Name: construction of cyclic cell-penetrating peptides for enhanced penetration of biological barriers
Uploaded: 2022-09-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers at JoVE.com

Эта работа поддерживается Фондом естественных наук Китая (21708031), Китайским фондом постдокторантуры (BX20180264, 2018M643519) и Фондами фундаментальных исследований центральных университетов (2682021ZTPY075).

1. Подготовка оборудования
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все процедуры в рабочем вытяжном шкафу с подходящими средствами индивидуальной защиты.
<ol><li>Соберите ручной аппарат синтеза пептидов в вытяжном шкафу (рис. 1). Установите трехходовые запорные кр?...

<ol>
	<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-targeted+dual+site-selective+functionalized+poly(&#946;-amino+esters)+delivery+platform+for+nerve+regeneration.">Brain-targeted dual site-selective functionalized poly(&#946;-amino esters) delivery platform for nerve regeneration.</a> Nano Letters. 21 (7), 3007-3015 (2021).</li><li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+BBB+permeability+of+osmotically+active+poly(mannitol-co-PEI)+modified+with+rabies+virus+glycoprotein+via+selective+stimulation+of+caveolar+endocytosis+for+RNAi+therapeutics+in+Alzheimer's+disease.">Enhanced BBB permeability of osmotically active poly(mannitol-co-PEI) modified with rabies virus glycoprotein via selective stimulation of caveolar endocytosis for RNAi therapeutics in Alzheimer's disease.</a> Biomaterials. 38, 61-71 (2015).</li><li>Bian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cell-based+intercellular+delivery+of+transcription+factor+GATA4+on+ischemic+cardiomyopathy.">Effect of cell-based intercellular delivery of transcription factor GATA4 on ischemic cardiomyopathy.</a> Circulation Research. 100 (11), 1626-1633 (2007).</li><li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+low+molecular+weight+protamine+chemical+chimera+to+enhance+monomeric+insulin+intestinal+absorption.">The use of low molecular weight protamine chemical chimera to enhance monomeric insulin intestinal absorption.</a> Biomaterials. 34 (31), 7733-7743 (2013).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+STAT3-binding+peptide+exerts+antiproliferative+effects+and+antitumor+activity+by+inhibiting+STAT3+phosphorylation+and+signaling.">A specific STAT3-binding peptide exerts antiproliferative effects and antitumor activity by inhibiting STAT3 phosphorylation and signaling.</a> Cancer Research. 74 (8), 2144-2151 (2014).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEGylated+liposomes+with+NGR+ligand+and+heat-activable+cell-penetrating+peptide-doxorubicin+conjugate+for+tumor-specific+therapy.">PEGylated liposomes with NGR ligand and heat-activable cell-penetrating peptide-doxorubicin conjugate for tumor-specific therapy.</a> Biomaterials. 35 (14), 4368-4381 (2014).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+paclitaxel+delivery+facilitated+by+a+dual-functional+CPP+with+a+hydrophobic+hairpin+tail.">Intracellular paclitaxel delivery facilitated by a dual-functional CPP with a hydrophobic hairpin tail.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (4), 4853-4860 (2021).</li><li>Vasan, N., Baselga, J., Hyman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+on+drug+resistance+in+cancer.">A view on drug resistance in cancer.</a> Nature. 575 (7782), 299-309 (2019).</li><li>Cong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment-induced+in+situ+self-assembly+of+polymer-peptide+conjugates+that+attack+solid+tumors+deeply.">Microenvironment-induced in situ self-assembly of polymer-peptide conjugates that attack solid tumors deeply.</a> Angewandte Chemie International Edition. 131 (14), 4680-4685 (2019).</li><li>Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+nanoparticle+design+for+overcoming+biological+barriers+to+drug+delivery.">Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery.</a> Nature Biotechnology. 33 (9), 941-951 (2015).</li><li>Tian, Y., Zhou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+cell-penetrating+peptides+and+their+functionalization+of+polymeric+nanoplatforms+for+drug+delivery.">Advances in cell-penetrating peptides and their functionalization of polymeric nanoplatforms for drug delivery.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (2), 1-12 (2021).</li><li>Milletti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides:+Classes,+origin,+and+current+landscape.">Cell-penetrating peptides: Classes, origin, and current landscape.</a> Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).</li><li>Turner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptide+conjugates+of+peptide+nucleic+acids+(PNA)+as+inhibitors+of+HIV-1+Tat-dependent+trans-activation+in+cells.">Cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids (PNA) as inhibitors of HIV-1 Tat-dependent trans-activation in cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (21), 6837-6849 (2005).</li><li>Tunnemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+analysis+of+cell+penetration+ability+and+toxicity+of+oligo-arginines.">Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines.</a> Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).</li><li>Shi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stapling+of+short+cell-penetrating+peptides+for+enhanced+tumor+cell-and-tissue+dual-penetration.">Stapling of short cell-penetrating peptides for enhanced tumor cell-and-tissue dual-penetration.</a> Chemical Communications. 58 (14), 2299-2302 (2022).</li><li>Komin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peptide+for+transcellular+cargo+delivery:+Structure-function+relationship+and+mechanism+of+action.">A peptide for transcellular cargo delivery: Structure-function relationship and mechanism of action.</a> Journal of Controlled Release. 324, 633-643 (2020).</li><li>Dietrich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+permeable+stapled+peptide+inhibitor+of+Wnt+signaling+that+targets+&#946;-catenin+protein-protein+interactions.">Cell permeable stapled peptide inhibitor of Wnt signaling that targets &#946;-catenin protein-protein interactions.</a> Cell Chemical Biology. 24 (8), 958-968 (2017).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stapling+of+unprotected+helical+peptides+via+photo-induced+intramolecular+thiol-yne+hydrothiolation.">Stapling of unprotected helical peptides via photo-induced intramolecular thiol-yne hydrothiolation.</a> Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).</li><li>De Araujo, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+&#945;-helicity+of+cyclic+pentapeptides+in+water.">Comparative &#945;-helicity of cyclic pentapeptides in water.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (27), 6965-6969 (2014).</li><li>Chu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+understanding+cell+penetration+by+stapled+peptides.">Towards understanding cell penetration by stapled peptides.</a> Medicinal Chemistry Communications. 6 (1), 111-119 (2015).</li><li>Bock, J. E., Gavenonis, J., Kritzer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+in+shape:+Controlling+peptide+bioactivity+and+bioavailability+using+conformational+constraints.">Getting in shape: Controlling peptide bioactivity and bioavailability using conformational constraints.</a> ACS Chemical Biology. 8 (3), 488-499 (2013).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+stapling+architecture+on+physiochemical+properties+and+cell+permeability+of+stapled+&#945;-helical+peptides:+A+comparative+study.">Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled &#945;-helical peptides: A comparative study.</a> ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).</li><li>White, C. J., Yudin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contemporary+strategies+for+peptide+macrocyclization.">Contemporary strategies for peptide macrocyclization.</a> Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).</li><li>Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+tumor+vasculature:+An+emerging+concept+in+antiangiogenic+therapy.">Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy.</a> Science. 307 (5706), 58-62 (2005).</li><li>Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+synthesis+of+short+&#945;-helices+stabilized+by+the+hydrogen+bond+surrogate+approach.">Solid-phase synthesis of short &#945;-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach.</a> Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).</li><li>Baek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+stapled+p53+peptide+bound+to+Mdm2.">Structure of the stapled p53 peptide bound to Mdm2.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (1), 103-106 (2012).</li><li>Traboulsi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrocyclic+cell+penetrating+peptides:+A+study+of+structure-penetration+properties.">Macrocyclic cell penetrating peptides: A study of structure-penetration properties.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (3), 405-411 (2015).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proline-derived+transannular+N-cap+for+nucleation+of+short+&#945;-helical+peptides.">A proline-derived transannular N-cap for nucleation of short &#945;-helical peptides.</a> Chemical Communications. 52 (59), 9275-9278 (2016).</li><li>Muppidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+proteolytically+stable,+cell-permeable+peptide-based+selective+Mcl-1+inhibitors.">Rational design of proteolytically stable, cell-permeable peptide-based selective Mcl-1 inhibitors.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (36), 14734-14737 (2012).</li><li>Wiradharma, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+cationic+amphiphilic+&#945;-helical+peptides+as+antimicrobial+agents.">Synthetic cationic amphiphilic &#945;-helical peptides as antimicrobial agents.</a> Biomaterials. 32 (8), 2204-2212 (2011).</li><li>Jones, A. T., Sayers, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+entry+of+cell+penetrating+peptides:+Tales+of+tails+wagging+dogs.">Cell entry of cell penetrating peptides: Tales of tails wagging dogs.</a> Journal of Controlled Release. 161 (2), 582-591 (2012).</li></ol>

Химическая стабилизация пептидов путем включения конформационных ограничений оказалась эффективной стратегией повышения стабильности и клеточной проницаемости пептида26. В этом протоколе описана поэтапная процедура синтеза циклических СРР с ароматическими поперечным...

За последние несколько десятилетий мы стали свидетелями быстрого прогресса в разработке пептидов, проникающих в клетки (СХТ) для доставки лекарств. СРТ широко используются в качестве молекулярных транспортеров для лечения ряда опасных для жизни заболеваний, включая неврологические расстройства1,2, болезни сердца3, диабет4, дерматоз5 и рак 6,7. Рак остается глобальным бременем здравоохранения, сопровождающимся высоким уровнем заболеваемости и смертности, несмотря на широкомасштабные исследовательские усилия8. Серьезным препятствием для лечения рака является ограниченный доступ терапевтических средств к более глубоким опухолевым клеткам из-за физиологических барьеров, таких как компактный внеклеточный матрикс (ECM), аномальная сосудистая сеть опухоли, множественные мембранные барьеры и высокое давление интерстициальной жидкости (IFP)9. Таким образом, разработка новых СРР с превосходной способностью доставлять грузы через биологические барьеры считается важной стратегией лечения рака10,11.
СРР можно разделить на катионные, амфипатические и гидрофобные СРР с точки зрения их физико-химических свойств12. Среди них положительно заряженный пептид ВИЧ-ТАТ и синтетический полиаргинин имеют большое значение в биомедицинских исследованиях и были тщательно изучены для облегчения внутриклеточной доставки лекарств13. Tunnemann et al. сообщили, что минимальная длина в восемь аргининов имеет важное значение для эффективного проникновения в клетки синтетических пептидов полиаргинина, основываясь на исследовании проницаемости клеток, проведенном с использованием пептидов от R3 до R1214. Однако эти CPP обычно имеют короткие периоды полураспада в плазме из-за их быстрого гидролиза in vivo. Кроме того, мало что известно об оптимизации химической структуры СРР для повышения их трансбарьерной способности, поскольку проникновение через несколько клеточных мембранзатруднено 15. Таким образом, разработка новых молекулярных транспортеров, способных проникать через биологические барьеры, крайне желательна для повышения эффективности доставки лекарств. В 2020 году Komin et al.16 обнаружили CPP, называемый пептидом CL, который содержит мотив спирали (RLLRLLR) и полиаргининовый хвост (R7) для пересечения эпителиального монослоя. Набор вариантов пептидов CL также был синтезирован путем изменения спирального рисунка. Это исследование может стать важным руководством для разработки новых CPP для доставки грузов через биологические барьеры. Кроме того, Dietrich et al. оптимизировали клеточную проницаемость пептида StAX, ингибируя сигнальный путь Wnt/β-катенина за счет увеличения общей гидрофобности пептидов17.
Конформационная рестрикция неструктурированных линейных пептидов циклизацией является эффективным способом повышения их протеолитической стабильности и проницаемости18,19,20. Структурное армирование повышает резистентность циклических пептидов к протеазе, делая их более стабильными in vivo по сравнению с их линейными аналогами. Кроме того, циклизация пептидов потенциально может маскировать полярную пептидную основу, способствуя внутримолекулярному образованию водородных связей, тем самым увеличивая мембранную проницаемость пептидов21. В последние два десятилетия хемослективные методы циклизации стали эффективными стратегиями построения циклических пептидов с различной архитектурой, таких как полностью углеводородные, лактамные, триазольные, м-ксилол, перфторарил и другие поперечные связи22,23. Биологический барьер, налагаемый сложным микроокружением опухоли, может снижать проникновение лекарств в солидные опухоли24. Ранее мы обнаружили, что циклические CPP проявляют превосходную устойчивость к ферментативному расщеплению по сравнению с их линейными аналогами20. Кроме того, общая гидрофобность пептидов имеет решающее значение для их повышенной проницаемостидля клеток 22. Основываясь на исследованиях, рассмотренных выше, можно предположить, что сочетание положительно заряженного паттерна, повышенной общей гидрофобности и повышенной стабильности протеолиза увеличивает проницаемость CPP через биологические барьеры. В недавнем исследовании мы идентифицировали два циклических CPP с ароматическими сшивками в положениях i и i + 7, которые демонстрируют улучшенную проницаемость в опухолевых клетках и тканях по сравнению с их линейными аналогами15. Здесь представлен краткий синтетический протокол синтеза флуоресцентно меченных циклических СРР и ключевые шаги по исследованию их проницаемости.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-ethanedithiol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>K1722093</td>
			<td>stench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU)</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>A-0443697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,4&#39;-bis(bromomethyl)biphenyl</td>
			<td>TCI</td>
			<td>B1921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>4T1 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 &#176;C humidified incubator containing 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile&#160;</td>
			<td>Adamas</td>
			<td>1484971</td>
			<td>toxicity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Energy</td>
			<td>W330229</td>
			<td>skin harmful</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>673811</td>
			<td>flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST038</td>
			<td>skin harmful</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrospray Ionization Mass Spectrometer</td>
			<td>Waters</td>
			<td>G2-S Tof</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CytoFLEX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate isomer (FITC)</td>
			<td>Energy</td>
			<td>E0801812500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axio Observer 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-Arg(Pbf)-OH</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>F-81070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>GLS201115-35202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-&#946;Ala-OH</td>
			<td>Adamas</td>
			<td>51341C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 &#176;C humidified incubator containing 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 1260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Poroshell EC-C18 120, 4.6 &#215; 150 mm (pore size 120 &#197;, particle size 4 &#956;m)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>SP Scientific</td>
			<td>Vir Tis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>9758</td>
			<td>toxicity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter plate</td>
			<td>Thermo &#956;drop plate</td>
			<td>N12391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpholine</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>M99040</td>
			<td>irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-technology microplate reader</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>VARIOSKAN LUX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>E-81416</td>
			<td>irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethyl formamide</td>
			<td>Energy</td>
			<td>B020051</td>
			<td>harmful to skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7321010</td>
			<td>polypropylene chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rink Amide MBHA resin (0.572 mmol/g)</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>GLS180301-49101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-way stopcocks</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7328107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate insert</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>14211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>T63278</td>
			<td>corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>T-0284475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7231</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of cyclic cell-penetrating peptides for enhanced penetration of biological barriers

Рак был серьезной проблемой в глобальном здравоохранении. Однако сложное микроокружение опухоли обычно ограничивает доступ терапевтических средств к более глубоким опухолевым клеткам, что приводит к рецидиву опухоли. Чтобы преодолеть ограниченное проникновение биологических барьеров, были обнаружены проникающие в клетки пептиды (CPP) с отличной способностью транслокации мембраны и стали полезными молекулярными транспортерами для доставки различных грузов в клетки. Однако обычные линейные СРР обычно демонстрируют нарушенную протеолитическую стабильность, что ограничивает их проницаемость через биологические барьеры. Таким образом, разработка новых молекулярных транспортеров, которые могут проникать через биологические барьеры и проявлять повышенную протеолитическую стабильность, крайне желательна для повышения эффективности доставки лекарств в биомедицинских приложениях. Ранее мы синтезировали панель коротких циклических CPP с ароматическими сшивками, которые показали превосходную проницаемость в раковых клетках и тканях по сравнению с их линейными аналогами. Здесь описан краткий протокол синтеза флуоресцентно меченного циклического пептида полиаргинина R8 и его линейного аналога, а также ключевые этапы исследования их клеточной проницаемости.

В этом протоколе была представлена синтетическая процедура для удержания линейного полиаргинина R8 в его циклической форме. СППС проводилась вручную с помощью простого аппарата (рис. 1). Подробный процесс синтеза СППС показан на рисунке 2. Короче...

Watch this Scientific Journal Video about Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers at JoVE.com

Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers

Этот протокол описывает синтез циклических пептидов, проникающих в клетки, с ароматическими поперечными связями и оценку их проницаемости через биологические барьеры.

Построение циклических пептидов, проникающих в клетки, для усиленного проникновения через биологические барьеры

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper ...

Серьезным препятствием для лечения рака является ограниченный доступ терапевтических средств к более глубоким опухолевым клеткам из-за физиологических барьеров. Таким образом, разработка новых молекулярных транспортеров, способных лечить биологические барьеры, крайне желательна для повышения эффективности доставки лекарств. Целью этой процедуры является синтез циклических пептидов, проникающих в клетки, для усиленного проникновения от клетки к клетке.Преимущество этого метода заключается в том, что пептидная циклизация может быть легко достигнута путем реакций замещения цистеинами и смолой без использования каких-либо металлических катализаторов. Включение ароматических поперечных связей улучшает общую гидрофобность пептидов по сравнению с гидрофильными лактамными или триазоловыми поперечными связями, тем самым повышая их проницаемость. Для начала соберите ручной аппарат синтеза пептидов в вытяжном шкафу.Установите трехходовые запорные краны на вакуумный коллектор и подсоедините их к азоту. Обязательно закройте неиспользуемые впускные отверстия. Прикрепите полипропиленовую колонну объемом 10 миллилитров к трехсторонним запорным кранам и слейте реакционную смесь или растворители из полипропиленовой колонны с помощью резиновой колбы для пипетки или вакуума через ловушку для отходов.Чтобы подготовить смолу к синтезу пептидов, добавьте от 4 до 5 миллилитров ДМФА к необходимому количеству смолы и перенесите ее в полипропиленовую колонну с мягким барботированием азота в течение 30 минут, чтобы смола набухала должным образом. Слейте ДМФ и добавьте в смолу от 4 до 5 миллилитров 50% морфолина/ДМФ. Аккуратно взбейте азот в течение 30 минут, чтобы удалить N-концевую группу Fmoc, а затем слейте смесь.Тщательно промойте смолу три раза, добавив в колонку от 4 до 5 миллилитров ДМФА и каждый раз барботируя азотом не менее 1 минуты. Таким же образом трижды промывайте смолу дихлорметаном и трижды ДМФ. Затем растворите 648,8 миллиграмма аргинина, защищенного Fmoc и PBF, и 372,6 миллиграмма HATU в 5 миллилитрах DMF в центрифужной пробирке.Добавьте 348,4 микролитра DIPEA, чтобы активировать реакцию связи, и перенесите реакционную смесь в полипропиленовую колонну со смолой. Осторожно перемешайте смесь с барботированием азота в течение 1-2 часов, а затем повторите реакцию соединения один раз. Слейте реакционную смесь и последовательно промойте смолу ДМФ, дихлорметаном и снова ДМФА три раза каждый в течение не менее 1 минуты каждый раз.Удалите защитную группу Fmoc и промойте смолу, следуя процедуре, показанной ранее, прежде чем приступить к соединению следующей аминокислоты. Затем соедините бета-аланин в качестве прокладки для маркировки FITC, используя тот же процесс, который показан для связывания аминокислот, а затем добавьте смесь FITC, DIPEA и DMF в полипропиленовую колонку в темноте, чтобы выполнить маркировку пептидов FITC на смоле. Реакция займет почти 8 часов.Чтобы выполнить циклизацию линейного пептида, добавьте смесь трифторуксусной кислоты, триизопропилсилана и дихлорметана в полипропиленовую колонну в течение 2 минут для селективного удаления тритил-защитной группы цистеина. Слейте смесь и повторяйте процедуру до тех пор, пока желтоватый раствор не станет бесцветным, чтобы полностью удалить тритил-защитную группу. Выполните последовательную промывку смолы ДМФА и дихлорметаном не менее трех раз и растворите 4, 4'бис-бромметилбифенил в ДМФА с помощью DIPEA.Добавьте раствор в колонку и реагируйте в течение 4 часов. Промойте смолу 4-5 миллилитрами метанола дважды по пять минут каждый и высушите ее непрерывным потоком азота. Для пептидов, содержащих цистеины, обработайте смолу эффективным коктейлем для расщепления трифторуксусной кислоты, триизопропилсилана и воды или трифторуксусной кислоты, триизопропилсилана, 1, 2-этанедитиола и воды.Обработайте связанную пептидами смолу в течение 2-3 часов, чтобы расщепить пептид, а затем осторожно удалите трифторуксусную кислоту струей азота. Чтобы получить сырые пептиды, добавляют от 4 до 5 миллилитров диэтилового эфира к расщепленному пептидному препарату для осаждения неочищенных пептидов и центрифугу при 10 000 x g в течение 4 минут. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость и высушите пептид на воздухе в течение 3 минут в эффективном вытяжном шкафу.Растворите мелкомасштабный сырой пептид в 800 микролитрах ацетонитрила, а затем проанализируйте его с помощью обратной фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии и жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии. Инокулируют 100 000 клеток HeLa в 2 миллилитра DMEM в 12-луночную камеру со вставкой пластины для культивирования тканей и инкубируют в течение 24 часов в увлажненном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия, содержащем 5% углекислого газа. Удалите среду и инкубируйте клетки в камерах с 1 миллилитром 10 микромоляров FITC-R8 или FITC-sR8-4 в ДМЭМ без FBS в течение 1 часа.После этого удалите среду, содержащую пептиды, и трижды промойте клетки 1 миллилитром PBS. Добавьте 1 миллилитр свежего DMEM без FBS в камеры, а затем совместно инкубируйте клетки HeLa в камере со вставленной пластиной для культивирования тканей с клетками HeLa на круглых покровных стеклах внизу в течение 2 часов. Закрепите клетки HeLa на круглых покровных стеклах 2,5% глутаровым альдегидом в течение 15 минут, а затем окрашивайте клетки DAPI в течение 15 минут.Наконец, понаблюдайте за клетками HeLa на покровных стеклах под флуоресцентным микроскопом. Представлена принципиальная схема синтеза меченного FITC линейного пептида R8 и меченного FITC скрепленного пептида R8. На этом рисунке показаны спектры ВЭЖХ и МС линейного пептида R8 и сшитого пептида R8.Время удержания сшитого пептида было значительно больше, чем у линейного аналога, что указывает на повышенную общую гидрофобность пептида после циклизации с гидрофобной сшивкой. Это графическое изображение представляет стабильность линейного пептида и сшитого пептида в присутствии 25% FBS. Циклический R8 остается на 77,3% нетронутым после инкубации с FBS в течение 4 часов, в то время как его линейный аналог был в основном деградирован, что свидетельствует о повышенной протеолитической стабильности циклического пептида R8.Здесь показаны изображения флуоресцентной микроскопии живых клеток HeLa и клеток 4T1 после 1-часовой инкубации с 3-микромолярным линейным пептидом R8, меченным FITC, и меченным FITC сшитым пептидом R8. Можно видеть, что клетки, обработанные циклическим R8 с ароматической поперечной связью, проявляли более высокую внутриклеточную флуоресценцию, чем клетки, обработанные их линейным аналогом. Аналогичные результаты были получены при анализе проточной цитометрии.Для дальнейшего изучения того, обеспечивает ли циклический R8 усиленное проникновение от клетки к клетке, были использованы трансвелл-модели для моделирования барьерной проницаемости пептидов от одного клеточного слоя к другому. Циклический R8 явно демонстрировал более высокое трансбарьерное проникновение, чем линейный пептид R8, о чем свидетельствует значительное увеличение внутриклеточной флуоресценции. Полное снятие защиты тритильной группы цистеина и смолы важно для следующего этапа циклизации.Кроме того, эффективность циклизации также зависит от конкретных последовательностей и длины пептидов из-за стерических эффектов. В таком случае было бы полезно использовать смолу с более низкой нагрузочной способностью или циклизировать пептиды в разбавленных концентрациях в фазе раствора. Эти циклические пептиды показали повышенную проницаемость между клетками по сравнению с их линейными аналогами.Мы считаем, что они имеют большие перспективы для преодоления биологических барьеров и будут использоваться в качестве молекулы для дальнейшего применения в области доставки лекарств.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Microwave-assisted Functionalization of Polyethylene glycol and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Микроволновая печь-помощь Функционализация поли (этиленгликоль) и On-смолы пептиды для использования в цепных полимеризации и гидрогеля формирования

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Формирование упорядоченных биомолекулярных структур по самосборки коротких пептидов

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Preparation of Hydrophobic Metal-Organic Frameworks via Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition of Perfluoroalkanes for the Removal of Ammonia

Подготовка гидрофобные Металл-органических структур через плазмостимулированного отложение химического пара перфторалканов для удаления аммиака

Plasma enhanced chemical vapor deposition (PECVD) of perfluoroalkanes has long been studied for tuning the wetting properties of surfaces. For high ...

Preparation of Highly Porous Coordination Polymer Coatings on Macroporous Polymer Monoliths for Enhanced Enrichment of Phosphopeptides

Подготовка высоко пористый Координационного полимерных покрытий на макропористых полимерных монолитов для повышенного обогащения фосфопептидов

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous ...

A Filter-based Surface Enhanced Raman Spectroscopic Assay for Rapid Detection of Chemical Contaminants

Фильтром на основе поверхностного Enhanced Raman Спектроскопическое Анализ на быстрое обнаружение химических загрязнителей

We demonstrate a method to fabricate highly sensitive surface-enhanced Raman spectroscopic (SERS) substrates using a filter syringe system that can be ...

Construction of Models for Nondestructive Prediction of Ingredient Contents in Blueberries by Near-infrared Spectroscopy Based on HPLC Measurements

Построение моделей для прогнозирования неразрушающему ингредиента Содержание в чернике с помощью ближней инфракрасной спектроскопии на основе ВЭЖХ измерений

Nondestructive prediction of ingredient contents of farm products is useful to ship and sell the products with guaranteed qualities. Here, near-infrared ...

Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level

Синтез циклических полимеров и характеристика их диффузионное движение в расплавленном состоянии на уровне отдельной молекулы

We demonstrate a method for the synthesis of cyclic polymers and a protocol for characterizing their diffusive motion in a melt state at the single ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Исследования в взаимодействий аминокислот и пептидов с использованием неорганических материалов с использованием одномолекулярной силовой микроскопии

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Observation and Analysis of Blinking Surface-enhanced Raman Scattering

Наблюдение и анализ мигает поверхности расширение комбинационного рассеяния

From a single molecule at a silver nanoaggregate junction, blinking surface-enhanced Raman scattering (SERS) is observed. Here, a protocol is presented on ...