled+peptides.">Towards understanding cell penetration by stapled peptides.</a> Medicinal Chemistry Communications. 6 (1), 111-119 (2015).</li><li>Bock, J. E., Gavenonis, J., Kritzer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+in+shape:+Controlling+peptide+bioactivity+and+bioavailability+using+conformational+constraints.">Getting in shape: Controlling peptide bioactivity and bioavailability using conformational constraints.</a> ACS Chemical Biology. 8 (3), 488-499 (2013).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+stapling+architecture+on+physiochemical+properties+and+cell+permeability+of+stapled+&#945;-helical+peptides:+A+comparative+study.">Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled &#945;-helical peptides: A comparative study.</a> ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).</li><li>White, C. J., Yudin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contemporary+strategies+for+peptide+macrocyclization.">Contemporary strategies for peptide macrocyclization.</a> Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).</li><li>Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+tumor+vasculature:+An+emerging+concept+in+antiangiogenic+therapy.">Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy.</a> Science. 307 (5706), 58-62 (2005).</li><li>Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+synthesis+of+short+&#945;-helices+stabilized+by+the+hydrogen+bond+surrogate+approach.">Solid-phase synthesis of short &#945;-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach.</a> Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).</li><li>Baek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+stapled+p53+peptide+bound+to+Mdm2.">Structure of the stapled p53 peptide bound to Mdm2.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (1), 103-106 (2012).</li><li>Traboulsi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrocyclic+cell+penetrating+peptides:+A+study+of+structure-penetration+properties.">Macrocyclic cell penetrating peptides: A study of structure-penetration properties.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (3), 405-411 (2015).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proline-derived+transannular+N-cap+for+nucleation+of+short+&#945;-helical+peptides.">A proline-derived transannular N-cap for nucleation of short &#945;-helical peptides.</a> Chemical Communications. 52 (59), 9275-9278 (2016).</li><li>Muppidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+proteolytically+stable,+cell-permeable+peptide-based+selective+Mcl-1+inhibitors.">Rational design of proteolytically stable, cell-permeable peptide-based selective Mcl-1 inhibitors.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (36), 14734-14737 (2012).</li><li>Wiradharma, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+cationic+amphiphilic+&#945;-helical+peptides+as+antimicrobial+agents.">Synthetic cationic amphiphilic &#945;-helical peptides as antimicrobial agents.</a> Biomaterials. 32 (8), 2204-2212 (2011).</li><li>Jones, A. T., Sayers, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+entry+of+cell+penetrating+peptides:+Tales+of+tails+wagging+dogs.">Cell entry of cell penetrating peptides: Tales of tails wagging dogs.</a> Journal of Controlled Release. 161 (2), 582-591 (2012).</li></ol>

Den kjemiske stabiliseringen av peptider ved å inkorporere konformasjonsbegrensninger har vist seg å være en effektiv strategi for å forbedre stabiliteten og cellepermeabiliteten til peptidet26. I denne protokollen er en trinnvis prosedyre beskrevet for syntese av sykliske CPP med aromatiske tverrbindinger og evaluering av deres permeabilitet over biologiske barrierer. Sammenlignet med de hydrofile laktam- eller triazol-tverrbindingene22,27, forbedrer inkorporeringen av...

De siste tiårene har vært vitne til raske fremskritt i utviklingen av cellepenetrerende peptider (CPP) for legemiddellevering. CPP har blitt mye brukt som molekylære transportører for behandling av en rekke livstruende sykdommer, inkludert nevrologiske lidelser1,2, hjertesykdommer3, diabetes4, dermatose5 og kreft 6,7. Kreft er fortsatt en global helsebyrde ledsaget av høy sykelighet og dødelighet til tross for omfattende forskningsinnsats8. En alvorlig hindring for behandling av kreft er terapeutikkens begrensede tilgang til dypere tumorceller på grunn av fysiologiske barrierer som kompakt ekstracellulær matrise (ECM), unormal tumorvaskulatur, flere membranbarrierer og høyt interstitielt væsketrykk (IFP)9. Utvikling av nye CPP-er med overlegen evne til å levere last på tvers av biologiske barrierer anses derfor som en viktig strategi for kreftbehandling10,11.
CPP kan kategoriseres i kationiske, amfipatiske og hydrofobe CPP når det gjelder deres fysisk-kjemiske egenskaper12. Blant disse er det positivt ladede HIV-TAT-peptidet og det syntetiske polyargininet av stor betydning i biomedisinsk forskning og har blitt grundig studert for å lette intracellulær legemiddellevering13. Tunnemann et al. rapporterte at en minimumslengde på åtte argininer er avgjørende for effektiv cellepenetrasjon av de syntetiske polyargininpeptidene, basert på en cellepermeabilitetsstudie utført ved bruk av R3 til R12-peptider14. Imidlertid har disse CPP-ene generelt korte halveringstider i plasma på grunn av deres raske hydrolyse in vivo. I tillegg er lite kjent om optimalisering av den kjemiske strukturen til CPP for å øke deres transbarriereevne, da det er utfordrende å trenge gjennom flere cellemembraner15. Dermed er utviklingen av nye molekylære transportører som er i stand til å trenge gjennom biologiske barrierer, sterkt ønsket for å forbedre legemiddelleveringseffektiviteten. I 2020 oppdaget Komin et al.16 et CPP kalt CL-peptid, som inneholder et helixmotiv (RLLRLLR) og en polyargininhale (R7) for å krysse epitelmonolaget. Et sett med CL-peptidvarianter ble også syntetisert ved å endre det spiralformede mønsteret. Denne utforskningen kan være en betydelig veiledning for utviklingen av nye CPP-er for levering av last over biologiske barrierer. Videre optimaliserte Dietrich et al. cellepermeabiliteten til StAX-peptidet, og hemmet Wnt / β-catenin-signalveien ved å øke den totale hydrofobisiteten til peptidene17.
Konformasjonsbegrensning av ustrukturerte lineære peptider ved syklisering er en effektiv måte å forbedre deres proteolytiske stabilitet og permeablitet18,19,20. Den strukturelle forsterkningen øker proteasemotstanden til sykliske peptider, noe som gjør dem mer stabile in vivo sammenlignet med deres lineære kolleger. I tillegg kan sykliseringen av peptider potensielt maskere den polare peptidryggraden ved å fremme intramolekylær hydrogenbinding, og dermed øke membranpermeabiliteten til peptidene21. I løpet av de siste to tiårene har kjemoselektive sykliseringsmetoder blitt effektive strategier for konstruksjon av sykliske peptider med forskjellige arkitekturer, som all-hydrokarbon, laktam, triazol, m-xylen, perfluoroaryl og andre tverrbindinger22,23. Den biologiske barrieren pålagt av det sofistikerte tumormikromiljøet kan redusere penetrasjonen av legemidler i faste svulster24. Vi har tidligere funnet at de sykliske CPP-ene viste overlegen motstand mot enzymatisk fordøyelse over sine lineære kolleger20. Videre er den totale hydrofobisiteten til peptidene kritisk for deres forbedrede cellepermeabilitet22. Basert på studiene diskutert ovenfor, kan kombinasjonen av et positivt ladet mønster, forhøyet total hydrofobicitet og forbedret proteolysestabilitet antas å øke permeabiliteten til CPP på tvers av biologiske barrierer. I en nylig studie identifiserte vi to sykliske CPP med aromatiske tverrbindinger i posisjon i og i + 7 som viser forbedret permeabilitet i tumorceller og vev sammenlignet med deres lineære kolleger15. Her presenteres en kortfattet syntetisk protokoll for syntese av fluorescerende merkede sykliske CPP og de viktigste trinnene for å undersøke deres permeabilitet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-ethanedithiol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>K1722093</td>
			<td>stench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU)</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>A-0443697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,4&#39;-bis(bromomethyl)biphenyl</td>
			<td>TCI</td>
			<td>B1921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>4T1 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 &#176;C humidified incubator containing 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile&#160;</td>
			<td>Adamas</td>
			<td>1484971</td>
			<td>toxicity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Energy</td>
			<td>W330229</td>
			<td>skin harmful</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>673811</td>
			<td>flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST038</td>
			<td>skin harmful</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrospray Ionization Mass Spectrometer</td>
			<td>Waters</td>
			<td>G2-S Tof</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CytoFLEX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate isomer (FITC)</td>
			<td>Energy</td>
			<td>E0801812500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axio Observer 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-Arg(Pbf)-OH</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>F-81070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>GLS201115-35202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-&#946;Ala-OH</td>
			<td>Adamas</td>
			<td>51341C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 &#176;C humidified incubator containing 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 1260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Poroshell EC-C18 120, 4.6 &#215; 150 mm (pore size 120 &#197;, particle size 4 &#956;m)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>SP Scientific</td>
			<td>Vir Tis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>9758</td>
			<td>toxicity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter plate</td>
			<td>Thermo &#956;drop plate</td>
			<td>N12391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpholine</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>M99040</td>
			<td>irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-technology microplate reader</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>VARIOSKAN LUX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>E-81416</td>
			<td>irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethyl formamide</td>
			<td>Energy</td>
			<td>B020051</td>
			<td>harmful to skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7321010</td>
			<td>polypropylene chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rink Amide MBHA resin (0.572 mmol/g)</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>GLS180301-49101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-way stopcocks</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7328107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate insert</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>14211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>T63278</td>
			<td>corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>T-0284475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7231</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of cyclic cell-penetrating peptides for enhanced penetration of biological barriers

Kreft har vært en stor utfordring i global helse. Imidlertid begrenser det komplekse tumormikromiljøet generelt terapiens tilgang til dypere tumorceller, noe som fører til tilbakefall av svulster. For å erobre den begrensede penetrasjonen av biologiske barrierer, har cellepenetrerende peptider (CPP) blitt oppdaget med utmerket membrantranslokasjonsevne og har dukket opp som nyttige molekylære transportører for å levere forskjellige laster inn i celler. Imidlertid viser konvensjonelle lineære CPP-er generelt kompromittert proteolytisk stabilitet, noe som begrenser permeabiliteten på tvers av biologiske barrierer. Dermed er utviklingen av nye molekylære transportører som kan trenge gjennom biologiske barrierer og utvise forbedret proteolytisk stabilitet sterkt ønsket for å fremme legemiddelleveringseffektivitet i biomedisinske applikasjoner. Vi har tidligere syntetisert et panel av korte sykliske CPP med aromatiske tverrbindinger, som viste overlegen permeabilitet i kreftceller og vev sammenlignet med deres lineære kolleger. Her er en kortfattet protokoll beskrevet for syntesen av det fluorescerende merkede sykliske polyarginin R8-peptidet og dets lineære motstykke, samt viktige trinn for å undersøke cellepermeabiliteten.

I denne protokollen ble en syntetisk prosedyre for å begrense den lineære polyarginin R8 i sin sykliske form presentert. SPPS ble utført manuelt med et enkelt apparatur (figur 1). Den detaljerte syntetiske prosessen med SPPS er vist i figur 2. Kort tid var harpiksen tilstrekkelig svulmet, etterfulgt av debeskyttelse av N α-Fmoc beskyttelsesgruppen. Deretter ble den N α-Fmoc-beskyttede aminosyren forankret på harpiksen til fullf?...

Watch this Scientific Journal Video about Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers at JoVE.com

Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers

Denne protokollen beskriver syntesen av sykliske cellepenetrerende peptider med aromatiske tverrbindinger og evalueringen av deres permeabilitet over biologiske barrierer.

Konstruksjon av sykliske cellepenetrerende peptider for økt penetrasjon av biologiske barrierer

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper ...

En alvorlig hindring for kreftbehandling er terapeutikkens begrensede tilgang til dypere tumorceller på grunn av fysiologiske barrierer. Dermed er utviklingen av nye molekylære transportører som er i stand til å behandle biologiske barrierer, sterkt ønsket for å forbedre effektiviteten av legemiddelleveransen. Formålet med denne prosedyren er å syntetisere de sykliske cellepenetrerende peptidene for forbedret celle-til-celle-penetrasjon.Fordelen med denne metoden er at peptidsykliseringen lett kan oppnås gjennom substitusjonsreaksjoner med cysteiner og harpiks uten å kreve metallkatalysatorer. Inkorporeringen av aromatiske tverrbindinger forbedrer peptidenes generelle hydrofobisitet sammenlignet med de hydrofile laktam- eller triazol-tverrbindingene, og forbedrer dermed permeabiliteten. For å begynne, monter det manuelle peptidsynteseapparatet i avtrekkshetten.Plasser treveis stoppekraner på vakuummanifolden og koble dem til nitrogen. Sørg for å sette lokk på de ubrukte innløpene. Fest en 10 milliliter polypropylenkolonne på treveis stoppekranene og tøm reaksjonsblandingen eller løsningsmidlene fra polypropylenkolonnen ved hjelp av en gummipipettepære eller et vakuum via en avfallsfelle.For å forberede harpiksen for peptidsyntese, tilsett 4 til 5 ml DMF til den nødvendige mengden harpiks og overfør den til polypropylenkolonnen med mild nitrogenboblende i 30 minutter for å svelle harpiksen tilstrekkelig. Tøm DMF og tilsett 4 til 5 ml 50% morfolin / DMF til harpiksen. Boble forsiktig nitrogen i 30 minutter for å fjerne den N-terminale Fmoc-gruppen, og tøm deretter blandingen.Vask harpiksen grundig tre ganger ved å tilsette 4 til 5 ml DMF til kolonnen og boble med nitrogen i minst 1 minutt hver gang. På samme måte vasker harpiksen med diklormetan tre ganger og DMF tre ganger. Oppløs deretter 648,8 milligram Fmoc og PBF-beskyttet arginin og 372,6 milligram HATU i 5 milliliter DMF i et sentrifugerør.Tilsett 348,4 mikroliter DIPEA for å aktivere koblingsreaksjonen, og overfør reaksjonsblandingen til polypropylenkolonnen med harpiks. Rør blandingen forsiktig med nitrogenboblende i 1 til 2 timer, og gjenta deretter koblingsreaksjonen en gang. Tøm reaksjonsblandingen og vask harpiksen sekvensielt med DMF, diklormetan og DMF igjen tre ganger hver i minst 1 minutt hver gang.Fjern den Fmoc-beskyttende gruppen og vask harpiksen etter prosedyren vist tidligere før du fortsetter å koble neste aminosyre. Deretter kobler du beta-alanin som et mellomrom for FITC-merking ved å bruke samme prosess som vist for aminosyrekobling, og tilsett deretter en blanding av FITC, DIPEA og DMF til polypropylenkolonnen i mørket for å utføre FITC-merking av peptider på harpiksen. Reaksjonen ville ta nesten 8 timer.For å utføre sykliseringen av det lineære peptidet, tilsett en blanding av trifluoreddiksyre, triisopropylsilan og diklormetan til polypropylenkolonnen i 2 minutter for selektivt å fjerne den tritylbeskyttende gruppen av cystein. Tøm blandingen og gjenta prosedyren til den gulaktige løsningen blir fargeløs for å fjerne tritylbeskyttelsesgruppen helt. Utfør sekvensiell vask av harpiksen med DMF og diklormetan minst tre ganger og oppløs 4, 4'bis-brometyl-bifenyl i DMF med DIPEA.Legg løsningen til kolonnen og reager i 4 timer. Vask harpiksen med 4 til 5 ml metanol to ganger i fem minutter hver, og tørk den med en kontinuerlig strøm av nitrogen. For peptider som inneholder cysteiner, behandle harpiksen med en effektiv spaltningscocktail av trifluoreddiksyre, triisopropylsilan og vann eller trifluoreddiksyre, triisopropylsilan, 1, 2-etanedithiol og vann.Behandle den peptidbundne harpiksen i 2 til 3 timer for å spalte peptidet, og fjern deretter trifluoreddiksyren forsiktig med en strøm av nitrogen. For å oppnå de rå peptidene, tilsett 4 til 5 ml dietyleter til det spaltede peptidpreparatet for å utfelle de rå peptidene, og sentrifuge ved 10.000 x g i 4 minutter. Kast supernatanten forsiktig og lufttørk peptidet i 3 minutter i en effektiv avtrekkshette.Oppløs småskala råpeptidet i 800 mikroliter acetonitril, og analyser det deretter ved hjelp av omvendt fase høyytelsesvæskekromatografi og væskekromatografi-massespektrometri. Inokuler 100.000 HeLa-celler i 2 ml DMEM i et 12-brønnkammer med en vevskulturplateinnsats, og inkuber i 24 timer i en 37 grader Celsius fuktet inkubator inneholdende 5% karbondioksid. Fjern mediet og inkuber cellene i kamrene med 1 milliliter 10 mikromolar FITC-R8 eller FITC-sR8-4 i FBS-fri DMEM i 1 time.Fjern deretter mediet som inneholder peptidene og vask cellene tre ganger med 1 milliliter PBS. Tilsett 1 milliliter fersk FBS-fri DMEM til kamrene, og inkuber deretter HeLa-cellene i kammeret med vevskulturplateinnsatsen, med HeLa-cellene på de runde dekslene nederst i 2 timer. Fest HeLa-cellene på de runde dekslene med 2,5% glutaraldehyd i 15 minutter, og flekk deretter cellene med DAPI i 15 minutter.Til slutt observerer du HeLa-cellene på dekslene under et fluorescensmikroskop. Et skjematisk diagram over syntesen av FITC-merket lineært R8-peptid og FITC-merket stiftet R8-peptid presenteres her. HPLC- og MS-spektrene til det lineære R8-peptidet og det stiftede R8-peptidet er vist i denne figuren.Retensjonstiden for det stiftede peptidet var vesentlig lengre enn for den lineære analogen, noe som indikerer en forbedret total hydrofobisitet av peptidet etter syklisering med den hydrofobe tverrbindingen. Dette grafiske bildet representerer stabiliteten til det lineære peptidet og det stiftede peptidet i nærvær av 25% FBS. Den sykliske R8 forblir 77,3% intakt etter inkubasjon med FBS i 4 timer, mens den lineære motparten for det meste ble degradert, noe som tyder på forbedret proteolytisk stabilitet av det sykliske R8-peptidet.Levende cellefluorescensmikroskopibilder av HeLa-celler og 4T1-celler etter 1 times inkubasjon med 3 mikromolar FITC-merket lineært R8-peptid og FITC-merket stiftet R8-peptid er vist her. Det kan sees at cellene behandlet med syklisk R8 med aromatisk tverrbinding viste høyere intracellulær fluorescens enn de som ble behandlet med deres lineære motstykke. Lignende resultater ble oppnådd med flowcytometrianalyse.For ytterligere å undersøke om syklisk R8 gir forbedret celle-til-celle-penetrasjon, ble transbrønnmodeller brukt til å simulere barrierepermeabiliteten til peptidene fra ett cellelag til et annet. Det sykliske R8 viste tydelig høyere transbarrierepenetrasjon enn det lineære R8-peptidet, som indikert ved en signifikant økning i intracellulær fluorescens. Fullstendig debeskyttelse av tritylgruppen av cystein og harpiks er viktig for følgende sykliseringstrinn.Dessuten avhenger sykliseringseffektiviteten også av de spesifikke sekvensene og lengdene av peptidene på grunn av steriske effekter. I et slikt tilfelle vil det være nyttig å bruke en harpiks med lavere lastekapasitet eller syklisering av peptidene under fortynnede konsentrasjoner i løsningsfasen. Disse sykliske peptidene viste en forbedret celle-til-celle-permeabilitet sammenlignet med deres lineære kolleger.Vi tror de holder stort løfte om å erobre biologiske barrierer og vil bli brukt til en molekylær for videre applikasjoner innen legemiddellevering.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Microwave-assisted Functionalization of Polyethylene glycol and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Mikrobølgeovn-assistert funksjon av Poly (etylenglykol) og On-resin Peptider for bruk i Chain polymerisasjoner og hydrogeldannelse

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Dannelse av Bestilte biomolekylære strukturer ved selvbygging av Short Peptider

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Preparation of Hydrophobic Metal-Organic Frameworks via Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition of Perfluoroalkanes for the Removal of Ammonia

Utarbeidelse av hydrofobe Metal-Organic Frameworks via Plasma Enhanced Chemical Vapor Nedfall av Perfluoroalkanes for fjerning av ammoniakk

Plasma enhanced chemical vapor deposition (PECVD) of perfluoroalkanes has long been studied for tuning the wetting properties of surfaces. For high ...

Preparation of Highly Porous Coordination Polymer Coatings on Macroporous Polymer Monoliths for Enhanced Enrichment of Phosphopeptides

Utarbeidelse av svært porøs Coordination Polymer Belegg på macroporous Polymer Monoliths for økt berikelse av fosforpeptidene

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous ...

A Filter-based Surface Enhanced Raman Spectroscopic Assay for Rapid Detection of Chemical Contaminants

En Filter-baserte Surface Enhanced Raman Spektroskopiske analyse for rask påvisning av kjemiske forurensninger

We demonstrate a method to fabricate highly sensitive surface-enhanced Raman spectroscopic (SERS) substrates using a filter syringe system that can be ...

Construction of Models for Nondestructive Prediction of Ingredient Contents in Blueberries by Near-infrared Spectroscopy Based on HPLC Measurements

Bygging av Modeller for destruktiv Prediksjon av bestanddeler Innhold i Blåbær av nær-infrarød spektroskopi Basert på HPLC Målinger

Nondestructive prediction of ingredient contents of farm products is useful to ship and sell the products with guaranteed qualities. Here, near-infrared ...

Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level

Syntese av Sykliske Polymers og karakterisering av deres diffusiv Motion i smeltet tilstand ved enkelt molekyl nivå

We demonstrate a method for the synthesis of cyclic polymers and a protocol for characterizing their diffusive motion in a melt state at the single ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Innsikt i de Samhandling av aminosyrer og peptider med uorganiske materialer Bruke Single-Molecule Force spektroskopi

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Observation and Analysis of Blinking Surface-enhanced Raman Scattering

Observasjon og analyse av blinkende overflaten forbedret Raman spredning

From a single molecule at a silver nanoaggregate junction, blinking surface-enhanced Raman scattering (SERS) is observed. Here, a protocol is presented on ...