Name: construction of cyclic cell-penetrating peptides for enhanced penetration of biological barriers
Uploaded: 2022-09-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers at JoVE.com

Detta arbete stöds av Natural Science Foundation of China (21708031), China Postdoctoral Science Foundation (BX20180264, 2018M643519) och de grundläggande forskningsfonderna för de centrala universiteten (2682021ZTPY075).

1. Förberedelse av utrustning
OBS: Utför alla procedurer i en dragskåp med lämplig personlig skyddsutrustning.
<ol><li>Montera den manuella peptidsyntesapparaten i dragskåpet (figur 1). Placera kranarna (se Materialförteckning) på vakuumgrenröret (se Materialförteckning) och anslut till kvävgasen (N2). Se till att täcka de oanvända inloppen.</li>
	<li>Fäst en 10 ml polypropenkolonn (se <s...

<ol>
	<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-targeted+dual+site-selective+functionalized+poly(&#946;-amino+esters)+delivery+platform+for+nerve+regeneration.">Brain-targeted dual site-selective functionalized poly(&#946;-amino esters) delivery platform for nerve regeneration.</a> Nano Letters. 21 (7), 3007-3015 (2021).</li><li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+BBB+permeability+of+osmotically+active+poly(mannitol-co-PEI)+modified+with+rabies+virus+glycoprotein+via+selective+stimulation+of+caveolar+endocytosis+for+RNAi+therapeutics+in+Alzheimer's+disease.">Enhanced BBB permeability of osmotically active poly(mannitol-co-PEI) modified with rabies virus glycoprotein via selective stimulation of caveolar endocytosis for RNAi therapeutics in Alzheimer's disease.</a> Biomaterials. 38, 61-71 (2015).</li><li>Bian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cell-based+intercellular+delivery+of+transcription+factor+GATA4+on+ischemic+cardiomyopathy.">Effect of cell-based intercellular delivery of transcription factor GATA4 on ischemic cardiomyopathy.</a> Circulation Research. 100 (11), 1626-1633 (2007).</li><li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+low+molecular+weight+protamine+chemical+chimera+to+enhance+monomeric+insulin+intestinal+absorption.">The use of low molecular weight protamine chemical chimera to enhance monomeric insulin intestinal absorption.</a> Biomaterials. 34 (31), 7733-7743 (2013).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+STAT3-binding+peptide+exerts+antiproliferative+effects+and+antitumor+activity+by+inhibiting+STAT3+phosphorylation+and+signaling.">A specific STAT3-binding peptide exerts antiproliferative effects and antitumor activity by inhibiting STAT3 phosphorylation and signaling.</a> Cancer Research. 74 (8), 2144-2151 (2014).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEGylated+liposomes+with+NGR+ligand+and+heat-activable+cell-penetrating+peptide-doxorubicin+conjugate+for+tumor-specific+therapy.">PEGylated liposomes with NGR ligand and heat-activable cell-penetrating peptide-doxorubicin conjugate for tumor-specific therapy.</a> Biomaterials. 35 (14), 4368-4381 (2014).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+paclitaxel+delivery+facilitated+by+a+dual-functional+CPP+with+a+hydrophobic+hairpin+tail.">Intracellular paclitaxel delivery facilitated by a dual-functional CPP with a hydrophobic hairpin tail.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (4), 4853-4860 (2021).</li><li>Vasan, N., Baselga, J., Hyman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+on+drug+resistance+in+cancer.">A view on drug resistance in cancer.</a> Nature. 575 (7782), 299-309 (2019).</li><li>Cong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment-induced+in+situ+self-assembly+of+polymer-peptide+conjugates+that+attack+solid+tumors+deeply.">Microenvironment-induced in situ self-assembly of polymer-peptide conjugates that attack solid tumors deeply.</a> Angewandte Chemie International Edition. 131 (14), 4680-4685 (2019).</li><li>Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+nanoparticle+design+for+overcoming+biological+barriers+to+drug+delivery.">Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery.</a> Nature Biotechnology. 33 (9), 941-951 (2015).</li><li>Tian, Y., Zhou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+cell-penetrating+peptides+and+their+functionalization+of+polymeric+nanoplatforms+for+drug+delivery.">Advances in cell-penetrating peptides and their functionalization of polymeric nanoplatforms for drug delivery.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (2), 1-12 (2021).</li><li>Milletti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides:+Classes,+origin,+and+current+landscape.">Cell-penetrating peptides: Classes, origin, and current landscape.</a> Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).</li><li>Turner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptide+conjugates+of+peptide+nucleic+acids+(PNA)+as+inhibitors+of+HIV-1+Tat-dependent+trans-activation+in+cells.">Cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids (PNA) as inhibitors of HIV-1 Tat-dependent trans-activation in cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (21), 6837-6849 (2005).</li><li>Tunnemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+analysis+of+cell+penetration+ability+and+toxicity+of+oligo-arginines.">Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines.</a> Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).</li><li>Shi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stapling+of+short+cell-penetrating+peptides+for+enhanced+tumor+cell-and-tissue+dual-penetration.">Stapling of short cell-penetrating peptides for enhanced tumor cell-and-tissue dual-penetration.</a> Chemical Communications. 58 (14), 2299-2302 (2022).</li><li>Komin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peptide+for+transcellular+cargo+delivery:+Structure-function+relationship+and+mechanism+of+action.">A peptide for transcellular cargo delivery: Structure-function relationship and mechanism of action.</a> Journal of Controlled Release. 324, 633-643 (2020).</li><li>Dietrich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+permeable+stapled+peptide+inhibitor+of+Wnt+signaling+that+targets+&#946;-catenin+protein-protein+interactions.">Cell permeable stapled peptide inhibitor of Wnt signaling that targets &#946;-catenin protein-protein interactions.</a> Cell Chemical Biology. 24 (8), 958-968 (2017).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stapling+of+unprotected+helical+peptides+via+photo-induced+intramolecular+thiol-yne+hydrothiolation.">Stapling of unprotected helical peptides via photo-induced intramolecular thiol-yne hydrothiolation.</a> Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).</li><li>De Araujo, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+&#945;-helicity+of+cyclic+pentapeptides+in+water.">Comparative &#945;-helicity of cyclic pentapeptides in water.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (27), 6965-6969 (2014).</li><li>Chu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+understanding+cell+penetration+by+stapled+peptides.">Towards understanding cell penetration by stapled peptides.</a> Medicinal Chemistry Communications. 6 (1), 111-119 (2015).</li><li>Bock, J. E., Gavenonis, J., Kritzer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+in+shape:+Controlling+peptide+bioactivity+and+bioavailability+using+conformational+constraints.">Getting in shape: Controlling peptide bioactivity and bioavailability using conformational constraints.</a> ACS Chemical Biology. 8 (3), 488-499 (2013).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+stapling+architecture+on+physiochemical+properties+and+cell+permeability+of+stapled+&#945;-helical+peptides:+A+comparative+study.">Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled &#945;-helical peptides: A comparative study.</a> ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).</li><li>White, C. J., Yudin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contemporary+strategies+for+peptide+macrocyclization.">Contemporary strategies for peptide macrocyclization.</a> Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).</li><li>Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+tumor+vasculature:+An+emerging+concept+in+antiangiogenic+therapy.">Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy.</a> Science. 307 (5706), 58-62 (2005).</li><li>Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+synthesis+of+short+&#945;-helices+stabilized+by+the+hydrogen+bond+surrogate+approach.">Solid-phase synthesis of short &#945;-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach.</a> Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).</li><li>Baek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+stapled+p53+peptide+bound+to+Mdm2.">Structure of the stapled p53 peptide bound to Mdm2.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (1), 103-106 (2012).</li><li>Traboulsi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrocyclic+cell+penetrating+peptides:+A+study+of+structure-penetration+properties.">Macrocyclic cell penetrating peptides: A study of structure-penetration properties.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (3), 405-411 (2015).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proline-derived+transannular+N-cap+for+nucleation+of+short+&#945;-helical+peptides.">A proline-derived transannular N-cap for nucleation of short &#945;-helical peptides.</a> Chemical Communications. 52 (59), 9275-9278 (2016).</li><li>Muppidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+proteolytically+stable,+cell-permeable+peptide-based+selective+Mcl-1+inhibitors.">Rational design of proteolytically stable, cell-permeable peptide-based selective Mcl-1 inhibitors.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (36), 14734-14737 (2012).</li><li>Wiradharma, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+cationic+amphiphilic+&#945;-helical+peptides+as+antimicrobial+agents.">Synthetic cationic amphiphilic &#945;-helical peptides as antimicrobial agents.</a> Biomaterials. 32 (8), 2204-2212 (2011).</li><li>Jones, A. T., Sayers, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+entry+of+cell+penetrating+peptides:+Tales+of+tails+wagging+dogs.">Cell entry of cell penetrating peptides: Tales of tails wagging dogs.</a> Journal of Controlled Release. 161 (2), 582-591 (2012).</li></ol>

Den kemiska stabiliseringen av peptider genom att införliva konformationsbegränsningar har visat sig vara en effektiv strategi för att förbättra stabiliteten och cellpermeabiliteten hos peptid26. I detta protokoll beskrivs en steg-för-steg-procedur för syntes av cykliska CPP med aromatiska tvärbindningar och utvärdering av deras permeabilitet över biologiska barriärer. Jämfört med de hydrofila laktam- eller triazoltvärbindningarna22,27 förbättrar införlivan...

De senaste decennierna har bevittnat snabba framsteg i utvecklingen av cellpenetrerande peptider (CPP) för läkemedelsleverans. CPP har använts i stor utsträckning som molekylära transportörer för behandling av en rad livshotande sjukdomar, inklusive neurologiska störningar1,2, hjärtsjukdomar3, diabetes4, dermatos5 och cancer 6,7. Cancer är fortfarande en global hälsobörda åtföljd av en hög sjuklighet och dödlighet trots omfattande forskningsinsatser8. Ett allvarligt hinder för behandling av cancer är den begränsade tillgången på läkemedel till djupare tumörceller på grund av fysiologiska barriärer såsom kompakt extracellulär matris (ECM), onormal tumörvaskulatur, flera membranbarriärer och högt interstitiellt vätsketryck (IFP)9. Att utveckla nya CPP med överlägsen förmåga att leverera last över biologiska barriärer anses därför vara en viktig strategi för cancerbehandling10,11.
CPP kan kategoriseras i katjoniska, amfipatiska och hydrofoba CPP med avseende på deras fysikalisk-kemiska egenskaper12. Bland dessa är den positivt laddade HIV-TAT-peptiden och det syntetiska polyargininet av stor betydelse i biomedicinsk forskning och har studerats omfattande för att underlätta intracellulär läkemedelsleverans13. Tunnemann et al. rapporterade att en minsta längd på åtta argininer är avgörande för effektiv cellpenetration av syntetiska polyargininpeptider, baserat på en cellpermeabilitetsstudie utförd med användning av R3 till R12-peptider14. Dessa CPP har dock i allmänhet korta halveringstider i plasma på grund av deras snabba hydrolys in vivo. Dessutom är lite känt om optimering av CPP: s kemiska struktur för att öka deras transbarriärförmåga eftersom det är utmanande att penetrera flera cellmembran15. Således är utvecklingen av nya molekylära transportörer som kan penetrera biologiska barriärer starkt önskvärd för att förbättra läkemedelsleveranseffektiviteten. År 2020 upptäckte Komin et al.16 en CPP som kallas CL-peptid, som innehåller ett helixmotiv (RLLRLLR) och en polyargininsvans (R7) för att korsa epitelmonolagret. En uppsättning CL-peptidvarianter syntetiserades också genom att ändra det spiralformade mönstret. Denna undersökning kan vara en viktig vägledning för utvecklingen av nya CPP för leverans av last över biologiska barriärer. Dessutom optimerade Dietrich et al. cellpermeabiliteten hos StAX-peptiden, vilket hämmade Wnt / β-catenin-signalvägen genom att öka den totala hydrofobiciteten hos peptiderna17.
Konformationsbegränsning av ostrukturerade linjära peptider genom cyklisering är ett effektivt sätt att förbättra deras proteolytiska stabilitet och permeablitet18,19,20. Den strukturella förstärkningen ökar proteasresistensen hos cykliska peptider, vilket gör dem mer stabila in vivo jämfört med deras linjära motsvarigheter. Dessutom kan cykliseringen av peptider potentiellt maskera den polära peptidryggraden genom att främja intramolekylär vätebindning, vilket ökar membranpermeabiliteten hos peptiderna21. Under de senaste två decennierna har kemoselektiva cykliseringsmetoder blivit effektiva strategier för konstruktion av cykliska peptider med olika arkitekturer, såsom allkolväte, laktam, triazol, m-xylen, perfluoraryl och andra tvärbindningar22,23. Den biologiska barriären som införs av den sofistikerade tumörmikromiljön kan minska penetrationen av läkemedel i solida tumörer24. Vi har tidigare funnit att de cykliska CPP: erna visade överlägsen resistens mot enzymatisk nedbrytning jämfört med deras linjära motsvarigheter20. Dessutom är peptidernas totala hydrofobicitet avgörande för deras förbättrade cellpermeabilitet22. Baserat på de studier som diskuterats ovan kan kombinationen av ett positivt laddat mönster, förhöjd total hydrofobicitet och förbättrad proteolysstabilitet antas öka permeabiliteten hos CPP över biologiska barriärer. I en nyligen genomförd studie identifierade vi två cykliska CPP med aromatiska tvärbindningar vid positionerna i och i + 7 som uppvisar förbättrad permeabilitet i tumörceller och vävnader jämfört med deras linjära motsvarigheter15. Här presenteras ett kortfattat syntetiskt protokoll för syntes av fluorescerande märkta cykliska CPP och de viktigaste stegen för att undersöka deras permeabilitet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-ethanedithiol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>K1722093</td>
			<td>stench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU)</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>A-0443697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,4&#39;-bis(bromomethyl)biphenyl</td>
			<td>TCI</td>
			<td>B1921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>4T1 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 &#176;C humidified incubator containing 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile&#160;</td>
			<td>Adamas</td>
			<td>1484971</td>
			<td>toxicity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Energy</td>
			<td>W330229</td>
			<td>skin harmful</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>673811</td>
			<td>flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST038</td>
			<td>skin harmful</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrospray Ionization Mass Spectrometer</td>
			<td>Waters</td>
			<td>G2-S Tof</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CytoFLEX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate isomer (FITC)</td>
			<td>Energy</td>
			<td>E0801812500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axio Observer 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-Arg(Pbf)-OH</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>F-81070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>GLS201115-35202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-&#946;Ala-OH</td>
			<td>Adamas</td>
			<td>51341C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 &#176;C humidified incubator containing 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 1260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Poroshell EC-C18 120, 4.6 &#215; 150 mm (pore size 120 &#197;, particle size 4 &#956;m)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>SP Scientific</td>
			<td>Vir Tis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>9758</td>
			<td>toxicity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter plate</td>
			<td>Thermo &#956;drop plate</td>
			<td>N12391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpholine</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>M99040</td>
			<td>irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-technology microplate reader</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>VARIOSKAN LUX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>E-81416</td>
			<td>irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethyl formamide</td>
			<td>Energy</td>
			<td>B020051</td>
			<td>harmful to skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7321010</td>
			<td>polypropylene chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rink Amide MBHA resin (0.572 mmol/g)</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>GLS180301-49101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-way stopcocks</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7328107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate insert</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>14211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>T63278</td>
			<td>corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>T-0284475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7231</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of cyclic cell-penetrating peptides for enhanced penetration of biological barriers

Cancer har varit en stor utmaning inom global hälsa. Den komplexa tumörmikromiljön begränsar emellertid i allmänhet tillgången till terapeutiska medel till djupare tumörceller, vilket leder till tumöråterfall. För att övervinna den begränsade penetrationen av biologiska barriärer har cellpenetrerande peptider (CPP) upptäckts med utmärkt membrantranslokationsförmåga och har framträtt som användbara molekylära transportörer för att leverera olika laster in i celler. Konventionella linjära CPP uppvisar dock i allmänhet nedsatt proteolytisk stabilitet, vilket begränsar deras permeabilitet över biologiska barriärer. Således är utvecklingen av nya molekylära transportörer som kan penetrera biologiska barriärer och uppvisa förbättrad proteolytisk stabilitet mycket önskvärd för att främja läkemedelsleveranseffektivitet i biomedicinska tillämpningar. Vi har tidigare syntetiserat en panel av korta cykliska CPP med aromatiska tvärbindningar, som uppvisade överlägsen permeabilitet i cancerceller och vävnader jämfört med deras linjära motsvarigheter. Här beskrivs ett kortfattat protokoll för syntesen av den fluorescerande märkta cykliska polyarginin R8-peptiden och dess linjära motsvarighet, samt viktiga steg för att undersöka deras cellpermeabilitet.

I detta protokoll presenterades ett syntetiskt förfarande för att begränsa den linjära polyarginin R8 till dess cykliska form. SPPS utfördes manuellt med hjälp av en enkel apparatur (figur 1). Den detaljerade syntetiska processen för SPPS visas i figur 2. Kortfattat svälldes hartset tillräckligt, följt av avskydd av skyddsgruppen Nα-Mmoc. Därefter förankrades den N-α-Fmoc-skyddade aminosyran på hartset tills peptidenhet...

Watch this Scientific Journal Video about Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers at JoVE.com

Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers

Detta protokoll beskriver syntesen av cykliska cellpenetrerande peptider med aromatiska tvärbindningar och utvärderingen av deras permeabilitet över biologiska barriärer.

Konstruktion av cykliska cellpenetrerande peptider för ökad penetration av biologiska barriärer

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper ...

Ett allvarligt hinder för cancerbehandling är den begränsade tillgången på terapeutiska medel till djupare tumörceller på grund av fysiologiska hinder. Således är utvecklingen av nya molekylära transportörer som kan behandla biologiska barriärer starkt önskvärd för att förbättra läkemedelsleveranseffektiviteten. Syftet med denna procedur är att syntetisera de cykliska cellpenetrerande peptiderna för förbättrad cell-till-cell-penetration.Fördelen med denna metod är att peptidcykliseringen lätt kan uppnås genom substitutionsreaktioner med cystein och harts utan att kräva några metallkatalysatorer. Införlivandet av aromatiska tvärbindningar förbättrar peptidernas totala hydrofobicitet jämfört med de hydrofila laktam- eller triazoltvärbindningarna, vilket förbättrar deras permeabilitet. För att börja, montera den manuella peptidsyntesapparaten i dragskåpet.Placera kranarna med tre kranar på vakuumgrenröret och anslut dem till kväve. Se till att täcka de oanvända inloppen. Fäst en 10-milliliter polypropenkolonn på trevägskranarna och töm reaktionsblandningen eller lösningsmedlen från polypropenkolonnen med en gummipipettlampa eller vakuum via en avfallsfälla.För att förbereda hartset för peptidsyntes, tillsätt 4 till 5 ml DMF till den erforderliga mängden harts och överför det till polypropenkolonnen med mild kvävebubbling i 30 minuter för att svälla hartset tillräckligt. Töm DMF och tillsätt 4 till 5 ml 50% morfolin / DMF till hartset. Bubbla försiktigt kväve i 30 minuter för att avlägsna den N-terminala Mmoc-gruppen och töm sedan blandningen.Tvätta hartset noggrant tre gånger genom att tillsätta 4 till 5 ml DMF till kolonnen och bubbla med kväve i minst 1 minut varje gång. På samma sätt, tvätta hartset med diklormetan tre gånger och DMF tre gånger. Lös sedan upp 648,8 milligram Fmoc och PBF-skyddad arginin och 372,6 milligram HATU i 5 ml DMF i ett centrifugrör.Tillsätt 348,4 mikroliter DIPEA för att aktivera kopplingsreaktionen och överför reaktionsblandningen till polypropenkolonnen med harts. Skaka försiktigt blandningen med kvävebubblande i 1 till 2 timmar och upprepa sedan kopplingsreaktionen en gång. Töm reaktionsblandningen och tvätta hartset sekventiellt med DMF, diklormetan och igen DMF tre gånger vardera i minst 1 minut varje gång.Ta bort den Fmoc-skyddande gruppen och tvätta hartset enligt proceduren som visades tidigare innan du fortsätter att koppla nästa aminosyra. Koppla sedan beta-alanin som en distans för FITC-märkning med samma process som visas för aminosyrakoppling och tillsätt sedan en blandning av FITC, DIPEA och DMF till polypropenkolonnen i mörkret för att utföra FITC-märkning av peptider på hartset. Reaktionen skulle ta nästan 8 timmar.För att utföra cykliseringen av den linjära peptiden, tillsätt en blandning av trifluorättiksyra, triisopropylsilan och diklormetan till polypropenkolonnen i 2 minuter för att selektivt avlägsna den tritylskyddande gruppen cystein. Töm blandningen och upprepa proceduren tills den gulaktiga lösningen blir färglös för att helt avlägsna den tritylskyddande gruppen. Utför sekventiella tvättar av hartset med DMF och diklormetan minst tre gånger och lös upp 4, 4'bis-brommetylbifenyl i DMF med DIPEA.Tillsätt lösningen i kolonnen och reagera i 4 timmar. Tvätta hartset med 4 till 5 ml metanol två gånger i fem minuter vardera och torka det med ett kontinuerligt kväveflöde. För peptider som innehåller cysteiner, behandla hartset med en effektiv klyvningscocktail av trifluorättiksyra, triisopropylsilan och vatten eller trifluorättiksyra, triisopropylsilan, 1, 2-ethanedithiol och vatten.Behandla det peptidbundna hartset i 2 till 3 timmar för att klyva peptiden och avlägsna sedan trifluorättiksyran försiktigt med en kväveström. För att erhålla råpeptiderna, tillsätt 4 till 5 ml dietyleter till det klyvda peptidpreparatet för att fälla ut råpeptiderna och centrifugera vid 10 000 x g i 4 minuter. Kassera försiktigt supernatanten och lufttorka peptiden i 3 minuter i en effektiv dragskåp.Lös upp den småskaliga råpeptiden i 800 mikroliter acetonitril och analysera den sedan med omvänd fas högpresterande vätskekromatografi och vätskekromatografi-masspektrometri. Inokulera 100 000 HeLa-celler i 2 ml DMEM i en 12-brunnskammare med en vävnadsodlingsplatta och inkubera i 24 timmar i en 37 grader Celsius fuktad inkubator innehållande 5% koldioxid. Ta bort mediet och inkubera cellerna i kamrarna med 1 milliliter 10 mikromolar FITC-R8 eller FITC-sR8-4 i FBS-fri DMEM i 1 timme.Därefter avlägsnas mediet som innehåller peptiderna och tvätta cellerna tre gånger med 1 ml PBS. Tillsätt 1 milliliter färsk FBS-fri DMEM till kamrarna och inkubera sedan HeLa-cellerna i kammaren med vävnadsodlingsplattan, med HeLa-cellerna på de runda täckglasen längst ner i 2 timmar. Fixera HeLa-cellerna på de runda täckglasen med 2,5% glutaraldehyd i 15 minuter och färga sedan cellerna med DAPI i 15 minuter.Slutligen observera HeLa-cellerna på täckglasen under ett fluorescensmikroskop. Ett schematiskt diagram över syntesen av FITC-märkt linjär R8-peptid och FITC-märkt häftad R8-peptid presenteras här. HPLC- och MS-spektra för den linjära R8-peptiden och den häftade R8-peptiden visas i denna figur.Retentionstiden för den häftade peptiden var väsentligt längre än för den linjära analogen, vilket indikerar en förbättrad total hydrofobicitet hos peptiden efter cyklisering med den hydrofoba tvärbindningen. Denna grafiska bild representerar stabiliteten hos den linjära peptiden och den häftade peptiden i närvaro av 25% FBS. Den cykliska R8 förblir 77,3% intakt efter inkubation med FBS i 4 timmar, medan dess linjära motsvarighet mestadels försämrades, vilket tyder på förbättrad proteolytisk stabilitet hos den cykliska R8-peptiden.Levande cellfluorescensmikroskopibilder av HeLa-celler och 4T1-celler efter 1 timmes inkubation med 3 mikromolära FITC-märkta linjära R8-peptider och FITC-märkta häftade R8-peptider visas här. Det kan ses att cellerna behandlade med cykliskt R8 med aromatisk tvärbindning uppvisade högre intracellulär fluorescens än de som behandlades med sin linjära motsvarighet. Liknande resultat erhölls med flödescytometrianalys.För att ytterligare undersöka om cykliskt R8 ger förbättrad cell-till-cell-penetration användes transwellmodeller för att simulera peptidernas barriärpermeabilitet från ett cellskikt till ett annat. Den cykliska R8 uppvisade klart högre transbarriärpenetration än den linjära R8-peptiden, vilket indikeras av en signifikant ökning av intracellulär fluorescens. Fullständig avskydd av tritylgruppen cystein och harts är viktigt för följande cykliseringssteg.Dessutom beror cykliseringseffektiviteten också på de specifika sekvenserna och längderna av peptiderna på grund av steriska effekter. I ett sådant fall skulle användning av ett harts med lägre belastningskapacitet eller cyklisering av peptiderna under utspädda koncentrationer i lösningsfas vara till hjälp. Dessa cykliska peptider visade en förbättrad cell-till-cell-permeabilitet jämfört med deras linjära motsvarigheter.Vi tror att de är mycket lovande för att övervinna biologiska barriärer och kommer att användas för en molekylär för vidare tillämpningar inom läkemedelsleverans.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Microwave-assisted Functionalization of Polyethylene glycol and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Mikrovågsassisterad funktionalisering av poly (etylenglykol) och On-harts Peptider för användning i Chain Polymerisationer och Hydrogel Bildning

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Bildning av Beställda Biomolecular Structures av självorganisering av korta peptider

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Preparation of Hydrophobic Metal-Organic Frameworks via Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition of Perfluoroalkanes for the Removal of Ammonia

Beredning av hydrofoba metal-organic frame via Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition av perfluoralkaner för borttagning av ammoniak

Plasma enhanced chemical vapor deposition (PECVD) of perfluoroalkanes has long been studied for tuning the wetting properties of surfaces. For high ...

Preparation of Highly Porous Coordination Polymer Coatings on Macroporous Polymer Monoliths for Enhanced Enrichment of Phosphopeptides

Framställning av mycket porösa samordningspolymerbeläggningar på Makroporösa polymermonoliter för Enhanced Anrikning av fosfopeptider

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous ...

A Filter-based Surface Enhanced Raman Spectroscopic Assay for Rapid Detection of Chemical Contaminants

En filterbaserad yta Enhanced Raman spektroskopiska analys för snabb detektion av kemiska föroreningar

We demonstrate a method to fabricate highly sensitive surface-enhanced Raman spectroscopic (SERS) substrates using a filter syringe system that can be ...

Construction of Models for Nondestructive Prediction of Ingredient Contents in Blueberries by Near-infrared Spectroscopy Based on HPLC Measurements

Konstruktion av modeller för oförstörande Prediction av ingrediens innehåll i blåbär med nära infraröd spektroskopi Baserat på HPLC-mätningar

Nondestructive prediction of ingredient contents of farm products is useful to ship and sell the products with guaranteed qualities. Here, near-infrared ...

Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level

Syntes av cykliska polymerer och karakterisering av deras Diffusiv Motion i smält tillstånd vid enda molekyl nivå

We demonstrate a method for the synthesis of cyclic polymers and a protocol for characterizing their diffusive motion in a melt state at the single ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Insikter Interaktioner av aminosyror och peptider med oorganiska material med hjälp av enda molekyl Force spektroskopi

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Observation and Analysis of Blinking Surface-enhanced Raman Scattering

Observation och analys av blinkande yta-förbättrade Raman spridning

From a single molecule at a silver nanoaggregate junction, blinking surface-enhanced Raman scattering (SERS) is observed. Here, a protocol is presented on ...