Name: construction of cyclic cell-penetrating peptides for enhanced penetration of biological barriers
Uploaded: 2022-09-19T13:00:00
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Este trabajo cuenta con el apoyo de la Fundación de Ciencias Naturales de China (21708031), la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (BX20180264, 2018M643519) y los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (2682021ZTPY075).

1. Preparación del equipo
NOTA: Realice todos los procedimientos en una campana extractora de humos de funcionamiento con el equipo de protección personal adecuado.
<ol><li>Montar el aparato manual de síntesis de péptidos en la campana extractora (Figura 1). Coloque las llaves de paso de tres vías (consulte la Tabla de materiales) en el colector de vacío (consulte la Tabla de materiales) y conéctelas al nitrógeno (N...

<ol>
	<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-targeted+dual+site-selective+functionalized+poly(&#946;-amino+esters)+delivery+platform+for+nerve+regeneration.">Brain-targeted dual site-selective functionalized poly(&#946;-amino esters) delivery platform for nerve regeneration.</a> Nano Letters. 21 (7), 3007-3015 (2021).</li><li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+BBB+permeability+of+osmotically+active+poly(mannitol-co-PEI)+modified+with+rabies+virus+glycoprotein+via+selective+stimulation+of+caveolar+endocytosis+for+RNAi+therapeutics+in+Alzheimer's+disease.">Enhanced BBB permeability of osmotically active poly(mannitol-co-PEI) modified with rabies virus glycoprotein via selective stimulation of caveolar endocytosis for RNAi therapeutics in Alzheimer's disease.</a> Biomaterials. 38, 61-71 (2015).</li><li>Bian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cell-based+intercellular+delivery+of+transcription+factor+GATA4+on+ischemic+cardiomyopathy.">Effect of cell-based intercellular delivery of transcription factor GATA4 on ischemic cardiomyopathy.</a> Circulation Research. 100 (11), 1626-1633 (2007).</li><li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+low+molecular+weight+protamine+chemical+chimera+to+enhance+monomeric+insulin+intestinal+absorption.">The use of low molecular weight protamine chemical chimera to enhance monomeric insulin intestinal absorption.</a> Biomaterials. 34 (31), 7733-7743 (2013).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+STAT3-binding+peptide+exerts+antiproliferative+effects+and+antitumor+activity+by+inhibiting+STAT3+phosphorylation+and+signaling.">A specific STAT3-binding peptide exerts antiproliferative effects and antitumor activity by inhibiting STAT3 phosphorylation and signaling.</a> Cancer Research. 74 (8), 2144-2151 (2014).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEGylated+liposomes+with+NGR+ligand+and+heat-activable+cell-penetrating+peptide-doxorubicin+conjugate+for+tumor-specific+therapy.">PEGylated liposomes with NGR ligand and heat-activable cell-penetrating peptide-doxorubicin conjugate for tumor-specific therapy.</a> Biomaterials. 35 (14), 4368-4381 (2014).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+paclitaxel+delivery+facilitated+by+a+dual-functional+CPP+with+a+hydrophobic+hairpin+tail.">Intracellular paclitaxel delivery facilitated by a dual-functional CPP with a hydrophobic hairpin tail.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (4), 4853-4860 (2021).</li><li>Vasan, N., Baselga, J., Hyman, D. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptide+conjugates+of+peptide+nucleic+acids+(PNA)+as+inhibitors+of+HIV-1+Tat-dependent+trans-activation+in+cells.">Cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids (PNA) as inhibitors of HIV-1 Tat-dependent trans-activation in cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (21), 6837-6849 (2005).</li><li>Tunnemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+analysis+of+cell+penetration+ability+and+toxicity+of+oligo-arginines.">Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines.</a> Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).</li><li>Shi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stapling+of+short+cell-penetrating+peptides+for+enhanced+tumor+cell-and-tissue+dual-penetration.">Stapling of short cell-penetrating peptides for enhanced tumor cell-and-tissue dual-penetration.</a> Chemical Communications. 58 (14), 2299-2302 (2022).</li><li>Komin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peptide+for+transcellular+cargo+delivery:+Structure-function+relationship+and+mechanism+of+action.">A peptide for transcellular cargo delivery: Structure-function relationship and mechanism of action.</a> Journal of Controlled Release. 324, 633-643 (2020).</li><li>Dietrich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+permeable+stapled+peptide+inhibitor+of+Wnt+signaling+that+targets+&#946;-catenin+protein-protein+interactions.">Cell permeable stapled peptide inhibitor of Wnt signaling that targets &#946;-catenin protein-protein interactions.</a> Cell Chemical Biology. 24 (8), 958-968 (2017).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stapling+of+unprotected+helical+peptides+via+photo-induced+intramolecular+thiol-yne+hydrothiolation.">Stapling of unprotected helical peptides via photo-induced intramolecular thiol-yne hydrothiolation.</a> Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).</li><li>De Araujo, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+&#945;-helicity+of+cyclic+pentapeptides+in+water.">Comparative &#945;-helicity of cyclic pentapeptides in water.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (27), 6965-6969 (2014).</li><li>Chu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+understanding+cell+penetration+by+stapled+peptides.">Towards understanding cell penetration by stapled peptides.</a> Medicinal Chemistry Communications. 6 (1), 111-119 (2015).</li><li>Bock, J. E., Gavenonis, J., Kritzer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+in+shape:+Controlling+peptide+bioactivity+and+bioavailability+using+conformational+constraints.">Getting in shape: Controlling peptide bioactivity and bioavailability using conformational constraints.</a> ACS Chemical Biology. 8 (3), 488-499 (2013).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+stapling+architecture+on+physiochemical+properties+and+cell+permeability+of+stapled+&#945;-helical+peptides:+A+comparative+study.">Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled &#945;-helical peptides: A comparative study.</a> ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).</li><li>White, C. J., Yudin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contemporary+strategies+for+peptide+macrocyclization.">Contemporary strategies for peptide macrocyclization.</a> Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).</li><li>Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+tumor+vasculature:+An+emerging+concept+in+antiangiogenic+therapy.">Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy.</a> Science. 307 (5706), 58-62 (2005).</li><li>Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+synthesis+of+short+&#945;-helices+stabilized+by+the+hydrogen+bond+surrogate+approach.">Solid-phase synthesis of short &#945;-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach.</a> Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).</li><li>Baek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+stapled+p53+peptide+bound+to+Mdm2.">Structure of the stapled p53 peptide bound to Mdm2.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (1), 103-106 (2012).</li><li>Traboulsi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrocyclic+cell+penetrating+peptides:+A+study+of+structure-penetration+properties.">Macrocyclic cell penetrating peptides: A study of structure-penetration properties.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (3), 405-411 (2015).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proline-derived+transannular+N-cap+for+nucleation+of+short+&#945;-helical+peptides.">A proline-derived transannular N-cap for nucleation of short &#945;-helical peptides.</a> Chemical Communications. 52 (59), 9275-9278 (2016).</li><li>Muppidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+proteolytically+stable,+cell-permeable+peptide-based+selective+Mcl-1+inhibitors.">Rational design of proteolytically stable, cell-permeable peptide-based selective Mcl-1 inhibitors.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (36), 14734-14737 (2012).</li><li>Wiradharma, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+cationic+amphiphilic+&#945;-helical+peptides+as+antimicrobial+agents.">Synthetic cationic amphiphilic &#945;-helical peptides as antimicrobial agents.</a> Biomaterials. 32 (8), 2204-2212 (2011).</li><li>Jones, A. T., Sayers, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+entry+of+cell+penetrating+peptides:+Tales+of+tails+wagging+dogs.">Cell entry of cell penetrating peptides: Tales of tails wagging dogs.</a> Journal of Controlled Release. 161 (2), 582-591 (2012).</li></ol>

La estabilización química de péptidos mediante la incorporación de restricciones conformacionales ha demostrado ser una estrategia eficaz para mejorar la estabilidad y permeabilidad celular del péptido26. En este protocolo, se describe un procedimiento paso a paso para la síntesis de CPP cíclicos con enlaces cruzados aromáticos y la evaluación de su permeabilidad a través de barreras biológicas. En comparación con los enlaces cruzados hidrofílicos lactámicos o triazoles<sup class="xr...

Las últimas décadas han sido testigos de rápidos avances en el desarrollo de péptidos de penetración celular (CPP) para la administración de fármacos. Los CPP se han utilizado ampliamente como transportadores moleculares para el tratamiento de una variedad de enfermedades potencialmente mortales, incluidos los trastornos neurológicos1,2, las enfermedades cardíacas3, la diabetes4, la dermatosis5 y el cáncer 6,7. El cáncer sigue siendo una carga sanitaria mundial acompañada de una alta tasa de morbilidad y mortalidad a pesar de los esfuerzos de investigación generalizados8. Un obstáculo serio para el tratamiento del cáncer es el acceso limitado de la terapéutica a las células tumorales más profundas debido a barreras fisiológicas como la matriz extracelular compacta (MEC), la vasculatura tumoral anormal, las barreras de membrana múltiple y la alta presión del líquido intersticial (IFP)9. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos CPP con capacidad superior para entregar cargas a través de barreras biológicas se considera una estrategia esencial para el tratamiento del cáncer10,11.
Las CPP pueden clasificarse en CPP catiónicas, anfipáticas e hidrofóbicas en términos de sus propiedades fisicoquímicas12. Entre estos, el péptido VIH-TAT cargado positivamente y la poliarginina sintética son de considerable importancia en la investigación biomédica y han sido ampliamente estudiados para facilitar la administración intracelularde fármacos 13. Tunnemann et al. informaron que una longitud mínima de ocho argininas es esencial para la penetración celular eficiente de los péptidos sintéticos de poliarginina, basado en un estudio de permeabilidad celular realizado con péptidos R3 a R1214. Sin embargo, estos CPP generalmente tienen vidas medias plasmáticas cortas debido a su rápida hidrólisis in vivo. Además, se sabe poco sobre la optimización de la estructura química de los CPP para aumentar su capacidad de transbarrera, ya que es difícil penetrar múltiples membranas celulares15. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos transportadores moleculares capaces de penetrar las barreras biológicas es muy deseado para mejorar la eficiencia de la administración de fármacos. En 2020, Komin et al.16 descubrieron un CPP llamado péptido CL, que contiene un motivo de hélice (RLLRLLR) y una cola de poliarginina (R7) para cruzar la monocapa epitelial. También se sintetizó un conjunto de variantes peptídicas CL alterando el patrón helicoidal. Esta exploración podría ser una guía importante para el desarrollo de nuevos CPP para la entrega de cargas a través de barreras biológicas. Además, Dietrich et al. optimizaron la permeabilidad celular del péptido StAX, inhibiendo la vía de señalización Wnt/β-catenina al aumentar la hidrofobicidad global de los péptidos17.
La restricción conformacional de péptidos lineales no estructurados por ciclación es una forma efectiva de mejorar su estabilidad proteolítica y permeabilidad18,19,20. El refuerzo estructural aumenta la resistencia a la proteasa de los péptidos cíclicos, haciéndolos más estables in vivo en comparación con sus contrapartes lineales. Además, la ciclación de péptidos puede potencialmente enmascarar la columna vertebral del péptido polar al promover el enlace de hidrógeno intramolecular, aumentando así la permeabilidad de la membrana de los péptidos21. En las últimas dos décadas, los métodos de ciclación quimioselectiva se han convertido en estrategias efectivas para la construcción de péptidos cíclicos con diferentes arquitecturas, como todo hidrocarburo, lactámico, triazol, m-xileno, perfluoroarilo y otros enlaces cruzados22,23. La barrera biológica impuesta por el sofisticado microambiente tumoral podría reducir la penetración de fármacos en tumores sólidos24. Hemos encontrado previamente que los CPP cíclicos mostraron una resistencia superior a la digestión enzimática sobre sus contrapartes lineales20. Además, la hidrofobicidad global de los péptidos es crítica para su mayor permeabilidad celular22. Sobre la base de los estudios discutidos anteriormente, se puede plantear la hipótesis de que la combinación de un patrón cargado positivamente, hidrofobicidad general elevada y estabilidad de proteólisis mejorada aumenta la permeabilidad de las CPP a través de las barreras biológicas. En un estudio reciente, identificamos dos CPP cíclicos con enlaces cruzados aromáticos en las posiciones i e i + 7 que exhiben una mejor permeabilidad en células y tejidos tumorales en comparación con sus contrapartes lineales15. Aquí, se presenta un protocolo sintético conciso para la síntesis de CPP cíclicos marcados con fluorescencia y los pasos clave para investigar su permeabilidad.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-ethanedithiol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>K1722093</td>
			<td>stench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU)</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>A-0443697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,4&#39;-bis(bromomethyl)biphenyl</td>
			<td>TCI</td>
			<td>B1921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>4T1 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 &#176;C humidified incubator containing 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile&#160;</td>
			<td>Adamas</td>
			<td>1484971</td>
			<td>toxicity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Energy</td>
			<td>W330229</td>
			<td>skin harmful</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>673811</td>
			<td>flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST038</td>
			<td>skin harmful</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrospray Ionization Mass Spectrometer</td>
			<td>Waters</td>
			<td>G2-S Tof</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CytoFLEX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate isomer (FITC)</td>
			<td>Energy</td>
			<td>E0801812500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axio Observer 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-Arg(Pbf)-OH</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>F-81070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>GLS201115-35202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-&#946;Ala-OH</td>
			<td>Adamas</td>
			<td>51341C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 &#176;C humidified incubator containing 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 1260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Poroshell EC-C18 120, 4.6 &#215; 150 mm (pore size 120 &#197;, particle size 4 &#956;m)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>SP Scientific</td>
			<td>Vir Tis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>9758</td>
			<td>toxicity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter plate</td>
			<td>Thermo &#956;drop plate</td>
			<td>N12391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpholine</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>M99040</td>
			<td>irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-technology microplate reader</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>VARIOSKAN LUX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>E-81416</td>
			<td>irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethyl formamide</td>
			<td>Energy</td>
			<td>B020051</td>
			<td>harmful to skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7321010</td>
			<td>polypropylene chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rink Amide MBHA resin (0.572 mmol/g)</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>GLS180301-49101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-way stopcocks</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7328107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate insert</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>14211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>T63278</td>
			<td>corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>T-0284475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7231</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of cyclic cell-penetrating peptides for enhanced penetration of biological barriers

El cáncer ha sido un gran desafío en la salud mundial. Sin embargo, el complejo microambiente tumoral generalmente limita el acceso de la terapéutica a las células tumorales más profundas, lo que lleva a la recurrencia del tumor. Para conquistar la penetración limitada de las barreras biológicas, se han descubierto péptidos de penetración celular (CPP) con excelente capacidad de translocación de membrana y han surgido como transportadores moleculares útiles para entregar diversas cargas a las células. Sin embargo, las CPP lineales convencionales generalmente muestran una estabilidad proteolítica comprometida, lo que limita su permeabilidad a través de las barreras biológicas. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos transportadores moleculares que puedan penetrar las barreras biológicas y exhibir una mayor estabilidad proteolítica es muy deseado para promover la eficiencia de la administración de fármacos en aplicaciones biomédicas. Hemos sintetizado previamente un panel de CPP cíclicos cortos con enlaces cruzados aromáticos, que exhibieron una permeabilidad superior en células y tejidos cancerosos en comparación con sus contrapartes lineales. Aquí, se describe un protocolo conciso para la síntesis del péptido cíclico de poliarginina R8 marcado con fluorescencia y su contraparte lineal, así como los pasos clave para investigar su permeabilidad celular.

En este protocolo, se presentó un procedimiento sintético para restringir la poliarginina lineal R8 en su forma cíclica. El SPPS se realizó manualmente utilizando un aparato simple (Figura 1). El proceso sintético detallado de SPPS se muestra en la Figura 2. Brevemente, la resina estaba suficientemente hinchada, seguida de la desprotección del grupo protector de N α-Mmoc. Luego, el aminoácido protegido con N α-Fmoc...

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Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers

Este protocolo describe la síntesis de péptidos cíclicos penetrantes de células con enlaces cruzados aromáticos y la evaluación de su permeabilidad a través de barreras biológicas.

Construcción de péptidos cíclicos penetrantes de células para mejorar la penetración de barreras biológicas

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper ...

Un obstáculo serio para el tratamiento del cáncer es el acceso limitado de la terapéutica a las células tumorales más profundas debido a las barreras fisiológicas. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos transportadores moleculares capaces de tratar las barreras biológicas es muy deseado para mejorar la eficiencia de la administración de fármacos. El propósito de este procedimiento es sintetizar los péptidos cíclicos que penetran en las células para mejorar la penetración de célula a célula.La ventaja de este método es que la ciclación peptídica se puede lograr fácilmente a través de reacciones de sustitución con cisteínas y resina sin necesidad de catalizadores metálicos. La incorporación de enlaces cruzados aromáticos mejora la hidrofobicidad global de los péptidos en comparación con los enlaces cruzados hidrofílicos lactámicos o triazoles, mejorando así su permeabilidad. Para comenzar, ensamble el aparato manual de síntesis de péptidos en la campana extractora.Coloque las llaves de paso de tres vías en el colector de vacío y conéctelas al nitrógeno. Asegúrese de tapar las entradas no utilizadas. Coloque una columna de polipropileno de 10 mililitros en las llaves de paso de tres vías y drene la mezcla de reacción o los disolventes de la columna de polipropileno con una bombilla de pipeta de goma o una aspiradora a través de una trampa de residuos.Para preparar la resina para la síntesis de péptidos, agregue de 4 a 5 mililitros de DMF a la cantidad requerida de resina y transfiérala a la columna de polipropileno con un suave burbujeo de nitrógeno durante 30 minutos para hinchar la resina adecuadamente. Escurrir el DMF y añadir de 4 a 5 mililitros de 50% de morfolina/DMF a la resina. Burbujee suavemente nitrógeno durante 30 minutos para eliminar el grupo Fmoc N-terminal y luego drene la mezcla.Lave bien la resina tres veces agregando de 4 a 5 mililitros de DMF a la columna y burbujeando con nitrógeno durante al menos 1 minuto cada vez. De la misma manera, lave la resina con diclorometano tres veces y DMF tres veces. A continuación, disuelva 648.8 miligramos de arginina protegida con Fmoc y PBF y 372.6 miligramos de HATU en 5 mililitros de DMF en un tubo de centrífuga.Agregue 348.4 microlitros de DIPEA para activar la reacción de acoplamiento y transfiera la mezcla de reacción a la columna de polipropileno con resina. Agite suavemente la mezcla con burbujeo de nitrógeno durante 1 a 2 horas, y luego repita la reacción de acoplamiento una vez. Drene la mezcla de reacción y lave la resina secuencialmente con DMF, diclorometano y nuevamente DMF tres veces cada una durante al menos 1 minuto cada vez.Retire el grupo protector Fmoc y lave la resina siguiendo el procedimiento mostrado anteriormente antes de proceder a acoplar el siguiente aminoácido. A continuación, acople la beta-alanina como espaciador para el etiquetado FITC utilizando el mismo proceso que se muestra para el acoplamiento de aminoácidos, y luego agregue una mezcla de FITC, DIPEA y DMF a la columna de polipropileno en la oscuridad para realizar el etiquetado FITC de péptidos en la resina. La reacción tomaría casi 8 horas.Para realizar la ciclación del péptido lineal, agregue una mezcla de ácido trifluoroacético, triisopropilsilano y diclorometano a la columna de polipropileno durante 2 minutos para eliminar selectivamente el grupo de cisteína que protege el tritilo. Drene la mezcla y repita el procedimiento hasta que la solución amarillenta se vuelva incolora para eliminar completamente el grupo protector de tritilo. Realizar lavados secuenciales de la resina con DMF y diclorometano al menos tres veces y disolver 4,4'bis-bromometil-bifenilo en DMF con DIPEA.Agregue la solución a la columna y reaccione durante 4 horas. Lave la resina con 4 a 5 mililitros de metanol dos veces durante cinco minutos cada una, y séquela con un flujo continuo de nitrógeno. Para péptidos que contienen cisteína, trate la resina con un cóctel de escisión efectivo de ácido trifluoroacético, triisopropilsilano y agua o ácido trifluoroacético, triisopropilsilano, 1, 2-etanedithiol y agua.Trate la resina unida a péptidos durante 2 a 3 horas para escindir el péptido, y luego retire el ácido trifluoroacético cuidadosamente con una corriente de nitrógeno. Para obtener los péptidos crudos, agregue de 4 a 5 mililitros de éter dietílico a la preparación de péptidos escindidos para precipitar los péptidos crudos y centrifugar a 10, 000 x g durante 4 minutos. Deseche cuidadosamente el sobrenadante y seque al aire el péptido durante 3 minutos en una campana extractora efectiva.Disuelva el péptido crudo a pequeña escala en 800 microlitros de acetonitrilo y luego analícelo utilizando cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa y cromatografía líquida-espectrometría de masas. Inocular 100, 000 células HeLa en 2 mililitros de DMEM en una cámara de 12 pocillos con un inserto de placa de cultivo de tejido, e incubar durante 24 horas en una incubadora humidificada de 37 grados centígrados que contiene 5% de dióxido de carbono. Retire el medio e incube las células en las cámaras con 1 mililitro de 10 micromolares FITC-R8 o FITC-sR8-4 en DMEM libre de FBS durante 1 hora.Después de eso, retire el medio que contiene los péptidos y lave las células tres veces con 1 mililitro de PBS. Agregue 1 mililitro de DMEM fresco libre de FBS a las cámaras, y luego incube conjuntamente las células HeLa en la cámara con el inserto de placa de cultivo de tejidos, con las células HeLa en los cubreobjetos redondos en la parte inferior durante 2 horas. Fije las células HeLa en los cubreobjetos redondos con glutaraldehído al 2,5% durante 15 minutos, y luego tiñe las células con DAPI durante 15 minutos.Finalmente, observe las células HeLa en los cubreobjetos bajo un microscopio de fluorescencia. Aquí se presenta un diagrama esquemático de la síntesis del péptido R8 lineal marcado con FITC y el péptido R8 grapado marcado con FITC. Los espectros HPLC y MS del péptido lineal R8 y el péptido R8 grapado se muestran en esta figura.El tiempo de retención del péptido grapado fue sustancialmente más largo que el del análogo lineal, lo que indica una hidrofobicidad general mejorada del péptido después de la ciclación con la reticulación hidrofóbica. Esta imagen gráfica representa la estabilidad del péptido lineal y el péptido grapado en presencia de 25% FBS. El R8 cíclico permanece 77.3% intacto después de la incubación con FBS durante 4 horas, mientras que su contraparte lineal se degradó en su mayoría, lo que sugiere una mayor estabilidad proteolítica del péptido R8 cíclico.Aquí se muestran imágenes de microscopía de fluorescencia de células vivas de células HeLa y células 4T1 después de 1 hora de incubación con 3 péptidos R8 lineales marcados con FITC micromolar y péptido R8 grapado marcado con FITC. Se puede observar que las células tratadas con R8 cíclico con reticulación aromática exhibieron mayor fluorescencia intracelular que las tratadas con su contraparte lineal. Se obtuvieron resultados similares con el análisis de citometría de flujo.Para investigar más a fondo si el R8 cíclico confiere una mayor penetración de célula a célula, se utilizaron modelos transwell para simular la permeabilidad de barrera de los péptidos de una capa celular a otra. El R8 cíclico mostró claramente una mayor penetración de transbarrera que el péptido lineal R8, como lo indica un aumento significativo en la fluorescencia intracelular. La desprotección completa del grupo tritilo de cisteína y resina es importante para el siguiente paso de ciclación.Además, la eficiencia de ciclación también depende de las secuencias específicas y las longitudes de los péptidos debido a los efectos estéricos. En tal caso, sería útil utilizar una resina con menor capacidad de carga o ciclar los péptidos bajo concentraciones diluidas en fase de solución. Estos péptidos cíclicos mostraron una mayor permeabilidad de célula a célula en comparación con sus contrapartes lineales.Creemos que son muy prometedores para conquistar las barreras biológicas y se utilizarán para una molécula para otras aplicaciones en el campo de la administración de fármacos.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Microwave-assisted Functionalization of Polyethylene glycol and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Funcionalización asistida por microondas de poli (etilenglicol) y los péptidos sobre resina para uso en polimerizaciones de cadena y Formación de hidrogel

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large ...

Investigación

Química

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Formación de estructuras biomoleculares ordenada por el auto-ensamblaje de péptidos cortos

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Preparation of Hydrophobic Metal-Organic Frameworks via Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition of Perfluoroalkanes for the Removal of Ammonia

Preparación de hidrófobos orgánicos marcos de metal a través de Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition de perfluoroalcanos para la eliminación de amoniaco

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Preparación de altamente poroso Coordinación Polymer Coatings en macroporosas Polymer Monolitos de Enriquecimiento mejorada de Phosphopeptides

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