Name: preparation, characteristics, toxicity, and efficacy evaluation of the nasal self-assembled nanoemulsion tumor vaccine in vitro and in vivo
Uploaded: 2022-09-28T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af nr. 31670938, 32070924, 32000651 af National Natural Science Foundation Program of China, nr. 2014jcyjA0107 og nr. 2019jcyjA-msxmx0159 fra Natural Science Foundation Project Program of Chongqing, nr. 2020XBK24 og nr. 2020XBK26 fra Army Medical University Special projekter og nr. 202090031021 og nr. 202090031035 af National Innovation and Entrepreneurship Program for universitetsstuderende.

Dyreforsøgene blev udført i overensstemmelse med Laboratory Animal-Guideline for ethical review of animal welfare (GB/T 35892-2018) og blev godkendt af Laboratory Animal Welfare and Ethics Committee ved Third Military Medical University. Musene blev aflivet ved en intraperitoneal injektion af 100 mg/kg 1% natriumpentobarbital.
1. Forberedelse af I-OVA NE
<ol><li>Bland 1 mg monophosphoryllipid A (MPLA) med 100 μL DMSO, hvirvel i 5 minutter, og lad det stå i 4 timer ved s...

<ol>
	<li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2020:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).</li><li>Mohammed, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+and+effectiveness+of+the+COVID-19+vaccines+in+reducing+infection,+severity,+hospitalization,+and+mortality:+A+systematic+review.">The efficacy and effectiveness of the COVID-19 vaccines in reducing infection, severity, hospitalization, and mortality: A systematic review.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 18 (1), 2027160 (2022).</li><li>Tsung, K., Norton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+vaccine,+immunological+memory+and+cancer+cure.">In situ vaccine, immunological memory and cancer cure.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 12 (1), 117-119 (2016).</li><li>Abd-Aziz, N., Poh, C. L., Ding, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+peptide-based+vaccines+for+cancer.">Development of peptide-based vaccines for cancer.</a> Journal of Oncology. 2022, 9749363 (2022).</li><li>Mochizuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+antigenic+peptides+complexed+with+beta-glucan+induces+potent+cytotoxic+T-lymphocyte+activity+in+combination+with+CpG-ODNs.">Immunization with antigenic peptides complexed with beta-glucan induces potent cytotoxic T-lymphocyte activity in combination with CpG-ODNs.</a> Journal of Controlled Release. 220, 495-502 (2015).</li><li>Kalita, P., Tripathi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+advances+in+the+design+of+peptide-based+vaccines.">Methodological advances in the design of peptide-based vaccines.</a> Drug Discovery Today. 27 (5), 1367-1380 (2022).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+self-assembled+epitope+peptide+nanoemulsion+vaccine+targeting+nasal+mucosal+epithelial+cell+for+reinvigorating+CD8(+)+T+cell+immune+activity+and+inhibiting+tumor+progression.">A novel self-assembled epitope peptide nanoemulsion vaccine targeting nasal mucosal epithelial cell for reinvigorating CD8(+) T cell immune activity and inhibiting tumor progression.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 183, 1891-1902 (2021).</li><li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OVA-specific+CD8++T+cells+do+not+express+granzyme+B+during+anterior+chamber+associated+immune+deviation.">OVA-specific CD8+ T cells do not express granzyme B during anterior chamber associated immune deviation.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 244 (10), 1315-1321 (2006).</li><li>Suzuki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+hyaluronic+acid-coated+polymeric+micelles+for+nasal+vaccine+delivery.">Preparation of hyaluronic acid-coated polymeric micelles for nasal vaccine delivery.</a> Biomaterials Science. 10 (8), 1920-1928 (2022).</li><li>Georas, S. N., Rezaee, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+barrier+function:+at+the+front+line+of+asthma+immunology+and+allergic+airway+inflammation.">Epithelial barrier function: at the front line of asthma immunology and allergic airway inflammation.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 509-520 (2014).</li><li>Lam, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nasal+omicron+vaccine+booster+elicits+potent+neutralizing+antibody+response+against+emerging+SARS-CoV-2+variants.">A nasal omicron vaccine booster elicits potent neutralizing antibody response against emerging SARS-CoV-2 variants.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 11 (1), 964-967 (2022).</li><li>Chai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+functional+recovery+of+rat+transected+spinal+cord+by+peptide-grafted+PNIPAM+based+hydrogel.">Improved functional recovery of rat transected spinal cord by peptide-grafted PNIPAM based hydrogel.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 210, 112220 (2022).</li><li>Paiva Dos Santos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+purification+and+characterization+of+an+elastin-like+polypeptide+containing+the+Ile-Lys-Val-Ala-Val+(IKVAV)+peptide+for+tissue+engineering+applications.">Production, purification and characterization of an elastin-like polypeptide containing the Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) peptide for tissue engineering applications.</a> Journal of Biotechnology. 298, 35-44 (2019).</li><li>Okur, A. C., Erkoc, P., Kizilel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+cells+via+tumor-homing+peptide+CREKA+functional+PEG+nanoparticles.">Targeting cancer cells via tumor-homing peptide CREKA functional PEG nanoparticles.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 147, 191-200 (2016).</li><li>Makidon, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+evaluation+of+a+novel+nanoemulsion-based+hepatitis+B+mucosal+vaccine.">Pre-clinical evaluation of a novel nanoemulsion-based hepatitis B mucosal vaccine.</a> PLoS One. 3 (8), 2954 (2008).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oil-in-ionic+liquid+nanoemulsion-based+intranasal+delivery+system+for+influenza+split-virus+vaccine.">Oil-in-ionic liquid nanoemulsion-based intranasal delivery system for influenza split-virus vaccine.</a> Journal of Controlled Release. 346, 380-391 (2022).</li><li>O'Konek, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+nanoemulsion+vaccine+confers+long-lasting+immunomodulation+and+sustained+unresponsiveness+in+a+murine+model+of+milk+allergy.">Intranasal nanoemulsion vaccine confers long-lasting immunomodulation and sustained unresponsiveness in a murine model of milk allergy.</a> Allergy. 75 (4), 872-881 (2020).</li><li>Ahmed, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+nanoemulsion+vaccine+induces+mucosal+Interleukin-17+responses+and+confers+protection+upon+Mycobacterium+tuberculosis+challenge+in+mice.">A novel nanoemulsion vaccine induces mucosal Interleukin-17 responses and confers protection upon Mycobacterium tuberculosis challenge in mice.</a> Vaccine. 35 (37), 4983-4989 (2017).</li><li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+systemic+and+mucosal+immunity+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+infection+by+a+novel+nanoemulsion+adjuvant+vaccine.">Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated-macrophage-membrane-coated+nanoparticles+for+improved+photodynamic+immunotherapy.">Tumor-associated-macrophage-membrane-coated nanoparticles for improved photodynamic immunotherapy.</a> Nano Letters. 21 (13), 5522-5531 (2021).</li><li>Prasanna, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+nanoscale+drug+delivery+and+the+future+of+nano-vaccine+development+for+leishmaniasis+-+A+review.">Current status of nanoscale drug delivery and the future of nano-vaccine development for leishmaniasis - A review.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 141, 111920 (2021).</li><li>George, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+defects+on+plate-shaped+silver+nanoparticles+contribute+to+its+hazard+potential+in+a+fish+gill+cell+line+and+zebrafish+embryos.">Surface defects on plate-shaped silver nanoparticles contribute to its hazard potential in a fish gill cell line and zebrafish embryos.</a> ACS Nano. 6 (5), 3745-3759 (2012).</li><li>Jafari Eskandari, M., Gostariani, R., Asadi Asadabad, M., Singh, D., Condurache-Bota, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+Electron+Microscopy+of+Nanomaterials.">Transmission Electron Microscopy of Nanomaterials.</a> Electron Crystallography. , (2020).</li><li>Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+nanoindentation+method+on+collagen+fibrils.">Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils.</a> Materials. 15 (7), 2477 (2022).</li><li>Zielinska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+nanoparticles:+Production,+characterization,+toxicology+and+ecotoxicology.">Polymeric nanoparticles: Production, characterization, toxicology and ecotoxicology.</a> Molecules. 25 (16), 3731 (2020).</li><li>Doncom, K. E. B., Blackman, L. D., Wright, D. B., Gibson, M. I., O'Reilly, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersity+effects+in+polymer+self-assemblies:+A+matter+of+hierarchical+control.">Dispersity effects in polymer self-assemblies: A matter of hierarchical control.</a> Chemical Society Reviews. 46 (14), 4119-4134 (2017).</li><li>Pei, M., Li, H., Zhu, Y., Lu, J., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evidence+of+oncofetal+antigen+and+TLR-9+agonist+co-delivery+by+alginate+nanovaccines+for+liver+cancer+immunotherapy.">In vitro evidence of oncofetal antigen and TLR-9 agonist co-delivery by alginate nanovaccines for liver cancer immunotherapy.</a> Biomaterials Science. 10 (11), 2865-2876 (2022).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Titanium+dioxide+nanoparticles+induced+reactive+oxygen+species+(ROS)+related+changes+of+metabolomics+signatures+in+human+normal+bronchial+epithelial+(BEAS-2B)+cells.">Titanium dioxide nanoparticles induced reactive oxygen species (ROS) related changes of metabolomics signatures in human normal bronchial epithelial (BEAS-2B) cells.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 444, 116020 (2022).</li><li>Kumar, V., Sharma, N., Maitra, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+toxicity+assessment+of+nanoparticles.">In vitro and in vivo toxicity assessment of nanoparticles.</a> International Nano Letters. 7 (4), 243-256 (2017).</li><li>Tong, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunopotentiator,+ophiopogonin+D,+encapsulated+in+a+nanoemulsion+as+a+robust+adjuvant+to+improve+vaccine+efficacy.">An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy.</a> Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).</li><li>Elliott, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy:+Principles+and+modern+practices.">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).</li><li>Huang, Y., Zou, Y., Lin, L., Zheng, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ginsenoside+Rg1+activates+dendritic+cells+and+acts+as+a+vaccine+adjuvant+inducing+protective+cellular+responses+against+lymphomas.">Ginsenoside Rg1 activates dendritic cells and acts as a vaccine adjuvant inducing protective cellular responses against lymphomas.</a> DNA and Cell Biology. 36 (12), 1168-1177 (2017).</li></ol>

Nanovacciner funktionaliseret med immunocytmembraner har store fordele ved sygdomsmålrettet terapi, og bivirkningerne minimeres af egenskaber som unik tumortropisme, identifikation af specifikke mål, langvarig cirkulation, forbedrede intercellulære interaktioner og lav systemisk toksicitet. De kan også let integreres med andre behandlingsmoduler til behandling af kræft i samarbejde16,20. Ønskelige egenskaber kan opnås ved at kontrollerefysiske og kemiske e...

Som en af de mest kritiske innovationer inden for folkesundhed spiller vacciner en central rolle i bekæmpelsen af den globale byrde af sygdommehos mennesker 1. F.eks. testes der i øjeblikket mere end 120 kandidatvacciner mod covid-19-sygdomme, hvoraf nogle er blevet godkendt i mange lande2. Nylige rapporter siger, at kræftvacciner effektivt har forbedret fremskridtene med kliniske kræftbehandlinger, fordi de leder kræftpatienters immunsystem til at genkende antigener som fremmede for kroppen3. Desuden kan flere T-celleepitoper placeret inden for eller uden for tumorceller bruges til at designe peptidvacciner, som har vist fordele ved behandling af metastatiske kræftformer på grund af manglen på den signifikante toksicitet forbundet med strålebehandling og kemoterapi 4,5. Siden midten af 1990'erne er prækliniske og kliniske forsøg med tumorbehandling hovedsageligt blevet udført ved hjælp af antigenpeptidvacciner, men få vacciner udviser en tilstrækkelig terapeutisk effekt på kræftpatienter6. Desuden har kræftvacciner med peptidepitoper dårlig immunogenicitet og utilstrækkelig leveringseffektivitet, hvilket kan skyldes den hurtige nedbrydning af ekstracellulære peptider, der diffunderer hurtigt fra administrationsstedet, hvilket fører til utilstrækkelig antigenoptagelse af immunceller7. Derfor er det nødvendigt at overvinde disse hindringer med vaccineleveringsteknologi.
OVA 257-264, MHC klasse I-bindende257-264 epitop udtrykt som et fusionsprotein, er en hyppigt anvendt model epitop8. Derudover er OVA257-264 afgørende for det adaptive immunrespons mod tumorer, som afhænger af det cytotoksiske T-lymfocytrespons (CTL). Det medieres af antigenspecifikke CD8 + T-celler i tumoren, som induceres af OVA257-264-peptidet . Det er kendetegnet ved utilstrækkelig granzym B, som frigives af cytotoksiske T-celler, hvilket fører til apoptose af målceller8. Imidlertid kan fri OVA257-264 peptidadministration inducere lidt CTL-aktivitet, fordi optagelsen af disse antigener forekommer i uspecifikke celler snarere end antigenpræsenterende celler (APC'er). Manglen på passende immunstimulering resulterer i CTL-aktivitet5. Derfor kræver induktion af effektiv CTL-aktivitet betydelige fremskridt.
På grund af barrieren fra epitelceller og den kontinuerlige udskillelse af slim fjernes vaccineantigener hurtigt fra næseslimhinden 9,10. Udvikling af en effektiv vaccinevektor, der kan passere gennem slimhindevævet, er afgørende, fordi de antigenpræsenterende celler er placeret under slimhindepitelet9. Intranasal injektion af vacciner inducerer teoretisk slimhindeimmunitet for at bekæmpe slimhindeinfektion11. Derudover er nasal levering en effektiv og sikker administrationsmetode til vacciner på grund af dens bekvemmelighed, undgåelse af tarmadministration og forbedret patientoverensstemmelse7. Derfor er nasal levering et godt administrationsmiddel til den nye peptidepitop nanovaccine.
Flere syntetiske biomaterialer er blevet udtænkt til at kombinere epitoper af celle-væv og celle-celle interaktioner. Visse bioaktive proteiner, såsom Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), er blevet introduceret som en del af hydrogelens struktur for at give bioaktivitet12. Dette peptid bidrager sandsynligvis til cellebinding, migration og udvækst13 og binder integriner α 3β1 ogα 6β1 til at interagere med forskellige kræftcelletyper. IKVAV er et celleadhæsionspeptid afledt af lamininkældermembranproteinet α1-kæden, der oprindeligt blev brugt til at modellere det neurale mikromiljø og forårsage neuronal differentiering14. Derfor er det vigtigt at finde et effektivt leveringsmiddel til denne nye vaccine for sygdomsbekæmpelse.
Nyligt rapporterede emulsionssystemer, såsom W805EC og MF59, er også blevet sammensat til levering af næsehulen af inaktiveret influenzavaccine eller rekombinant hepatitis B-overfladeantigen og illustreret til at udløse både slimhinde og systemisk immunitet15. Nanoemulsioner (NE'er) har fordelene ved nem administration og bekvem co-formation med effektive adjuvanser sammenlignet med partikelslimhindeafgivelsessystemer16. Nanoemulsionsvacciner er blevet rapporteret at ændre den allergiske fænotype på en vedvarende måde, der adskiller sig fra traditionel desensibilisering, hvilket resulterer i langsigtede undertrykkende virkninger17. Andre rapporterede, at nanoemulsioner kombineret med Mtb-specifikke immunodominant antigener kunne inducere potente slimhindecelleresponser og give betydelig beskyttelse18. Derfor blev en ny intranasal selvsamlet nanovaccine med det syntetiske peptid IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, peptidet bestående af IKVAV bundet til OVA257-264) designet. Det er vigtigt at vurdere denne nye nanovaccine systematisk.
Formålet med denne protokol er systematisk at evaluere nanovaccinens fysisk-kemiske egenskaber, toksicitet og stabilitet, påvise, om antigenoptagelse og beskyttende og terapeutiske virkninger forbedres ved hjælp af tekniske midler, og uddybe det vigtigste eksperimentelle indhold. I denne undersøgelse etablerede vi en række protokoller til at studere de fysisk-kemiske egenskaber og stabilitet, bestemme størrelsen af toksiciteten af I-OVA NE til BEAS-2B-celler af CCK-8 og observere BEAS-2B-cellernes antigenpræsenterende evne til vaccinen ved hjælp af konfokal mikroskopi, evaluere frigivelsesprofilerne for denne nye nanovaccine in vivo og in vitroog detektere den beskyttende og terapeutiske virkning af denne vaccine ved hjælp af en E.G7-OVA tumorbærende musemodel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning Incorporated, USA</td>
			<td>CLS3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad 6.0 microplate reader</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA</td>
			<td>&#160;Bio-Rad 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK-8 kits</td>
			<td>Dojindo, Japan</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>5811000398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone (Life Technology, USA)</td>
			<td>SH30088.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-labeled I-OVA</td>
			<td>Shanghai Botai 
			Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HF 90/240 Incubator</td>
			<td>Heal Force, Switzerland</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC&#160;</td>
			<td>Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd.</td>
			<td>E2695</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon,Japan</td>
			<td>DSZ5000X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPC-208</td>
			<td>Chong Qing University, China</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS system&#160;</td>
			<td>Caliper Life Science Limited Company</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1230 TEM</td>
			<td>JEOL Limited Company of Japan</td>
			<td>1230 TEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern NANO ZS</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd., UK</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPLA</td>
			<td>&#160;Invivogen 
			Lit. Co.</td>
			<td>tlrl-mpla</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin Sulfate Ointment</td>
			<td>Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd.</td>
			<td>H31022262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVA257&#8211;264</td>
			<td>Shanghai Botai 
			Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Hyclone (Life Technology, USA)</td>
			<td>SH30809.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA</td>
			<td>Shanghai Botai 
			Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td>Zeiss LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation, characteristics, toxicity, and efficacy evaluation of the nasal self-assembled nanoemulsion tumor vaccine in vitro and in vivo

Epitoppeptider har tiltrukket sig udbredt opmærksomhed inden for tumorvacciner på grund af deres sikkerhed, høje specificitet og bekvemme produktion; især kan nogle MHC I-begrænsede epitoper inducere effektiv cytotoksisk T-lymfocytaktivitet for at rydde tumorceller. Derudover er nasal administration en effektiv og sikker leveringsteknik til tumorvacciner på grund af dens bekvemmelighed og forbedrede patientoverholdelse. Imidlertid er epitoppeptider uegnede til nasal levering på grund af deres dårlige immunogenicitet og manglende leveringseffektivitet. Nanoemulsioner (NE'er) er termodynamisk stabile systemer, der kan fyldes med antigener og leveres direkte til næseslimhindens overflade. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) er kernen pentapeptid af laminin, et integrinbindende peptid udtrykt af humane respiratoriske epitelceller. I denne undersøgelse blev en intranasal selvmonteret epitoppeptid NE tumorvaccine indeholdende det syntetiske peptid IKVAV-OVA257-264 (I-OVA ) fremstillet ved en lavenergiemulgeringsmetode. Kombinationen af IKVAV og OVA257-264 kan øge antigenoptagelsen i næseslimhindeepitelceller. Her etablerer vi en protokol til undersøgelse af de fysisk-kemiske egenskaber ved transmissionselektronmikroskopi (TEM), atomkraftmikroskopi (AFM) og dynamisk lysspredning (DLS); stabilitet i nærvær af mucinprotein; toksicitet ved undersøgelse af cellelevedygtigheden af BEAS-2B-celler og næse- og lungevæv hos C57BL/6-mus cellulær optagelse ved konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM); frigivelsesprofiler ved at afbilde små dyr in vivo og vaccinens beskyttende og terapeutiske virkning ved hjælp af en E.G7 tumorbærende model. Vi forventer, at protokollen vil give tekniske og teoretiske fingerpeg om den fremtidige udvikling af nye T-celleepitoppeptidslimhindevacciner.

I henhold til protokollen afsluttede vi forberedelsen og in vitro og in vivo eksperimentel evaluering af nasal tumor nanovaccine levering. TEM, AFM og DLS er effektive midler til vurdering af de grundlæggende egenskaber ved overfladezetapotentialet og nanovaccinens partikelstørrelse (figur 1). BEAS-2B epitelceller er en nyttig screeningsmodel til in vitro toksicitetstest af nasale vacciner (figur 2A). Mikrofotografierne farvet med H&...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo

Her præsenterer vi detaljerede metoder til fremstilling og evaluering af den nasale selvmonterede nanoemulsionstumorvaccine in vitro og in vivo.

Forberedelse, egenskaber, toksicitet og effektivitetsevaluering af den nasale selvmonterede nanoemulsionstumorvaccine in vitro og in vivo

Epitope peptides have attracted widespread attention in the field of tumor vaccines because of their safety, high specificity, and convenient production; ...

Ny nanoemulsionsvaccine har store fordele i sygdomstaktisk terapi. Disse sæt effekter minimeres af egenskaber som unik tumor chopism, identifikation af specifikke taktikker, og lav systemisk toksicitet. Vi forventer, at protokollen vil give tekniske og teoretiske fingerpeg om den fremtidige udvikling af nye T-celle ectype peptid slimhindevacciner.Begynd med at blande et milligram monophosphorollipid A med 100 mikroliter DMSO. Vortex i fem minutter og lad det opløses i fire timer ved stuetemperatur. Tilføj kvantitativt TWEEN 80 og I-OVA.Bland komponenterne og tilsæt squalen. Derefter tilsættes 100 mikroliter MPLA-opløsning til den fremstillede blanding. For at forberede nanoemulsionsvaccinen tilsættes den blandede opløsning til vanddråber ved ca. 70% af det samlede volumen og omrøres forsigtigt for at opnå en gennemsigtig og let flydende blanding.For in vitro-assays skal du starte med at genoplive BEAS2B-epitelcellerne. Tænd for vandbadet og juster temperaturen til 37 grader Celsius. Optø de frosne cellehætteglas hurtigt i et vandbad, hærdet ved 37 grader Celsius.Efter optøning pipetteres cellerne hurtigt i et 15 ml sterilt centrifugerør og tilsættes to ml af det komplette vækstmedium. Centrifuger røret ved 129 G i fem minutter. Fjern supinatanten og resuspender cellerne i to ml af det komplette vækstmedium.Efter centrifugering af cellerne igen, fjern supinatanten og tilsæt seks ml komplet vækstmedium for at resuspendere cellerne. Derefter overføres cellerne til en T25-kulturkolbe og inkuberes ved 37 grader Celsius i en 5% kuldioxidinkubator. Når celletætheden når 80% til 90%, kasseres dyrkningsmediet og vaskes cellerne to gange med to ml PBS.Tilsæt en milliliter 0,25%tripsin for at fordøje cellerne i et til to minutter. Når afrunding af cellerne observeres, tilsættes straks fire ml af det komplette vækstmedium for at neutralisere trypsinet. Bland og aspirer prøverne i et 15 ml sterilt centrifugeglas.Prøverne centrifugeres ved 129 G i fem minutter. Fjern supinatanten og resuspender cellerne i en milliliter RPMI 1640 komplet medium. Brug 20 mikroliter af cellesuspensionen til celletælling og fortynd cellerne til en gange 10 til de femte celler pr. Milliliter.Derefter plades BEAS2B-cellerne med en densitet på en gange 10 til den fjerde celle pr. brønd i 96 brøndplader i 100 mikroliter RPMI 1640 komplet medium, og præinkuber pladerne i 24 timer som tidligere vist. Ved afslutningen af inkubationen kasseres supinatanten og tilsættes 100 mikroliter RPMI 1640 til hver brønd på 96-brøndpladen. Tilsæt 100 mikroliter hver af I-OVA nanoemulsion, I-OVA blandet med BNE og I-OVA forfortyndet med et komplet vækstmedium ved forskellige endelige koncentrationer med BNE som kontrol og inkuber i 24 timer ved 37 grader Celsius.Når inkubationen er afsluttet, skal du fjerne mediet og overføre pladen til et mørkt sted. Tilsæt 90 mikroliter komplet vækstmedium og 10 mikroliter CCK8-opløsning til hver brønd på pladen. Inkuber pladen i to timer ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid.Mål absorbansen af hver brønd ved 450 nanometer ved hjælp af en enzymmærket pladelæser. Brug 10 mikroliter pipettespidser til at udføre nasal immunisering af musene med I-OVA, I-OVA plus BNE og I-OVA NE i tre dage. Brug BNE og PBA som eksperimentel kontrol.Skær derefter ca. tre millimeter tykke prøver af næsevæv med en saks og læg dem i 4% paraformaldehyd. Fjern lungevævet og fastgør næse- og hele lungevævet i 4% paraformaldehyd i 24 timer. TEM og AFM anvendes til vurdering af grundlæggende egenskaber ved overfladezetapotentialet og nanovaccinens partikelstørrelse.Partikelstørrelser, polydispersitetsindekser, zetapotentialer og elektroforesemobilitet af I-OVA NE i musinstabilitetsanalyser vises. Den relative levedygtighed af BEAS2B-celler er mere end 80% i kulturer udsat for forskellige peptidkoncentrationer af I-OVA, BNE + I-OVA og I-OVA NE i 24 timer. I-OVA EN-gruppen havde ingen åbenlys slimhindetoksicitet, vævsskade, blødning eller inflammatorisk celleinfiltration.Epitelcellerne BEAS2B fangede mere FITC-mærket I-OVA NE end dens vandopløsning. Den vedvarende frigivelseseffekt af I-OVA NE in vitro blev analyseret ved hjælp af IV-IS-systemet. I-OVA NE-vaccinen havde en vedvarende frigivelseseffekt sammenlignet med den vandige opløsning af I-OVA.I I-OVA NE-gruppen er den procentvise overlevelsestid højere sammenlignet med andre grupper, og tumorvolumenet var signifikant mindre, hvilket tyder på, at det har en bedre forebyggende beskyttelseseffekt end de andre grupper. I den terapeutiske model var medianoverlevelsestiden signifikant forskellig mellem forskellige grupper. Tumorvolumenet i I-OVA NE-gruppen var signifikant mindre end i I-OVA-gruppen.Omrøring af blandingen jævnt er vigtig i denne procedure. Ellers vil det reducere effektiviteten af nanovacciner.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Brug af kunstig Sputum Medium til Test antibiotikum Effekt mod<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I forhold mere relevante for cystisk fibrose Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Fremstilling af rekombinant arenavirus for Vaccine Development i FDA-godkendte Vero celler

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

Et restriktionsenzym Baseret Kloning metode til at vurdere den<em&gt; In vitro</em&gt; Replikationskapacitet af HIV-1 subtype C Gag-MJ4 Kimære Vira

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In vitro analyse af MyD88-medieret Cellular immunrespons til West Nile Virus mutantstamme Infektion

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Evaluering af effekt og toksicitet af RNA Målretning HIV-1 Produktion til brug i Gene eller Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Kvantificering af humane monocyt Chemotaxis In Vitro og Murine lymfocyt handel In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Evaluering af vært-patogen svar og Vaccine effekt i mus

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

In Vitro ELISA test til vurdering af rabiesvaccine potens

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...