Name: preparation, characteristics, toxicity, and efficacy evaluation of the nasal self-assembled nanoemulsion tumor vaccine in vitro and in vivo
Uploaded: 2022-09-28T13:40:00
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Cette étude a été soutenue par les projets spéciaux n ° 31670938, 32070924, 32000651 du programme de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine, n ° 2014jcyjA0107 et n ° 2019jcyjA-msxmx0159 du programme de projet de la Fondation des sciences naturelles de Chongqing, n ° 2020XBK24 et n ° 2020XBK26 des projets spéciaux de l’Université médicale de l’armée, et n ° 202090031021 et n ° 202090031035 du programme national d’innovation et d’entrepreneuriat pour les étudiants.

Les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux lignes directrices sur les animaux de laboratoire pour l’examen éthique du bien-être animal (GB / T 35892-2018) et ont été approuvées par le Comité du bien-être et de l’éthique des animaux de laboratoire de la troisième Université médicale militaire. Les souris ont été euthanasiées par injection intrapéritonéale de 100 mg/kg de pentobarbital sodique à 1 %.
1. Préparation de l’I-OVA NE</...

<ol>
	<li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2020:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).</li><li>Mohammed, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+and+effectiveness+of+the+COVID-19+vaccines+in+reducing+infection,+severity,+hospitalization,+and+mortality:+A+systematic+review.">The efficacy and effectiveness of the COVID-19 vaccines in reducing infection, severity, hospitalization, and mortality: A systematic review.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 18 (1), 2027160 (2022).</li><li>Tsung, K., Norton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+vaccine,+immunological+memory+and+cancer+cure.">In situ vaccine, immunological memory and cancer cure.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 12 (1), 117-119 (2016).</li><li>Abd-Aziz, N., Poh, C. L., Ding, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+peptide-based+vaccines+for+cancer.">Development of peptide-based vaccines for cancer.</a> Journal of Oncology. 2022, 9749363 (2022).</li><li>Mochizuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+antigenic+peptides+complexed+with+beta-glucan+induces+potent+cytotoxic+T-lymphocyte+activity+in+combination+with+CpG-ODNs.">Immunization with antigenic peptides complexed with beta-glucan induces potent cytotoxic T-lymphocyte activity in combination with CpG-ODNs.</a> Journal of Controlled Release. 220, 495-502 (2015).</li><li>Kalita, P., Tripathi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+advances+in+the+design+of+peptide-based+vaccines.">Methodological advances in the design of peptide-based vaccines.</a> Drug Discovery Today. 27 (5), 1367-1380 (2022).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+self-assembled+epitope+peptide+nanoemulsion+vaccine+targeting+nasal+mucosal+epithelial+cell+for+reinvigorating+CD8(+)+T+cell+immune+activity+and+inhibiting+tumor+progression.">A novel self-assembled epitope peptide nanoemulsion vaccine targeting nasal mucosal epithelial cell for reinvigorating CD8(+) T cell immune activity and inhibiting tumor progression.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 183, 1891-1902 (2021).</li><li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OVA-specific+CD8++T+cells+do+not+express+granzyme+B+during+anterior+chamber+associated+immune+deviation.">OVA-specific CD8+ T cells do not express granzyme B during anterior chamber associated immune deviation.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 244 (10), 1315-1321 (2006).</li><li>Suzuki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+hyaluronic+acid-coated+polymeric+micelles+for+nasal+vaccine+delivery.">Preparation of hyaluronic acid-coated polymeric micelles for nasal vaccine delivery.</a> Biomaterials Science. 10 (8), 1920-1928 (2022).</li><li>Georas, S. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nasal+omicron+vaccine+booster+elicits+potent+neutralizing+antibody+response+against+emerging+SARS-CoV-2+variants.">A nasal omicron vaccine booster elicits potent neutralizing antibody response against emerging SARS-CoV-2 variants.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 11 (1), 964-967 (2022).</li><li>Chai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+functional+recovery+of+rat+transected+spinal+cord+by+peptide-grafted+PNIPAM+based+hydrogel.">Improved functional recovery of rat transected spinal cord by peptide-grafted PNIPAM based hydrogel.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 210, 112220 (2022).</li><li>Paiva Dos Santos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+purification+and+characterization+of+an+elastin-like+polypeptide+containing+the+Ile-Lys-Val-Ala-Val+(IKVAV)+peptide+for+tissue+engineering+applications.">Production, purification and characterization of an elastin-like polypeptide containing the Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) peptide for tissue engineering applications.</a> Journal of Biotechnology. 298, 35-44 (2019).</li><li>Okur, A. C., Erkoc, P., Kizilel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+cells+via+tumor-homing+peptide+CREKA+functional+PEG+nanoparticles.">Targeting cancer cells via tumor-homing peptide CREKA functional PEG nanoparticles.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 147, 191-200 (2016).</li><li>Makidon, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+evaluation+of+a+novel+nanoemulsion-based+hepatitis+B+mucosal+vaccine.">Pre-clinical evaluation of a novel nanoemulsion-based hepatitis B mucosal vaccine.</a> PLoS One. 3 (8), 2954 (2008).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oil-in-ionic+liquid+nanoemulsion-based+intranasal+delivery+system+for+influenza+split-virus+vaccine.">Oil-in-ionic liquid nanoemulsion-based intranasal delivery system for influenza split-virus vaccine.</a> Journal of Controlled Release. 346, 380-391 (2022).</li><li>O'Konek, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+nanoemulsion+vaccine+confers+long-lasting+immunomodulation+and+sustained+unresponsiveness+in+a+murine+model+of+milk+allergy.">Intranasal nanoemulsion vaccine confers long-lasting immunomodulation and sustained unresponsiveness in a murine model of milk allergy.</a> Allergy. 75 (4), 872-881 (2020).</li><li>Ahmed, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+nanoemulsion+vaccine+induces+mucosal+Interleukin-17+responses+and+confers+protection+upon+Mycobacterium+tuberculosis+challenge+in+mice.">A novel nanoemulsion vaccine induces mucosal Interleukin-17 responses and confers protection upon Mycobacterium tuberculosis challenge in mice.</a> Vaccine. 35 (37), 4983-4989 (2017).</li><li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+systemic+and+mucosal+immunity+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+infection+by+a+novel+nanoemulsion+adjuvant+vaccine.">Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated-macrophage-membrane-coated+nanoparticles+for+improved+photodynamic+immunotherapy.">Tumor-associated-macrophage-membrane-coated nanoparticles for improved photodynamic immunotherapy.</a> Nano Letters. 21 (13), 5522-5531 (2021).</li><li>Prasanna, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+nanoscale+drug+delivery+and+the+future+of+nano-vaccine+development+for+leishmaniasis+-+A+review.">Current status of nanoscale drug delivery and the future of nano-vaccine development for leishmaniasis - A review.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 141, 111920 (2021).</li><li>George, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+defects+on+plate-shaped+silver+nanoparticles+contribute+to+its+hazard+potential+in+a+fish+gill+cell+line+and+zebrafish+embryos.">Surface defects on plate-shaped silver nanoparticles contribute to its hazard potential in a fish gill cell line and zebrafish embryos.</a> ACS Nano. 6 (5), 3745-3759 (2012).</li><li>Jafari Eskandari, M., Gostariani, R., Asadi Asadabad, M., Singh, D., Condurache-Bota, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+Electron+Microscopy+of+Nanomaterials.">Transmission Electron Microscopy of Nanomaterials.</a> Electron Crystallography. , (2020).</li><li>Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+nanoindentation+method+on+collagen+fibrils.">Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils.</a> Materials. 15 (7), 2477 (2022).</li><li>Zielinska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+nanoparticles:+Production,+characterization,+toxicology+and+ecotoxicology.">Polymeric nanoparticles: Production, characterization, toxicology and ecotoxicology.</a> Molecules. 25 (16), 3731 (2020).</li><li>Doncom, K. E. B., Blackman, L. D., Wright, D. B., Gibson, M. I., O'Reilly, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersity+effects+in+polymer+self-assemblies:+A+matter+of+hierarchical+control.">Dispersity effects in polymer self-assemblies: A matter of hierarchical control.</a> Chemical Society Reviews. 46 (14), 4119-4134 (2017).</li><li>Pei, M., Li, H., Zhu, Y., Lu, J., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evidence+of+oncofetal+antigen+and+TLR-9+agonist+co-delivery+by+alginate+nanovaccines+for+liver+cancer+immunotherapy.">In vitro evidence of oncofetal antigen and TLR-9 agonist co-delivery by alginate nanovaccines for liver cancer immunotherapy.</a> Biomaterials Science. 10 (11), 2865-2876 (2022).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Titanium+dioxide+nanoparticles+induced+reactive+oxygen+species+(ROS)+related+changes+of+metabolomics+signatures+in+human+normal+bronchial+epithelial+(BEAS-2B)+cells.">Titanium dioxide nanoparticles induced reactive oxygen species (ROS) related changes of metabolomics signatures in human normal bronchial epithelial (BEAS-2B) cells.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 444, 116020 (2022).</li><li>Kumar, V., Sharma, N., Maitra, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+toxicity+assessment+of+nanoparticles.">In vitro and in vivo toxicity assessment of nanoparticles.</a> International Nano Letters. 7 (4), 243-256 (2017).</li><li>Tong, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunopotentiator,+ophiopogonin+D,+encapsulated+in+a+nanoemulsion+as+a+robust+adjuvant+to+improve+vaccine+efficacy.">An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy.</a> Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).</li><li>Elliott, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy:+Principles+and+modern+practices.">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).</li><li>Huang, Y., Zou, Y., Lin, L., Zheng, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ginsenoside+Rg1+activates+dendritic+cells+and+acts+as+a+vaccine+adjuvant+inducing+protective+cellular+responses+against+lymphomas.">Ginsenoside Rg1 activates dendritic cells and acts as a vaccine adjuvant inducing protective cellular responses against lymphomas.</a> DNA and Cell Biology. 36 (12), 1168-1177 (2017).</li></ol>

Les nanovaccins fonctionnalisés avec des membranes immunocytaires présentent de grands avantages dans la thérapie ciblée sur la maladie, et les effets secondaires sont minimisés par des propriétés telles que le tropisme tumoral unique, l’identification de cibles spécifiques, une circulation prolongée, des interactions intercellulaires améliorées et une faible toxicité systémique. Ils peuvent également être facilement intégrés à d’autres modules de traitement pour traiter les cancers en coopération<...

En tant que l’une des innovations les plus critiques en matière de santé publique, les vaccins jouent un rôle clé dans la lutte contre le fardeau mondial des maladies humaines1. Par exemple, à l’heure actuelle, plus de 120 vaccins candidats contre les maladies COVID-19 sont testés, dont certains ont été approuvés dans de nombreux pays2. Des rapports récents indiquent que les vaccins anticancéreux ont effectivement amélioré les progrès des traitements cliniques contre le cancer parce qu’ils dirigent le système immunitaire des patients cancéreux à reconnaître les antigènes comme étrangers au corps3. De plus, plusieurs épitopes de lymphocytes T situés à l’intérieur ou à l’extérieur des cellules tumorales peuvent être utilisés pour concevoir des vaccins peptidiques, qui ont montré des avantages dans le traitement des cancers métastatiques en raison de l’absence de toxicité significative associée à la radiothérapie et à la chimiothérapie 4,5. Depuis le milieu des années 1990, les essais précliniques et cliniques pour le traitement des tumeurs ont été menés principalement à l’aide de vaccins peptidiques antigéniques, mais peu de vaccins présentent un effet thérapeutique adéquat sur les patients cancéreux6. En outre, les vaccins anticancéreux avec des épitopes peptidiques ont une faible immunogénicité et une efficacité d’administration insuffisante, ce qui peut être dû à la dégradation rapide des peptides extracellulaires qui diffusent rapidement à partir du site d’administration, ce qui conduit à une absorption insuffisante de l’antigène par les cellules immunitaires7. Par conséquent, il est nécessaire de surmonter ces obstacles avec la technologie d’administration des vaccins.
OVA 257-264, l’épitope257-264 liant le CMH de classe I exprimé en protéine de fusion, est un épitopemodèle 8 fréquemment utilisé. En outre, OVA257-264 est crucial pour la réponse immunitaire adaptative contre les tumeurs, qui dépend de la réponse cytotoxique des lymphocytes T (CTL). Il est médié par des cellules T CD8+ spécifiques de l’antigène dans la tumeur, qui sont induites par le peptide OVA257-264 . Elle se caractérise par une insuffisance de granzyme B, qui est libérée par les lymphocytes T cytotoxiques, conduisant à l’apoptose des cellules cibles8. Cependant, l’administration libre du peptide OVA257-264 peut induire peu d’activité CTL parce que l’absorption de ces antigènes se produit dans des cellules non spécifiques plutôt que dans des cellules présentatrices d’antigènes (APC). L’insuffisance d’une stimulation immunitaire appropriée entraîne une activité CTL5. Par conséquent, l’induction d’une activité CTL efficace exige des progrès considérables.
En raison de la barrière fournie par les cellules épithéliales et de la sécrétion continue de mucus, les antigènes vaccinaux sont rapidement éliminés de la muqueuse nasale 9,10. La mise au point d’un vecteur vaccinal efficace capable de traverser le tissu muqueux est cruciale car les cellules présentatrices de l’antigène sont situées sous l’épithélium9 de la muqueuse. L’injection intranasale de vaccins induit théoriquement une immunité muqueuse pour lutter contre l’infection des muqueuses11. En outre, l’administration nasale est une méthode d’administration efficace et sûre pour les vaccins en raison de sa commodité, de l’évitement de l’administration intestinale et de l’amélioration de l’observance du patient7. Par conséquent, l’administration nasale est un bon moyen d’administration pour le nouveau nanovaccin à épitopes peptidiques.
Plusieurs biomatériaux synthétiques ont été conçus pour combiner les épitopes des interactions cellule-tissu et cellule-cellule. Certaines protéines bioactives, comme l’Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), ont été introduites dans le cadre de la structure de l’hydrogel pour conférer une bioactivité12. Ce peptide contribue probablement à l’attachement, à la migration et à la croissancedes cellules 13 et se lie aux intégrines α 3β1 et α6β1 pour interagir avec différents types de cellules cancéreuses. IKVAV est un peptide d’adhésion cellulaire dérivé de la protéine de membrane basale de laminine αchaîne 1 qui était à l’origine utilisé pour modéliser le microenvironnement neuronal et provoquer la différenciation neuronale14. Par conséquent, il est important de trouver un véhicule d’administration efficace pour ce nouveau vaccin pour lutter contre la maladie.
Des systèmes d’émulsion récemment signalés, tels que W805EC et MF59, ont également été composés pour l’administration dans les cavités nasales d’un vaccin antigrippal inactivé ou d’antigène de surface recombinant de l’hépatite B et illustrés pour déclencher à la fois l’immunité muqueuse et systémique15. Les nanoémulsions (NE) présentent les avantages d’une administration facile et d’une coformation pratique avec des adjuvants efficaces par rapport aux systèmes d’administration de particulesmuqueuses 16. Il a été rapporté que les vaccins à nanoémulsion modifient le phénotype allergique d’une manière durable, différente de la désensibilisation traditionnelle, ce qui entraîne des effets suppressifs à long terme17. D’autres ont rapporté que les nanoémulsions combinées à des antigènes immunodominants spécifiques du Mtb pourraient induire de puissantes réponses des cellules muqueuses et conférer une protection significative18. Par conséquent, un nouveau nanovaccin intranasal auto-assemblé avec le peptide synthétique IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, le peptide constitué d’IKVAV lié à OVA257-264) a été conçu. Il est important d’évaluer systématiquement ce nouveau nanovaccin.
L’objectif de ce protocole est d’évaluer systématiquement les caractéristiques physico-chimiques, la toxicité et la stabilité du nanovaccin, de détecter si l’absorption d’antigènes et les effets protecteurs et thérapeutiques sont renforcés à l’aide de moyens techniques, et de préciser les principaux contenus expérimentaux. Dans cette étude, nous avons établi une série de protocoles pour étudier les caractéristiques physico-chimiques et la stabilité, déterminer l’ampleur de la toxicité de l’I-OVA NE en cellules BEAS-2B par CCK-8 et observer la capacité de présentation de l’antigène des cellules BEAS-2B au vaccin à l’aide de la microscopie confocale, évaluer les profils de libération de ce nouveau nanovaccin in vivo et in vitro, et détecter l’effet protecteur et thérapeutique de ce vaccin en utilisant un modèle murin porteur de tumeur E.G7-OVA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning Incorporated, USA</td>
			<td>CLS3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad 6.0 microplate reader</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA</td>
			<td>&#160;Bio-Rad 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK-8 kits</td>
			<td>Dojindo, Japan</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>5811000398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone (Life Technology, USA)</td>
			<td>SH30088.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-labeled I-OVA</td>
			<td>Shanghai Botai 
			Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HF 90/240 Incubator</td>
			<td>Heal Force, Switzerland</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC&#160;</td>
			<td>Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd.</td>
			<td>E2695</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon,Japan</td>
			<td>DSZ5000X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPC-208</td>
			<td>Chong Qing University, China</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS system&#160;</td>
			<td>Caliper Life Science Limited Company</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1230 TEM</td>
			<td>JEOL Limited Company of Japan</td>
			<td>1230 TEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern NANO ZS</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd., UK</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPLA</td>
			<td>&#160;Invivogen 
			Lit. Co.</td>
			<td>tlrl-mpla</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin Sulfate Ointment</td>
			<td>Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd.</td>
			<td>H31022262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVA257&#8211;264</td>
			<td>Shanghai Botai 
			Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Hyclone (Life Technology, USA)</td>
			<td>SH30809.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA</td>
			<td>Shanghai Botai 
			Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td>Zeiss LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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preparation, characteristics, toxicity, and efficacy evaluation of the nasal self-assembled nanoemulsion tumor vaccine in vitro and in vivo

Les peptides d’épitopes ont attiré l’attention dans le domaine des vaccins contre les tumeurs en raison de leur sécurité, de leur haute spécificité et de leur production pratique; en particulier, certains épitopes restreints par le CMH I peuvent induire une activité cytotoxique efficace des lymphocytes T pour éliminer les cellules tumorales. De plus, l’administration nasale est une technique d’administration efficace et sûre pour les vaccins contre les tumeurs en raison de sa commodité et de l’amélioration de l’observance du patient. Cependant, les peptides épitopiques ne conviennent pas à l’administration nasale en raison de leur faible immunogénicité et de leur manque d’efficacité d’administration. Les nanoémulsions (NE) sont des systèmes thermodynamiquement stables qui peuvent être chargés d’antigènes et livrés directement à la surface de la muqueuse nasale. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) est le pentapeptide de base de la laminine, un peptide liant l’intégrine exprimé par les cellules épithéliales respiratoires humaines. Dans cette étude, un vaccin tumoral intranasal auto-assemblé à peptide NE contenant le peptide synthétique IKVAV-OVA257-264 (I-OVA ) a été préparé par une méthode d’émulsification à basse énergie. La combinaison d’IKVAV et d’OVA257-264 peut améliorer l’absorption de l’antigène par les cellules épithéliales de la muqueuse nasale. Ici, nous établissons un protocole pour étudier les caractéristiques physico-chimiques par microscopie électronique à transmission (MET), microscopie à force atomique (AFM) et diffusion dynamique de la lumière (DLS); stabilité en présence de protéine mucine; toxicité en examinant la viabilité cellulaire des cellules BEAS-2B et des tissus nasaux et pulmonaires des souris C57BL/6; absorption cellulaire par microscopie confocale à balayage laser (CLSM); profils de libération par imagerie de petits animaux in vivo; et l’effet protecteur et thérapeutique du vaccin en utilisant un modèle porteur de tumeur E.G7. Nous prévoyons que le protocole fournira des indices techniques et théoriques pour le développement futur de nouveaux vaccins muqueux peptidiques à épitopes de lymphocytes T.

Conformément au protocole, nous avons terminé la préparation et l’évaluation expérimentale in vitro et in vivo de l’administration du nanovaccin nasal contre la tumeur. La MET, l’AFM et le DLS sont des moyens efficaces pour évaluer les caractéristiques de base du potentiel zêta de surface et la taille des particules du nanovaccin (Figure 1). Les cellules épithéliales BEAS-2B sont un modèle de dépistage utile pour les essais de toxicité in vitro d...

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Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo

Ici, nous présentons des méthodes détaillées pour la préparation et l’évaluation du vaccin tumoral nanoémulsion nasale auto-assemblé in vitro et in vivo.

Préparation, caractéristiques, toxicité et évaluation de l’efficacité du vaccin nasal auto-assemblé contre les tumeurs en nanoémulsion in vitro et in vivo

Epitope peptides have attracted widespread attention in the field of tumor vaccines because of their safety, high specificity, and convenient production; ...

Un nouveau vaccin à nanoémulsion présente de grands avantages dans la thérapie tactique de la maladie. Ces effets sont minimisés par des propriétés telles que le chopisme tumoral unique, l’identification de tactiques spécifiques et la faible toxicité systémique. Nous prévoyons que le protocole fournira des indices techniques et théoriques pour le développement futur de nouveaux vaccins muqueux peptidiques à base d’ectype de lymphocytes T.Commencez par mélanger un milligramme de monophosphorol lipide A avec 100 microlitres de DMSO. Vortex pendant cinq minutes et laissez-le se dissoudre pendant quatre heures à température ambiante. Ajouter quantitativement TWEEN 80 et I-OVA.Mélanger les composants et ajouter le squalène. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de solution de MPLA au mélange préparé. Pour préparer le vaccin nano-émulsion, ajouter la solution mélangée aux gouttelettes d’eau à environ 70% du volume total et remuer doucement pour obtenir un mélange transparent et facile à écouler.Pour les tests in vitro, commencez par faire revivre les cellules épithéliales BEAS2B. Allumez le bain-marie et réglez la température à 37 degrés Celsius. Décongeler rapidement les flacons cellulaires congelés au bain-marie, tempéré à 37 degrés Celsius.Après décongélation, pipeter rapidement les cellules dans un tube centrifuge stérile de 15 millilitres et ajouter deux millilitres du milieu de croissance complet. Centrifuger le tube à 129 G pendant cinq minutes. Retirer le supinatant et remettre les cellules en suspension dans deux millilitres du milieu de croissance complet.Après avoir centrifugé à nouveau les cellules, retirez le supinatant et ajoutez six millilitres de milieu de croissance complet pour remettre les cellules en suspension. Ensuite, transférer les cellules dans un flacon de culture T25 et incuber à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5% de dioxyde de carbone. Une fois que la densité cellulaire atteint 80% à 90%, jetez le milieu de culture et lavez les cellules deux fois avec deux millilitres de PBS.Ajouter un millilitre de 0,25% de tripsine pour digérer les cellules pendant une à deux minutes. Lorsque l’arrondi des cellules est observé, ajoutez immédiatement quatre millilitres du milieu de croissance complet pour neutraliser la trypsine. Mélanger et aspirer les échantillons dans un tube centrifuge stérile de 15 millilitres.Centrifuger les échantillons à 129 G pendant cinq minutes. Retirer le supinatant et remettre les cellules en suspension dans un millilitre de milieu complet RPMI 1640. Utilisez 20 microlitres de la suspension cellulaire pour le comptage des cellules et diluez les cellules à une fois 10 à la cinquième cellule par millilitre.Ensuite, plaquez les cellules BEAS2B à une densité d’une fois 10 à la quatrième cellule par puits dans 96 plaques de puits dans 100 microlitres de milieu complet RPMI 1640, et pré-incuber les plaques pendant 24 heures comme démontré précédemment. À la fin de l’incubation, jeter le supinatant et ajouter 100 microlitres de RPMI 1640 à chaque puits de la plaque de 96 puits. Ajouter 100 microlitres chacun de nano-émulsion I-OVA, I-OVA mélangé avec BNE et I-OVA pré-dilué avec un milieu de croissance complet à diverses concentrations finales avec BNE comme témoin et incuber pendant 24 heures à 37 degrés Celsius.Une fois l’incubation terminée, retirez le milieu et transférez la plaque dans un endroit sombre. Ajouter 90 microlitres de milieu de croissance complet et 10 microlitres de solution CCK8 à chaque puits de la plaque. Incuber la plaque pendant deux heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Mesurez l’absorbance de chaque puits à 450 nanomètres à l’aide d’un lecteur de plaques marqué par une enzyme. Utilisez des pointes de pipette de 10 microlitres pour effectuer l’immunisation nasale des souris avec I-OVA, I-OVA plus BNE et I-OVA NE pendant trois jours. Utiliser le BNE et le PBA comme témoins expérimentaux.Ensuite, coupez des échantillons de tissus nasaux d’environ trois millimètres d’épaisseur avec des ciseaux et placez-les dans du paraformaldéhyde à 4%. Retirez les tissus pulmonaires et fixez les tissus nasaux et pulmonaires entiers dans du paraformaldéhyde à 4% pendant 24 heures. La MET et l’AFM sont utilisées pour évaluer les caractéristiques de base du potentiel zêta de surface et la taille des particules du nanovaccin.La taille des particules, les indices de polydispersité, les potentiels zêta et la mobilité d’électrophorèse de l’I-OVA NE dans les analyses de stabilité de la musine sont présentés. La viabilité relative des cellules BEAS2B est supérieure à 80% dans des cultures exposées à différentes concentrations peptidiques d’I-OVA, BNE+I-OVA et I-OVA pendant 24 heures. Le groupe I-OVA EN n’avait pas de toxicité muqueuse évidente, de lésions tissulaires, de saignements ou d’infiltration de cellules inflammatoires.Les cellules épithéliales BEAS2B ont capturé plus d’I-OVA NE marqué FITC que celle de sa solution aqueuse. L’effet à libération prolongée de l’I-OVA NE in vitro a été analysé à l’aide du système IV-IS. Le vaccin I-OVA NE a eu un effet de libération soutenue par rapport à la solution aqueuse d’I-OVA.Dans le groupe I-OVA NE, le pourcentage de temps de survie est plus élevé par rapport aux autres groupes, et le volume tumoral était significativement plus petit, ce qui suggère qu’il a un meilleur effet de protection préventive que les autres groupes. Dans le modèle thérapeutique, le temps de survie médian était significativement différent entre les différents groupes. Le volume tumoral du groupe I-OVA NE était significativement plus petit que celui du groupe I-OVA.Remuer le mélange uniformément est important dans cette procédure. Sinon, cela réduira l’efficacité des nanovaccins.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo

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Recherche

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