Name: construction of cyclic cell-penetrating peptides for enhanced penetration of biological barriers
Uploaded: 2022-09-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers at JoVE.com

Bu çalışma Çin Doğa Bilimleri Vakfı (21708031), Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (BX20180264, 2018M643519) ve Merkezi Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları (2682021ZTPY075) tarafından desteklenmektedir.

1. Ekipman hazırlama
NOT: Çalışan duman davlumbazındaki tüm prosedürleri uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla gerçekleştirin.
<ol><li>Manuel peptit sentez aparatını duman davlumbazına monte edin (Şekil 1). Üç yönlü tapaları (bakınız Malzeme Tablosu) vakum manifolduna yerleştirin (bakınız Malzeme Tablosu) ve nitrojene bağlayın (N2). Kullanılmayan girişleri kapattığınızdan...

<ol>
	<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-targeted+dual+site-selective+functionalized+poly(&#946;-amino+esters)+delivery+platform+for+nerve+regeneration.">Brain-targeted dual site-selective functionalized poly(&#946;-amino esters) delivery platform for nerve regeneration.</a> Nano Letters. 21 (7), 3007-3015 (2021).</li><li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+BBB+permeability+of+osmotically+active+poly(mannitol-co-PEI)+modified+with+rabies+virus+glycoprotein+via+selective+stimulation+of+caveolar+endocytosis+for+RNAi+therapeutics+in+Alzheimer's+disease.">Enhanced BBB permeability of osmotically active poly(mannitol-co-PEI) modified with rabies virus glycoprotein via selective stimulation of caveolar endocytosis for RNAi therapeutics in Alzheimer's disease.</a> Biomaterials. 38, 61-71 (2015).</li><li>Bian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cell-based+intercellular+delivery+of+transcription+factor+GATA4+on+ischemic+cardiomyopathy.">Effect of cell-based intercellular delivery of transcription factor GATA4 on ischemic cardiomyopathy.</a> Circulation Research. 100 (11), 1626-1633 (2007).</li><li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+low+molecular+weight+protamine+chemical+chimera+to+enhance+monomeric+insulin+intestinal+absorption.">The use of low molecular weight protamine chemical chimera to enhance monomeric insulin intestinal absorption.</a> Biomaterials. 34 (31), 7733-7743 (2013).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+STAT3-binding+peptide+exerts+antiproliferative+effects+and+antitumor+activity+by+inhibiting+STAT3+phosphorylation+and+signaling.">A specific STAT3-binding peptide exerts antiproliferative effects and antitumor activity by inhibiting STAT3 phosphorylation and signaling.</a> Cancer Research. 74 (8), 2144-2151 (2014).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEGylated+liposomes+with+NGR+ligand+and+heat-activable+cell-penetrating+peptide-doxorubicin+conjugate+for+tumor-specific+therapy.">PEGylated liposomes with NGR ligand and heat-activable cell-penetrating peptide-doxorubicin conjugate for tumor-specific therapy.</a> Biomaterials. 35 (14), 4368-4381 (2014).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+paclitaxel+delivery+facilitated+by+a+dual-functional+CPP+with+a+hydrophobic+hairpin+tail.">Intracellular paclitaxel delivery facilitated by a dual-functional CPP with a hydrophobic hairpin tail.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (4), 4853-4860 (2021).</li><li>Vasan, N., Baselga, J., Hyman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+on+drug+resistance+in+cancer.">A view on drug resistance in cancer.</a> Nature. 575 (7782), 299-309 (2019).</li><li>Cong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment-induced+in+situ+self-assembly+of+polymer-peptide+conjugates+that+attack+solid+tumors+deeply.">Microenvironment-induced in situ self-assembly of polymer-peptide conjugates that attack solid tumors deeply.</a> Angewandte Chemie International Edition. 131 (14), 4680-4685 (2019).</li><li>Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+nanoparticle+design+for+overcoming+biological+barriers+to+drug+delivery.">Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery.</a> Nature Biotechnology. 33 (9), 941-951 (2015).</li><li>Tian, Y., Zhou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+cell-penetrating+peptides+and+their+functionalization+of+polymeric+nanoplatforms+for+drug+delivery.">Advances in cell-penetrating peptides and their functionalization of polymeric nanoplatforms for drug delivery.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (2), 1-12 (2021).</li><li>Milletti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides:+Classes,+origin,+and+current+landscape.">Cell-penetrating peptides: Classes, origin, and current landscape.</a> Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).</li><li>Turner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptide+conjugates+of+peptide+nucleic+acids+(PNA)+as+inhibitors+of+HIV-1+Tat-dependent+trans-activation+in+cells.">Cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids (PNA) as inhibitors of HIV-1 Tat-dependent trans-activation in cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (21), 6837-6849 (2005).</li><li>Tunnemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+analysis+of+cell+penetration+ability+and+toxicity+of+oligo-arginines.">Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines.</a> Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).</li><li>Shi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stapling+of+short+cell-penetrating+peptides+for+enhanced+tumor+cell-and-tissue+dual-penetration.">Stapling of short cell-penetrating peptides for enhanced tumor cell-and-tissue dual-penetration.</a> Chemical Communications. 58 (14), 2299-2302 (2022).</li><li>Komin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peptide+for+transcellular+cargo+delivery:+Structure-function+relationship+and+mechanism+of+action.">A peptide for transcellular cargo delivery: Structure-function relationship and mechanism of action.</a> Journal of Controlled Release. 324, 633-643 (2020).</li><li>Dietrich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+permeable+stapled+peptide+inhibitor+of+Wnt+signaling+that+targets+&#946;-catenin+protein-protein+interactions.">Cell permeable stapled peptide inhibitor of Wnt signaling that targets &#946;-catenin protein-protein interactions.</a> Cell Chemical Biology. 24 (8), 958-968 (2017).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stapling+of+unprotected+helical+peptides+via+photo-induced+intramolecular+thiol-yne+hydrothiolation.">Stapling of unprotected helical peptides via photo-induced intramolecular thiol-yne hydrothiolation.</a> Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).</li><li>De Araujo, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+&#945;-helicity+of+cyclic+pentapeptides+in+water.">Comparative &#945;-helicity of cyclic pentapeptides in water.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (27), 6965-6969 (2014).</li><li>Chu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+understanding+cell+penetration+by+stapled+peptides.">Towards understanding cell penetration by stapled peptides.</a> Medicinal Chemistry Communications. 6 (1), 111-119 (2015).</li><li>Bock, J. E., Gavenonis, J., Kritzer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+in+shape:+Controlling+peptide+bioactivity+and+bioavailability+using+conformational+constraints.">Getting in shape: Controlling peptide bioactivity and bioavailability using conformational constraints.</a> ACS Chemical Biology. 8 (3), 488-499 (2013).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+stapling+architecture+on+physiochemical+properties+and+cell+permeability+of+stapled+&#945;-helical+peptides:+A+comparative+study.">Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled &#945;-helical peptides: A comparative study.</a> ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).</li><li>White, C. J., Yudin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contemporary+strategies+for+peptide+macrocyclization.">Contemporary strategies for peptide macrocyclization.</a> Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).</li><li>Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+tumor+vasculature:+An+emerging+concept+in+antiangiogenic+therapy.">Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy.</a> Science. 307 (5706), 58-62 (2005).</li><li>Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+synthesis+of+short+&#945;-helices+stabilized+by+the+hydrogen+bond+surrogate+approach.">Solid-phase synthesis of short &#945;-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach.</a> Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).</li><li>Baek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+stapled+p53+peptide+bound+to+Mdm2.">Structure of the stapled p53 peptide bound to Mdm2.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (1), 103-106 (2012).</li><li>Traboulsi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrocyclic+cell+penetrating+peptides:+A+study+of+structure-penetration+properties.">Macrocyclic cell penetrating peptides: A study of structure-penetration properties.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (3), 405-411 (2015).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proline-derived+transannular+N-cap+for+nucleation+of+short+&#945;-helical+peptides.">A proline-derived transannular N-cap for nucleation of short &#945;-helical peptides.</a> Chemical Communications. 52 (59), 9275-9278 (2016).</li><li>Muppidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+proteolytically+stable,+cell-permeable+peptide-based+selective+Mcl-1+inhibitors.">Rational design of proteolytically stable, cell-permeable peptide-based selective Mcl-1 inhibitors.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (36), 14734-14737 (2012).</li><li>Wiradharma, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+cationic+amphiphilic+&#945;-helical+peptides+as+antimicrobial+agents.">Synthetic cationic amphiphilic &#945;-helical peptides as antimicrobial agents.</a> Biomaterials. 32 (8), 2204-2212 (2011).</li><li>Jones, A. T., Sayers, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+entry+of+cell+penetrating+peptides:+Tales+of+tails+wagging+dogs.">Cell entry of cell penetrating peptides: Tales of tails wagging dogs.</a> Journal of Controlled Release. 161 (2), 582-591 (2012).</li></ol>

Konformasyonel kısıtlamalar dahil edilerek peptitlerin kimyasal stabilizasyonunun, peptid26'nın stabilitesini ve hücre geçirgenliğini arttırmak için etkili bir strateji olduğu kanıtlanmıştır. Bu protokolde, siklik CPP'lerin aromatik çapraz bağlarla sentezlenmesi ve biyolojik bariyerler boyunca geçirgenliklerinin değerlendirilmesi için adım adım bir prosedür açıklanmaktadır. Hidrofilik laktam veya triazol çapraz bağları22,27 ile karşılaştırıld...

Son birkaç on yıl, ilaç dağıtımı için hücreye nüfuz eden peptitlerin (CPP'ler) geliştirilmesinde hızlı ilerlemelere tanık olmuştur. CPP'ler, nörolojik bozukluklar 1,2, kalp hastalıkları3, diyabet4, dermatoz5 ve kanser 6,7 dahil olmak üzere hayatı tehdit eden bir dizi hastalığın tedavisinde moleküler taşıyıcılar olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Kanser, yaygın araştırma çabalarına rağmen yüksek morbidite ve mortalite oranının eşlik ettiği küresel bir sağlık yükü olmaya devam etmektedir8. Kanser tedavisinin önündeki ciddi bir engel, kompakt hücre dışı matriks (ECM), anormal tümör vaskülatürü, çoklu membran bariyerleri ve yüksek interstisyel sıvı basıncı (IFP)9 gibi fizyolojik engeller nedeniyle terapötiklerin daha derin tümör hücrelerine sınırlı erişimidir. Bu nedenle, biyolojik engeller üzerinden kargo teslim etme konusunda üstün yeteneğe sahip yeni CPP'ler geliştirmek, kanser tedavisi için temel bir strateji olarak kabul edilir10,11.
CPP'ler fizikokimyasal özellikleri açısından katyonik, amfipatik ve hidrofobik CPP'ler olarak sınıflandırılabilir12. Bunlar arasında, pozitif yüklü HIV-TAT peptidi ve sentetik poliarginin, biyomedikal araştırmalarda büyük önem taşımaktadır ve hücre içi ilaç dağıtımını kolaylaştırmak için kapsamlı bir şekilde incelenmiştir13. Tunnemann ve ark., R3 ila R12 peptitleri14 kullanılarak yapılan bir hücre geçirgenliği çalışmasına dayanarak, sentetik poliarginin peptitlerinin etkili hücre penetrasyonu için minimum sekiz arginin uzunluğunun gerekli olduğunu bildirmiştir. Bununla birlikte, bu CPP'ler genellikle in vivo hızlı hidrolizleri nedeniyle kısa plazma yarı ömrüne sahiptir. Ek olarak, birden fazla hücre zarına nüfuz etmek zor olduğu için trans-bariyer yeteneklerini arttırmak için CPP'lerin kimyasal yapısının optimizasyonu hakkında çok az şey bilinmektedir15. Bu nedenle, biyolojik engellere nüfuz edebilen yeni moleküler taşıyıcıların geliştirilmesi, ilaç dağıtım verimliliğini artırmak için şiddetle arzu edilmektedir. 2020 yılında, Komin ve ark.16 , epitel monokatmanını geçmek için bir sarmal motifi (RLLRLLR) ve bir poliarginin kuyruğu (R7) içeren CL peptid adı verilen bir CPP keşfetti. Bir dizi CL peptid varyantı da sarmal paterni değiştirerek sentezlendi. Bu keşif, biyolojik engeller boyunca kargoların teslimatı için yeni CPP'lerin geliştirilmesi için önemli bir rehber olabilir. Dahası, Dietrich ve ark. StAX peptidinin hücre geçirgenliğini optimize ederek, peptitlerin17'sinin genel hidrofobikliğini artırarak Wnt / β-katenin sinyal yolunu inhibe etti.
Yapılandırılmamış lineer peptitlerin siklizasyon ile konformasyonel kısıtlaması, proteolitik stabilitelerini ve geçirgenliklerini arttırmanın etkili bir yoludur18,19,20. Yapısal takviye, siklik peptitlerin proteaz direncini arttırır ve onları lineer muadillerine kıyasla in vivo olarak daha kararlı hale getirir. Ek olarak, peptitlerin siklizasyonu, molekül içi hidrojen bağını teşvik ederek polar peptid omurgasını potansiyel olarak maskeleyebilir, böylece peptitlerin membran geçirgenliğini artırabilir21. Son yirmi yılda, kemoselektif siklizasyon yöntemleri, tüm hidrokarbon, laktam, triazol, m-ksilen, perfloroaril ve diğer çapraz bağlar gibi farklı mimarilere sahip siklik peptitlerin yapımında etkili stratejiler haline gelmiştir22,23. Sofistike tümör mikroçevresi tarafından dayatılan biyolojik bariyer, katı tümörlerde ilaçların penetrasyonunu azaltabilir24. Daha önce siklik CPP'lerin enzimatik sindirime karşı doğrusal muadillerine göre üstün direnç gösterdiğinibulmuştuk 20. Ayrıca, peptitlerin genel hidrofobikliği, gelişmiş hücre geçirgenlikleri22 için kritik öneme sahiptir. Yukarıda tartışılan çalışmalara dayanarak, pozitif yüklü bir modelin, yüksek genel hidrofobikliğin ve gelişmiş proteoliz stabilitesinin kombinasyonunun, CPP'lerin biyolojik bariyerler boyunca geçirgenliğini arttırdığı hipotezi varsayılabilir. Yakın tarihli bir çalışmada, i ve i + 7 pozisyonlarında aromatik çapraz bağlantılara sahip iki siklik CPP tanımladık, bu da tümör hücrelerinde ve dokularında doğrusal muadillerine kıyasla daha iyi geçirgenlik sergiledi15. Burada, floresan olarak etiketlenmiş siklik CPP'lerin sentezi için kısa bir sentetik protokol ve geçirgenliklerini araştırmak için temel adımlar sunulmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-ethanedithiol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>K1722093</td>
			<td>stench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU)</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>A-0443697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,4&#39;-bis(bromomethyl)biphenyl</td>
			<td>TCI</td>
			<td>B1921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>4T1 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 &#176;C humidified incubator containing 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile&#160;</td>
			<td>Adamas</td>
			<td>1484971</td>
			<td>toxicity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Energy</td>
			<td>W330229</td>
			<td>skin harmful</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>673811</td>
			<td>flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST038</td>
			<td>skin harmful</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrospray Ionization Mass Spectrometer</td>
			<td>Waters</td>
			<td>G2-S Tof</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CytoFLEX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate isomer (FITC)</td>
			<td>Energy</td>
			<td>E0801812500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axio Observer 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-Arg(Pbf)-OH</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>F-81070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>GLS201115-35202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-&#946;Ala-OH</td>
			<td>Adamas</td>
			<td>51341C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 &#176;C humidified incubator containing 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 1260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Poroshell EC-C18 120, 4.6 &#215; 150 mm (pore size 120 &#197;, particle size 4 &#956;m)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>SP Scientific</td>
			<td>Vir Tis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>9758</td>
			<td>toxicity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter plate</td>
			<td>Thermo &#956;drop plate</td>
			<td>N12391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpholine</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>M99040</td>
			<td>irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-technology microplate reader</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>VARIOSKAN LUX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>E-81416</td>
			<td>irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethyl formamide</td>
			<td>Energy</td>
			<td>B020051</td>
			<td>harmful to skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7321010</td>
			<td>polypropylene chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rink Amide MBHA resin (0.572 mmol/g)</td>
			<td>GL Biochem</td>
			<td>GLS180301-49101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-way stopcocks</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7328107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate insert</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>14211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>T63278</td>
			<td>corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane</td>
			<td>HEOWNS</td>
			<td>T-0284475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum manifold</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A7231</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of cyclic cell-penetrating peptides for enhanced penetration of biological barriers

Kanser, küresel sağlıkta büyük bir zorluk olmuştur. Bununla birlikte, karmaşık tümör mikroçevresi genellikle terapötiklerin daha derin tümör hücrelerine erişimini sınırlar ve tümör nüksüne yol açar. Biyolojik bariyerlerin sınırlı penetrasyonunu fethetmek için, mükemmel membran translokasyon kabiliyetine sahip hücre nüfuz eden peptitler (CPP'ler) keşfedilmiş ve çeşitli yükleri hücrelere ulaştırmak için yararlı moleküler taşıyıcılar olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, geleneksel lineer CPP'ler genellikle biyolojik bariyerler boyunca geçirgenliklerini sınırlayan tehlikeye atılmış proteolitik stabilite gösterir. Bu nedenle, biyolojik bariyerlere nüfuz edebilen ve gelişmiş proteolitik stabilite sergileyebilen yeni moleküler taşıyıcıların geliştirilmesi, biyomedikal uygulamalarda ilaç dağıtım verimliliğini artırmak için büyük ölçüde arzu edilmektedir. Daha önce, kanser hücrelerinde ve dokularında doğrusal muadillerine kıyasla üstün geçirgenlik sergileyen aromatik çapraz bağlantılara sahip kısa siklik CPP'lerden oluşan bir panel sentezlemiştik. Burada, floresan olarak etiketlenmiş siklik poliarginin R8 peptidinin ve lineer muadilinin sentezi ve hücre geçirgenliklerini araştırmak için anahtar adımlar için kısa bir protokol açıklanmaktadır.

Bu protokolde, lineer poliarginin R8'i siklik formuna sınırlamak için sentetik bir prosedür sunulmuştur. SPPS, basit bir aparat kullanılarak manuel olarak gerçekleştirildi (Şekil 1). SPPS'nin ayrıntılı sentetik süreci Şekil 2'de gösterilmiştir. Kısaca, reçine yeterince şişirildi, ardından N α-Fmoc koruma grubunun korumasızlaştırılması izledi. Daha sonra, N α-Fmoc korumalı amino asit, peptit tertibatının...

Watch this Scientific Journal Video about Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers at JoVE.com

Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers

Bu protokol, siklik hücreye nüfuz eden peptitlerin aromatik çapraz bağlarla sentezini ve biyolojik bariyerler boyunca geçirgenliklerinin değerlendirilmesini açıklar.

Biyolojik Bariyerlerin Daha İyi Penetrasyonu için Siklik Hücre Nüfuz Eden Peptitlerin Yapımı

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper ...

Kanser tedavisi için ciddi bir engel, fizyolojik engeller nedeniyle terapötiklerin daha derin tümör hücrelerine sınırlı erişimidir. Bu nedenle, biyolojik engelleri tedavi edebilen yeni moleküler taşıyıcıların geliştirilmesi, ilaç dağıtım verimliliğini artırmak için şiddetle arzu edilmektedir. Bu prosedürün amacı, hücreden hücreye penetrasyonu artırmak için siklik hücre penetran peptitleri sentezlemektir.Bu yöntemin avantajı, peptid siklizasyonunun, herhangi bir metal katalizör gerektirmeden sistein ve reçine ile ikame reaksiyonları yoluyla kolayca elde edilebilmesidir. Aromatik çapraz bağların dahil edilmesi, peptitlerin hidrofilik laktam veya triazol çapraz bağlarına kıyasla genel hidrofobikliğini arttırır, böylece geçirgenliklerini arttırır. Başlamak için, manuel peptit sentez aparatını duman davlumbazına monte edin.Üç yönlü durdurucuları vakum manifolduna yerleştirin ve azota bağlayın. Kullanılmayan girişleri kapattığınızdan emin olun. Üç yönlü tapalara 10 mililitrelik bir polipropilen kolon takın ve reaksiyon karışımını veya çözücüleri bir lastik pipet ampulü veya bir atık tutucu vakum kullanarak polipropilen kolondan boşaltın.Reçineyi peptit sentezine hazırlamak için, gerekli reçine miktarına 4 ila 5 mililitre DMF ekleyin ve reçineyi yeterince şişirmek için 30 dakika boyunca hafif azot köpüren polipropilen kolona aktarın. DMF'yi boşaltın ve reçineye 4 ila 5 mililitre% 50 morfolin / DMF ekleyin. N-terminal Fmoc grubunu çıkarmak için azotu 30 dakika boyunca hafifçe kabarcıklandırın ve ardından karışımı boşaltın.Kolona 4 ila 5 mililitre DMF ekleyerek ve her seferinde en az 1 dakika azotla köpürterek reçineyi üç kez iyice yıkayın. Aynı şekilde, reçineyi üç kez diklorometan ve üç kez DMF ile yıkayın. Daha sonra, 648.8 miligram Fmoc ve PBF korumalı arginin ve 372.6 miligram HATU'yu bir santrifüj tüpünde 5 mililitre DMF içinde çözün.Bağlantı reaksiyonunu aktive etmek için 348.4 mikrolitre DIPEA ekleyin ve reaksiyon karışımını reçine ile polipropilen kolona aktarın. Karışımı 1 ila 2 saat boyunca azot köpürmesiyle hafifçe çalkalayın ve ardından kaplin reaksiyonunu bir kez tekrarlayın. Reaksiyon karışımını boşaltın ve reçineyi sırayla DMF, diklorometan ve tekrar DMF ile her seferinde en az 1 dakika boyunca üç kez yıkayın.Fmoc koruyucu grubu çıkarın ve bir sonraki amino asidi çiftleştirmeye devam etmeden önce daha önce gösterilen prosedürü izleyerek reçineyi yıkayın. Daha sonra, amino asit kuplajında gösterilen aynı işlemi kullanarak beta-alanini FITC etiketlemesi için bir ara parça olarak birleştirin ve daha sonra reçine üzerindeki peptitlerin FITC etiketlemesini gerçekleştirmek için karanlıktaki polipropilen kolona FITC, DIPEA ve DMF karışımı ekleyin. Reaksiyon neredeyse 8 saat sürecekti.Lineer peptidin siklizasyonunu gerçekleştirmek için, tritil koruyucu sistein grubunu seçici olarak çıkarmak için polipropilen kolona 2 dakika boyunca trifloroasetik asit, triizopropilsilan ve diklorometan karışımı ekleyin. Karışımı boşaltın ve tritil koruyucu grubu tamamen çıkarmak için sarımsı çözelti renksiz hale gelene kadar prosedürü tekrarlayın. Reçinenin DMF ve diklorometan ile en az üç kez sıralı yıkamalarını yapın ve 4, 4'bis-bromometil-bifenil'i DPEA ile DMF'de çözün.Çözeltiyi sütuna ekleyin ve 4 saat boyunca reaksiyona sürün. Reçineyi her biri beş dakika boyunca iki kez 4 ila 5 mililitre metanol ile yıkayın ve sürekli bir azot akışıyla kurutun. Sistein içeren peptitler için, reçineyi trifloroasetik asit, triizopropilsilan ve su veya trifloroasetik asit, triizopropilsilan 1, 2-etanditiol ve sudan oluşan etkili bir bölünme kokteyli ile tedavi edin.Peptide bağlı reçineyi peptidi bölmek için 2 ila 3 saat boyunca tedavi edin ve ardından trifloroasetik asidi bir azot akışıyla dikkatlice çıkarın. Ham peptitleri elde etmek için, ham peptitleri çökeltmek için parçalanmış peptit preparatına 4 ila 5 mililitre dietil eter ekleyin ve 4 dakika boyunca 10.000 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı dikkatlice atın ve peptidi etkili bir duman davlumbazında 3 dakika boyunca havayla kurutun.Küçük ölçekli ham peptidi 800 mikrolitre asetonitril içinde çözün ve daha sonra ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi ve sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi kullanarak analiz edin. Bir doku kültürü plakası eki ile 12 delikli bir odada 2 mililitre DMEM içinde 100.000 HeLa hücresini aşılayın ve% 5 karbondioksit içeren 37 santigrat derece nemlendirilmiş bir inkübatörde 24 saat boyunca inkübe edin. Ortamı çıkarın ve 1 saat boyunca FBS'siz DMEM'de 1 mililitre 10 mikromolar FITC-R8 veya FITC-sR8-4 ile odalardaki hücreleri inkübe edin.Bundan sonra, peptitleri içeren ortamı çıkarın ve hücreleri 1 mililitre PBS ile üç kez yıkayın. Odalara 1 mililitre taze FBS içermeyen DMEM ekleyin ve daha sonra odadaki HeLa hücrelerini doku kültürü plakası eki ile birlikte inkübe edin, HeLa hücreleri 2 saat boyunca alttaki yuvarlak kapak kaymaları üzerinde tutun. HeLa hücrelerini yuvarlak kapaklara 15 dakika boyunca% 2.5 glutaraldehit ile sabitleyin ve ardından hücreleri 15 dakika boyunca DAPI ile lekeleyin.Son olarak, bir floresan mikroskobu altında kapaklardaki HeLa hücrelerini gözlemleyin. FITC etiketli lineer R8 peptid ve FITC etiketli zımbalanmış R8 peptid sentezinin şematik bir diyagramı burada sunulmaktadır. Lineer R8 peptidinin HPLC ve MS spektrumları ve zımbalanmış R8 peptidi bu şekilde gösterilmiştir.Zımbalanmış peptidin tutma süresi, doğrusal analogunkinden önemli ölçüde daha uzundu, bu da hidrofobik çapraz bağ ile siklizasyondan sonra peptidin genel hidrofobikliğinin arttığını gösteriyordu. Bu grafik görüntü,% 25 FBS varlığında doğrusal peptidin ve zımbalanmış peptidin stabilitesini temsil eder. Siklik R8, FBS ile 4 saat boyunca inkübasyondan sonra% 77.3 oranında bozulmadan kalırken, doğrusal muadili çoğunlukla bozulmuştur, bu da siklik R8 peptidinin proteolitik stabilitesinin arttığını düşündürmektedir.Burada 3 mikromolar FITC etiketli lineer R8 peptid ve FITC etiketli zımbalanmış R8 peptid ile 1 saatlik inkübasyondan sonra HeLa hücrelerinin ve 4T1 hücrelerinin canlı hücre floresan mikroskopi görüntüleri gösterilmektedir. Aromatik çapraz bağlı siklik R8 ile tedavi edilen hücrelerin, lineer muadilleriyle tedavi edilenlerden daha yüksek hücre içi floresan sergilediği görülebilir. Akım sitometri analizi ile de benzer sonuçlar elde edilmiştir.Siklik R8'in gelişmiş hücreden hücreye penetrasyon sağlayıp sağlamadığını daha fazla araştırmak için, peptitlerin bariyer geçirgenliğini bir hücre katmanından diğerine simüle etmek için transwell modelleri kullanıldı. Döngüsel R8, hücre içi floresandaki önemli bir artışla gösterildiği gibi, doğrusal R8 peptidinden daha yüksek bariyer penetrasyonu açıkça sergiledi. Sistein ve reçinenin trityl grubunun tamamen deproteksiyonu, bir sonraki siklizasyon adımı için önemlidir.Ayrıca, döngüselleştirme verimliliği, sterik etkilerden dolayı peptitlerin spesifik dizilerine ve uzunluklarına da bağlıdır. Böyle bir durumda, daha düşük yükleme kapasitesine sahip bir reçine kullanılması veya peptitlerin çözelti fazında seyreltik konsantrasyonlar altında çevrimleştirilmesi yararlı olacaktır. Bu siklik peptitler, doğrusal muadillerine kıyasla gelişmiş bir hücreden hücreye geçirgenlik göstermiştir.Biyolojik engelleri aşmak için büyük umut vaat ettiklerine ve ilaç dağıtımı alanında daha ileri uygulamalar için bir moleküler için kullanılacağına inanıyoruz.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Microwave-assisted Functionalization of Polyethylene glycol and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Mikrodalga destekli Poli işlevselleştirilmesi (etilen glikol) ve zincir polimerizasyonu ve Hidrojel formasyonunda kullanılan On-reçine Peptides

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Kısa Peptidlerinin Self-meclisi tarafından Sıralı Biyomoleküler Yapıların Oluşumu

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Preparation of Hydrophobic Metal-Organic Frameworks via Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition of Perfluoroalkanes for the Removal of Ammonia

Plazma ile Hidrofobik Metal-Organik Altyapıları hazırlanması Amonyak Kaldırma için perfluorobütanlar Kimyasal Buhar Kaplama Geliştirilmiş

Plasma enhanced chemical vapor deposition (PECVD) of perfluoroalkanes has long been studied for tuning the wetting properties of surfaces. For high ...

Preparation of Highly Porous Coordination Polymer Coatings on Macroporous Polymer Monoliths for Enhanced Enrichment of Phosphopeptides

Phosphopeptides Gelişmiş Zenginleştirme için Makrogözenekli Polimer Monoliths üzerinde yüksek Gözenekli Koordinasyon Polymer Coatings Hazırlanması

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous ...

A Filter-based Surface Enhanced Raman Spectroscopic Assay for Rapid Detection of Chemical Contaminants

Kimyasal bulaşanların Hızlı Algılama için Raman Spektroskopisi Tahlili Geliştirilmiş A Filtre tabanlı Yüzey

We demonstrate a method to fabricate highly sensitive surface-enhanced Raman spectroscopic (SERS) substrates using a filter syringe system that can be ...

Construction of Models for Nondestructive Prediction of Ingredient Contents in Blueberries by Near-infrared Spectroscopy Based on HPLC Measurements

HPLC Ölçümleri dayanarak Yakın kızılötesi Spektroskopisi Yaban mersini içinde Hammadde İçeriği tahribatsız Tahmininde Modellerinin İnşaatı

Nondestructive prediction of ingredient contents of farm products is useful to ship and sell the products with guaranteed qualities. Here, near-infrared ...

Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level

Tek Molekül Düzeyde Halkalı Polimerlerin Sentezi ve eritin Devlet Onların Pasif Hareket Karakterizasyonu

We demonstrate a method for the synthesis of cyclic polymers and a protocol for characterizing their diffusive motion in a melt state at the single ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Tek Molekül Kuvvetleri Spektroskopisi kullanarak İnorganik Malzemelerle Amino Asitler ve Peptitler Etkileşimi içine Trendleri

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Observation and Analysis of Blinking Surface-enhanced Raman Scattering

Gözlem ve yüzey gelişmiş Raman saçılması yanıp sönen analizi

From a single molecule at a silver nanoaggregate junction, blinking surface-enhanced Raman scattering (SERS) is observed. Here, a protocol is presented on ...