Name: construction of cyclic cell-penetrating peptides for enhanced penetration of biological barriers
Uploaded: 2022-09-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers at JoVE.com

Este trabalho é apoiado pela Natural Science Foundation of China (21708031), China Postdoctoral Science Foundation (BX20180264, 2018M643519) e pelos Fundos de Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais (2682021ZTPY075).

1. Preparação do equipamento
OBS: Realizar todos os procedimentos em exaustor de operação com equipamentos de proteção individual adequados.
<ol><li>Montar o aparelho manual de síntese de peptídeos na capela de fumaça (Figura 1). Coloque as torneiras de três vias (ver Tabela de Materiais) no coletor de vácuo (ver Tabela de Materiais) e conecte-as ao nitrogênio (N2). Certifique-se de tampar...

<ol>
	<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-targeted+dual+site-selective+functionalized+poly(&#946;-amino+esters)+delivery+platform+for+nerve+regeneration.">Brain-targeted dual site-selective functionalized poly(&#946;-amino esters) delivery platform for nerve regeneration.</a> Nano Letters. 21 (7), 3007-3015 (2021).</li><li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+BBB+permeability+of+osmotically+active+poly(mannitol-co-PEI)+modified+with+rabies+virus+glycoprotein+via+selective+stimulation+of+caveolar+endocytosis+for+RNAi+therapeutics+in+Alzheimer's+disease.">Enhanced BBB permeability of osmotically active poly(mannitol-co-PEI) modified with rabies virus glycoprotein via selective stimulation of caveolar endocytosis for RNAi therapeutics in Alzheimer's disease.</a> Biomaterials. 38, 61-71 (2015).</li><li>Bian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cell-based+intercellular+delivery+of+transcription+factor+GATA4+on+ischemic+cardiomyopathy.">Effect of cell-based intercellular delivery of transcription factor GATA4 on ischemic cardiomyopathy.</a> Circulation Research. 100 (11), 1626-1633 (2007).</li><li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+low+molecular+weight+protamine+chemical+chimera+to+enhance+monomeric+insulin+intestinal+absorption.">The use of low molecular weight protamine chemical chimera to enhance monomeric insulin intestinal absorption.</a> Biomaterials. 34 (31), 7733-7743 (2013).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+STAT3-binding+peptide+exerts+antiproliferative+effects+and+antitumor+activity+by+inhibiting+STAT3+phosphorylation+and+signaling.">A specific STAT3-binding peptide exerts antiproliferative effects and antitumor activity by inhibiting STAT3 phosphorylation and signaling.</a> Cancer Research. 74 (8), 2144-2151 (2014).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEGylated+liposomes+with+NGR+ligand+and+heat-activable+cell-penetrating+peptide-doxorubicin+conjugate+for+tumor-specific+therapy.">PEGylated liposomes with NGR ligand and heat-activable cell-penetrating peptide-doxorubicin conjugate for tumor-specific therapy.</a> Biomaterials. 35 (14), 4368-4381 (2014).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+paclitaxel+delivery+facilitated+by+a+dual-functional+CPP+with+a+hydrophobic+hairpin+tail.">Intracellular paclitaxel delivery facilitated by a dual-functional CPP with a hydrophobic hairpin tail.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (4), 4853-4860 (2021).</li><li>Vasan, N., Baselga, J., Hyman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+on+drug+resistance+in+cancer.">A view on drug resistance in cancer.</a> Nature. 575 (7782), 299-309 (2019).</li><li>Cong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment-induced+in+situ+self-assembly+of+polymer-peptide+conjugates+that+attack+solid+tumors+deeply.">Microenvironment-induced in situ self-assembly of polymer-peptide conjugates that attack solid tumors deeply.</a> Angewandte Chemie International Edition. 131 (14), 4680-4685 (2019).</li><li>Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+nanoparticle+design+for+overcoming+biological+barriers+to+drug+delivery.">Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery.</a> Nature Biotechnology. 33 (9), 941-951 (2015).</li><li>Tian, Y., Zhou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+cell-penetrating+peptides+and+their+functionalization+of+polymeric+nanoplatforms+for+drug+delivery.">Advances in cell-penetrating peptides and their functionalization of polymeric nanoplatforms for drug delivery.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (2), 1-12 (2021).</li><li>Milletti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides:+Classes,+origin,+and+current+landscape.">Cell-penetrating peptides: Classes, origin, and current landscape.</a> Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).</li><li>Turner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptide+conjugates+of+peptide+nucleic+acids+(PNA)+as+inhibitors+of+HIV-1+Tat-dependent+trans-activation+in+cells.">Cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids (PNA) as inhibitors of HIV-1 Tat-dependent trans-activation in cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (21), 6837-6849 (2005).</li><li>Tunnemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+analysis+of+cell+penetration+ability+and+toxicity+of+oligo-arginines.">Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines.</a> Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).</li><li>Shi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stapling+of+short+cell-penetrating+peptides+for+enhanced+tumor+cell-and-tissue+dual-penetration.">Stapling of short cell-penetrating peptides for enhanced tumor cell-and-tissue dual-penetration.</a> Chemical Communications. 58 (14), 2299-2302 (2022).</li><li>Komin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peptide+for+transcellular+cargo+delivery:+Structure-function+relationship+and+mechanism+of+action.">A peptide for transcellular cargo delivery: Structure-function relationship and mechanism of action.</a> Journal of Controlled Release. 324, 633-643 (2020).</li><li>Dietrich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+permeable+stapled+peptide+inhibitor+of+Wnt+signaling+that+targets+&#946;-catenin+protein-protein+interactions.">Cell permeable stapled peptide inhibitor of Wnt signaling that targets &#946;-catenin protein-protein interactions.</a> Cell Chemical Biology. 24 (8), 958-968 (2017).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stapling+of+unprotected+helical+peptides+via+photo-induced+intramolecular+thiol-yne+hydrothiolation.">Stapling of unprotected helical peptides via photo-induced intramolecular thiol-yne hydrothiolation.</a> Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).</li><li>De Araujo, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+&#945;-helicity+of+cyclic+pentapeptides+in+water.">Comparative &#945;-helicity of cyclic pentapeptides in water.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (27), 6965-6969 (2014).</li><li>Chu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+understanding+cell+penetration+by+stapled+peptides.">Towards understanding cell penetration by stapled peptides.</a> Medicinal Chemistry Communications. 6 (1), 111-119 (2015).</li><li>Bock, J. E., Gavenonis, J., Kritzer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+in+shape:+Controlling+peptide+bioactivity+and+bioavailability+using+conformational+constraints.">Getting in shape: Controlling peptide bioactivity and bioavailability using conformational constraints.</a> ACS Chemical Biology. 8 (3), 488-499 (2013).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+stapling+architecture+on+physiochemical+properties+and+cell+permeability+of+stapled+&#945;-helical+peptides:+A+comparative+study.">Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled &#945;-helical peptides: A comparative study.</a> ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).</li><li>White, C. J., Yudin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contemporary+strategies+for+peptide+macrocyclization.">Contemporary strategies for peptide macrocyclization.</a> Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).</li><li>Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+tumor+vasculature:+An+emerging+concept+in+antiangiogenic+therapy.">Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy.</a> Science. 307 (5706), 58-62 (2005).</li><li>Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+synthesis+of+short+&#945;-helices+stabilized+by+the+hydrogen+bond+surrogate+approach.">Solid-phase synthesis of short &#945;-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach.</a> Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).</li><li>Baek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+stapled+p53+peptide+bound+to+Mdm2.">Structure of the stapled p53 peptide bound to Mdm2.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (1), 103-106 (2012).</li><li>Traboulsi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrocyclic+cell+penetrating+peptides:+A+study+of+structure-penetration+properties.">Macrocyclic cell penetrating peptides: A study of structure-penetration properties.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (3), 405-411 (2015).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proline-derived+transannular+N-cap+for+nucleation+of+short+&#945;-helical+peptides.">A proline-derived transannular N-cap for nucleation of short &#945;-helical peptides.</a> Chemical Communications. 52 (59), 9275-9278 (2016).</li><li>Muppidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+proteolytically+stable,+cell-permeable+peptide-based+selective+Mcl-1+inhibitors.">Rational design of proteolytically stable, cell-permeable peptide-based selective Mcl-1 inhibitors.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (36), 14734-14737 (2012).</li><li>Wiradharma, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+cationic+amphiphilic+&#945;-helical+peptides+as+antimicrobial+agents.">Synthetic cationic amphiphilic &#945;-helical peptides as antimicrobial agents.</a> Biomaterials. 32 (8), 2204-2212 (2011).</li><li>Jones, A. T., Sayers, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+entry+of+cell+penetrating+peptides:+Tales+of+tails+wagging+dogs.">Cell entry of cell penetrating peptides: Tales of tails wagging dogs.</a> Journal of Controlled Release. 161 (2), 582-591 (2012).</li></ol>

A estabilização química de peptídeos pela incorporação de restrições conformacionais tem se mostrado uma estratégia eficaz para melhorar a estabilidade e a permeabilidade celular do peptídeo26. Neste protocolo, um procedimento passo-a-passo é descrito para a síntese de CPPs cíclicas com ligações cruzadas aromáticas e a avaliação de sua permeabilidade através de barreiras biológicas. Comparada às ligações cruzadas hidrofílicas lactâmicas ou triazólicas22,27, a incorporaç?...

As últimas décadas testemunharam rápidos avanços no desenvolvimento de peptídeos penetrantes em células (CPPs) para liberação de fármacos. As PPCs têm sido amplamente utilizadas como transportadores moleculares para o tratamento de uma série de doenças potencialmente fatais, incluindo distúrbios neurológicos1,2, doenças cardíacas3, diabetes4, dermatoses5 e câncer 6,7. O câncer continua sendo um fardo de saúde global acompanhado por uma alta taxa de morbidade e mortalidade, apesar dos amplos esforços de pesquisa8. Um sério obstáculo ao tratamento do câncer é o acesso limitado da terapêutica a células tumorais mais profundas devido a barreiras fisiológicas, como matriz extracelular compacta (MEC), vasculatura tumoral anormal, múltiplas barreiras de membrana e alta pressão do fluido intersticial (IFP)9. Assim, o desenvolvimento de novas PPCs com capacidade superior de entregar cargas através de barreiras biológicas é considerado uma estratégia essencial para o tratamento do câncer10,11.
As PPCs podem ser classificadas em catiônicas, anfipáticas e hidrofóbicas em termos de suas propriedades físico-químicas12. Dentre estes, o peptídeo HIV-TAT carregado positivamente e a poliarginina sintética são de considerável importância na pesquisa biomédica e têm sido extensivamente estudados para facilitar a liberação intracelular de fármacos13. Tunnemann e col. relataram que um comprimento mínimo de oito argininas é essencial para a penetração celular eficiente dos peptídeos sintéticos de poliarginina, com base em um estudo de permeabilidade celular realizado usando peptídeos R3 aR12 14. No entanto, essas PPCs geralmente têm meias-vidas plasmáticas curtas devido à sua rápida hidrólise in vivo. Além disso, pouco se sabe sobre a otimização da estrutura química das PPCs para aumentar sua capacidade de transbarreira, uma vez que é um desafio penetrar em múltiplas membranas celulares15. Assim, o desenvolvimento de novos transportadores moleculares capazes de penetrar barreiras biológicas é fortemente desejado para aumentar a eficiência da liberação de fármacos. Em 2020, Komin et al.16 descobriram um CPP chamado peptídeo CL, que contém um motivo de hélice (RLLRLLR) e uma cauda de poliarginina (R7) para cruzar a monocamada epitelial. Um conjunto de variantes peptídicas CL também foram sintetizadas alterando o padrão helicoidal. Esta exploração pode ser um guia significativo para o desenvolvimento de novos CPPs para a entrega de cargas através de barreiras biológicas. Além disso, Dietrich e col. otimizaram a permeabilidade celular do peptídeo StAX, inibindo a via de sinalização Wnt/β-catenina por aumentar a hidrofobicidade global dos peptídeos17.
A restrição conformacional de peptídeos lineares não estruturados por ciclização é uma maneira eficaz de aumentar sua estabilidade proteolítica e permeablidade18,19,20. O reforço estrutural aumenta a resistência às proteases dos peptídeos cíclicos, tornando-os mais estáveis in vivo em comparação com seus equivalentes lineares. Além disso, a ciclização de peptídeos pode potencialmente mascarar a espinha dorsal do peptídeo polar por promover a ligação intramolecular de hidrogênio, aumentando assim a permeabilidade da membrana dos peptídeos21. Nas últimas duas décadas, métodos quimiosseletivos de ciclização tornaram-se estratégias eficazes para a construção de peptídeos cíclicos com diferentes arquiteturas, como hidrocarbonetos, lactâmicos, triazóis, m-xileno, perfluoroaril e outras ligações cruzadas22,23. A barreira biológica imposta pelo sofisticado microambiente tumoral poderia reduzir a penetração de fármacos em tumoressólidos24. Verificamos anteriormente que as PPCs cíclicas apresentaram resistência superior à digestão enzimática em relação às suas contrapartes lineares20. Além disso, a hidrofobicidade global dos peptídeos é crítica para sua maior permeabilidade celular22. Com base nos estudos discutidos acima, a combinação de um padrão carregado positivamente, hidrofobicidade global elevada e maior estabilidade da proteólise pode ser hipotetizada para aumentar a permeabilidade das PPCs através de barreiras biológicas. Em um estudo recente, identificamos duas CPPs cíclicas com ligações cruzadas aromáticas nas posições i e i+7 que exibem melhor permeabilidade em células e tecidos tumorais em comparação com suas contrapartes lineares15. Aqui, um protocolo sintético conciso para a síntese de CPPs cíclicas marcadas fluorescentemente e os principais passos para investigar sua permeabilidade são apresentados.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-ethanedithiol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>K1722093</td>
			<td>stench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU)</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>A-0443697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,4&#39;-bis(bromomethyl)biphenyl</td>
			<td>TCI</td>
			<td>B1921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>4T1 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 &#176;C humidified incubator containing 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile&#160;</td>
			<td>Adamas</td>
			<td>1484971</td>
			<td>toxicity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Energy</td>
			<td>W330229</td>
			<td>skin harmful</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>673811</td>
			<td>flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST038</td>
			<td>skin harmful</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrospray Ionization Mass Spectrometer</td>
			<td>Waters</td>
			<td>G2-S Tof</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CytoFLEX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate isomer (FITC)</td>
			<td>Energy</td>
			<td>E0801812500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axio Observer 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-Arg(Pbf)-OH</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>F-81070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>GLS201115-35202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-&#946;Ala-OH</td>
			<td>Adamas</td>
			<td>51341C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 &#176;C humidified incubator containing 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 1260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Poroshell EC-C18 120, 4.6 &#215; 150 mm (pore size 120 &#197;, particle size 4 &#956;m)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>SP Scientific</td>
			<td>Vir Tis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>9758</td>
			<td>toxicity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter plate</td>
			<td>Thermo &#956;drop plate</td>
			<td>N12391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpholine</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>M99040</td>
			<td>irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-technology microplate reader</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>VARIOSKAN LUX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>E-81416</td>
			<td>irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethyl formamide</td>
			<td>Energy</td>
			<td>B020051</td>
			<td>harmful to skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7321010</td>
			<td>polypropylene chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rink Amide MBHA resin (0.572 mmol/g)</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>GLS180301-49101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-way stopcocks</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7328107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate insert</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>14211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>T63278</td>
			<td>corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>T-0284475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7231</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of cyclic cell-penetrating peptides for enhanced penetration of biological barriers

O câncer tem sido um grande desafio na saúde global. No entanto, o complexo microambiente tumoral geralmente limita o acesso da terapêutica a células tumorais mais profundas, levando à recorrência tumoral. Para vencer a penetração limitada de barreiras biológicas, peptídeos penetrantes de células (CPPs) foram descobertos com excelente capacidade de translocação de membrana e emergiram como transportadores moleculares úteis para entregar várias cargas nas células. No entanto, as PPCs lineares convencionais geralmente apresentam estabilidade proteolítica comprometida, o que limita sua permeabilidade através de barreiras biológicas. Assim, o desenvolvimento de novos transportadores moleculares que possam penetrar em barreiras biológicas e exibir maior estabilidade proteolítica é altamente desejado para promover a eficiência na liberação de fármacos em aplicações biomédicas. Nós sintetizamos previamente um painel de CPPs cíclicos curtos com ligações cruzadas aromáticas, que exibiram permeabilidade superior em células e tecidos cancerosos em comparação com seus homólogos lineares. Aqui, um protocolo conciso é descrito para a síntese do peptídeo R8 cíclico de poliarginina fluorescentemente marcado e sua contraparte linear, bem como os principais passos para investigar sua permeabilidade celular.

Neste protocolo, um procedimento sintético para restringir a poliarginina linear R8 em sua forma cíclica foi apresentado. A SPPS foi realizada manualmente, utilizando-se aparelho simples (Figura 1). O processo sintético detalhado da SPPS é mostrado na Figura 2. Resumidamente, a resina estava suficientemente inchada, seguida pela desproteção do grupo protetor N α-Fmoc. Em seguida, o aminoácido N α-Fmoc protegido foi ancorado n...

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Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers

Este protocolo descreve a síntese de peptídeos cíclicos penetrantes em células com ligações cruzadas aromáticas e a avaliação de sua permeabilidade através de barreiras biológicas.

Construção de Peptídeos Cíclicos Penetrantes em Células para Maior Penetração de Barreiras Biológicas

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper ...

Um sério obstáculo para o tratamento do câncer é o acesso limitado da terapêutica a células tumorais mais profundas devido a barreiras fisiológicas. Assim, o desenvolvimento de novos transportadores moleculares capazes de tratar barreiras biológicas é fortemente desejado para aumentar a eficiência da liberação de fármacos. O objetivo deste procedimento é sintetizar os peptídeos cíclicos penetrantes em células para maior penetração célula-a-célula.A vantagem deste método é que a ciclização peptídica pode ser facilmente conseguida através de reações de substituição por cisteínas e resina sem a necessidade de catalisadores metálicos. A incorporação de ligações cruzadas aromáticas melhora a hidrofobicidade global dos peptídeos em comparação com as ligações cruzadas hidrofílicas lactâmicas ou triazólicas, aumentando assim sua permeabilidade. Para começar, monte o aparelho manual de síntese de peptídeos no exaustor.Coloque as torneiras de três vias no coletor de vácuo e conecte-as ao nitrogênio. Certifique-se de tampar as entradas não utilizadas. Fixe uma coluna de polipropileno de 10 mililitros nas torneiras de três vias e escorra a mistura de reacção ou solventes da coluna de polipropileno utilizando um bulbo de pipeta de borracha ou um vácuo através de uma armadilha de resíduos.Para preparar a resina para síntese peptídica, adicione 4 a 5 mililitros de DMF à quantidade necessária de resina e transfira-a para a coluna de polipropileno com borbulhamento suave de nitrogênio por 30 minutos para inchar a resina adequadamente. Escorra o CPO e adicione 4 a 5 mililitros de 50% de morfolina/DMF à resina. Borbulhar suavemente o azoto durante 30 minutos para remover o grupo Fmoc N-terminal e, em seguida, escorra a mistura.Lave bem a resina três vezes, adicionando 4 a 5 mililitros de DMF à coluna e borbulhando com nitrogênio por pelo menos 1 minuto de cada vez. Da mesma forma, lavar a resina com diclorometano três vezes e DMF três vezes. Em seguida, dissolva 648,8 miligramas de arginina protegida por Fmoc e PBF e 372,6 miligramas de HATU em 5 mililitros de DMF em um tubo de centrífuga.Adicionar 348,4 microlitros de DIPEA para ativar a reação de acoplamento e transferir a mistura de reação para a coluna de polipropileno com resina. Agite suavemente a mistura com borbulhamento de nitrogênio por 1 a 2 horas e, em seguida, repita a reação de acoplamento uma vez. Escorra a mistura de reação e lave a resina sequencialmente com DMF, diclorometano e novamente DMF três vezes cada por pelo menos 1 minuto cada vez.Remova o grupo protetor Fmoc e lave a resina seguindo o procedimento mostrado anteriormente antes de proceder ao acoplamento do próximo aminoácido. Em seguida, acople a beta-alanina como um espaçador para marcação de FITC usando o mesmo processo mostrado para acoplamento de aminoácidos e, em seguida, adicione uma mistura de FITC, DIPEA e DMF à coluna de polipropileno no escuro para realizar a marcação FITC de peptídeos na resina. A reação levaria quase 8 horas.Para realizar a ciclização do peptídeo linear, adicione uma mistura de ácido trifluoroacético, triisopropilsilano e diclorometano à coluna de polipropileno por 2 minutos para remover seletivamente o grupo tritilprotetor da cisteína. Escorra a mistura e repita o procedimento até que a solução amarelada se torne incolor para remover completamente o grupo protetor de tritil. Realizar lavagens sequenciais da resina com DMF e diclorometano pelo menos três vezes e dissolver 4,4'bis-bromometil-bifenil em DMF com DIPEA.Adicione a solução à coluna e reaja durante 4 horas. Lave a resina com 4 a 5 mililitros de metanol duas vezes por cinco minutos cada, e seque-a com um fluxo contínuo de nitrogênio. Para peptídeos contendo cisteínas, tratar a resina com um coquetel de clivagem eficaz de ácido trifluoroacético, triisopropilsilano e água ou ácido trifluoroacético, triisopropilsilano, 1, 2-etanedithiol e água.Trate a resina ligada ao peptídeo por 2 a 3 horas para clivar o peptídeo e, em seguida, remova o ácido trifluoroacético cuidadosamente com uma corrente de nitrogênio. Para obter os peptídeos brutos, adicione 4 a 5 mililitros de éter dietílico à preparação peptídica clivada para precipitar os peptídeos brutos e centrifugar a 10.000 x g por 4 minutos. Descarte cuidadosamente o sobrenadante e seque o peptídeo ao ar por 3 minutos em uma exaustora eficaz.Dissolva o peptídeo bruto em pequena escala em 800 microlitros de acetonitrila e, em seguida, analise-o usando cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa e cromatografia líquida-espectrometria de massas. Inocular 100.000 células HeLa em 2 mililitros de DMEM em uma câmara de 12 poços com uma inserção de placa de cultura de tecido e incubar por 24 horas em uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius contendo 5% de dióxido de carbono. Remover o meio e incubar as células nas câmaras com 1 mililitro de 10 micromolares FITC-R8 ou FITC-sR8-4 em DMEM livre de FBS por 1 hora.Depois disso, remova o meio que contém os peptídeos e lave as células três vezes com 1 mililitro de PBS. Adicione 1 mililitro de DMEM fresco livre de FBS às câmaras e, em seguida, co-incube as células HeLa na câmara com a inserção da placa de cultura de tecido, com as células HeLa nas lamínulas redondas na parte inferior por 2 horas. Fixar as células HeLa nas lamínulas redondas com glutaraldeído a 2,5% durante 15 minutos e, em seguida, corar as células com DAPI durante 15 minutos.Finalmente, observe as células HeLa nas lamínulas sob um microscópio de fluorescência. Um diagrama esquemático da síntese do peptídeo R8 linear marcado com FITC e do peptídeo R8 grampeado marcado com FITC é apresentado aqui. Os espectros de HPLC e MS do peptídeo linear R8 e do peptídeo R8 grampeado são mostrados nesta figura.O tempo de retenção do peptídeo grampeado foi substancialmente maior do que o do análogo linear, indicando uma maior hidrofobicidade global do peptídeo após a ciclização com a reticulação hidrofóbica. Esta imagem gráfica representa a estabilidade do peptídeo linear e do peptídeo grampeado na presença de 25% FBS. O R8 cíclico permanece 77,3% intacto após incubação com FBS por 4 horas, enquanto sua contraparte linear foi degradada em sua maioria, sugerindo maior estabilidade proteolítica do peptídeo R8 cíclico.Imagens de microscopia de fluorescência de células vivas de células HeLa e células 4T1 após 1 hora de incubação com 3 peptídeo R8 linear marcado com FITC e peptídeo R8 grampeado marcado com FITC são mostradas aqui. Pode-se observar que as células tratadas com R8 cíclico com reticulação aromática exibiram maior fluorescência intracelular do que aquelas tratadas com sua contraparte linear. Resultados semelhantes foram obtidos com a análise por citometria de fluxo.Para investigar melhor se o R8 cíclico confere maior penetração célula-a-célula, modelos transwell foram usados para simular a permeabilidade de barreira dos peptídeos de uma camada celular para outra. O R8 cíclico exibiu claramente maior penetração de transbarreira do que o peptídeo linear R8, como indicado por um aumento significativo na fluorescência intracelular. A desproteção completa do grupo tritilo cisteína e resina é importante para a etapa seguinte de ciclização.Além disso, a eficiência da ciclização também depende das sequências específicas e dos comprimentos dos peptídeos devido aos efeitos estéricos. Nesse caso, o uso de uma resina com menor capacidade de carga ou ciclização dos peptídeos sob concentrações diluídas em fase de solução seria útil. Esses peptídeos cíclicos mostraram uma permeabilidade célula-célula aumentada em comparação com suas contrapartes lineares.Acreditamos que eles são uma grande promessa para vencer barreiras biológicas e serão usados para uma base molecular para futuras aplicações no campo da liberação de fármacos.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Microwave-assisted Functionalization of Polyethylene glycol and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

A funcionalização assistida por microondas, de poli (etileno glicol) e Peptídeos On-resina para uso em Polimerizações cadeia e formação de hidrogel

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large ...

Química

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Formação de Estruturas Biomoleculares Ordenadas pela Automontagem de Peptídeos Pequenos

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Preparation of Hydrophobic Metal-Organic Frameworks via Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition of Perfluoroalkanes for the Removal of Ammonia

Preparação de hidrofóbicos Metal-Organic Frameworks via Plasma aprimorado Chemical Vapor Deposition de perfluoroalcanos para a remoção de amônia

Plasma enhanced chemical vapor deposition (PECVD) of perfluoroalkanes has long been studied for tuning the wetting properties of surfaces. For high ...

Preparation of Highly Porous Coordination Polymer Coatings on Macroporous Polymer Monoliths for Enhanced Enrichment of Phosphopeptides

Preparação de altamente poroso Coordenação Polymer Revestimentos em macroporosas Polymer Monólitos para o enriquecimento avançado de Fosfopeptídeos

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous ...

A Filter-based Surface Enhanced Raman Spectroscopic Assay for Rapid Detection of Chemical Contaminants

A superfície à base de filtro avançado Raman espectroscópica Ensaio para a rápida detecção de contaminantes químicos

We demonstrate a method to fabricate highly sensitive surface-enhanced Raman spectroscopic (SERS) substrates using a filter syringe system that can be ...

Construction of Models for Nondestructive Prediction of Ingredient Contents in Blueberries by Near-infrared Spectroscopy Based on HPLC Measurements

Construção de Modelos de Previsão Nondestructive de Conteúdos ingrediente em mirtilos por espectroscopia no infravermelho próximo com base em medições de HPLC

Nondestructive prediction of ingredient contents of farm products is useful to ship and sell the products with guaranteed qualities. Here, near-infrared ...

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Síntese de polímeros cíclicos e Caracterização do seu movimento difusivo no estado fundido na molécula de nível único

We demonstrate a method for the synthesis of cyclic polymers and a protocol for characterizing their diffusive motion in a melt state at the single ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Insights sobre as interações de aminoácidos e peptídeos com Materiais Inorgânicos Usando Single-Molecule Força Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Observation and Analysis of Blinking Surface-enhanced Raman Scattering

Observação e Análise da Espalhamento Raman Aprimorado por Superfície do Piscar de Olhos.

From a single molecule at a silver nanoaggregate junction, blinking surface-enhanced Raman scattering (SERS) is observed. Here, a protocol is presented on ...