Name: preparation, characteristics, toxicity, and efficacy evaluation of the nasal self-assembled nanoemulsion tumor vaccine in vitro and in vivo
Uploaded: 2022-09-28T13:40:00
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Diese Studie wurde unterstützt von Nr. 31670938, 32070924, 32000651 des National Natural Science Foundation Program of China, Nr. 2014jcyjA0107 und Nr. 2019jcyjA-msxmx0159 des Natural Science Foundation Project Program of Chongqing, Nr. 2020XBK24 und Nr. 2020XBK26 der Sonderprojekte der Army Medical University sowie Nr. 202090031021 und Nr. 202090031035 des National Innovation and Entrepreneurship Program für College-Studenten.

Die Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der Laboratory Animal – Guideline for ethical review of animal welfare (GB/T 35892-2018) durchgeführt und von der Laboratory Animal Welfare and Ethics Commission der Dritten Militärmedizinischen Universität genehmigt. Die Mäuse wurden durch eine intraperitoneale Injektion von 100 mg/kg 1% Natrium-Pentobarbital euthanasiert.
1. Vorbereitung der I-OVA NE
<ol><li>Mischen Sie 1 mg Monophosphoryllipid A (MPLA) mit 100 μl DMS...

<ol>
	<li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2020:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).</li><li>Mohammed, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+and+effectiveness+of+the+COVID-19+vaccines+in+reducing+infection,+severity,+hospitalization,+and+mortality:+A+systematic+review.">The efficacy and effectiveness of the COVID-19 vaccines in reducing infection, severity, hospitalization, and mortality: A systematic review.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 18 (1), 2027160 (2022).</li><li>Tsung, K., Norton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+vaccine,+immunological+memory+and+cancer+cure.">In situ vaccine, immunological memory and cancer cure.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 12 (1), 117-119 (2016).</li><li>Abd-Aziz, N., Poh, C. L., Ding, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+peptide-based+vaccines+for+cancer.">Development of peptide-based vaccines for cancer.</a> Journal of Oncology. 2022, 9749363 (2022).</li><li>Mochizuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+antigenic+peptides+complexed+with+beta-glucan+induces+potent+cytotoxic+T-lymphocyte+activity+in+combination+with+CpG-ODNs.">Immunization with antigenic peptides complexed with beta-glucan induces potent cytotoxic T-lymphocyte activity in combination with CpG-ODNs.</a> Journal of Controlled Release. 220, 495-502 (2015).</li><li>Kalita, P., Tripathi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+advances+in+the+design+of+peptide-based+vaccines.">Methodological advances in the design of peptide-based vaccines.</a> Drug Discovery Today. 27 (5), 1367-1380 (2022).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+self-assembled+epitope+peptide+nanoemulsion+vaccine+targeting+nasal+mucosal+epithelial+cell+for+reinvigorating+CD8(+)+T+cell+immune+activity+and+inhibiting+tumor+progression.">A novel self-assembled epitope peptide nanoemulsion vaccine targeting nasal mucosal epithelial cell for reinvigorating CD8(+) T cell immune activity and inhibiting tumor progression.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 183, 1891-1902 (2021).</li><li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OVA-specific+CD8++T+cells+do+not+express+granzyme+B+during+anterior+chamber+associated+immune+deviation.">OVA-specific CD8+ T cells do not express granzyme B during anterior chamber associated immune deviation.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 244 (10), 1315-1321 (2006).</li><li>Suzuki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+hyaluronic+acid-coated+polymeric+micelles+for+nasal+vaccine+delivery.">Preparation of hyaluronic acid-coated polymeric micelles for nasal vaccine delivery.</a> Biomaterials Science. 10 (8), 1920-1928 (2022).</li><li>Georas, S. N., Rezaee, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+barrier+function:+at+the+front+line+of+asthma+immunology+and+allergic+airway+inflammation.">Epithelial barrier function: at the front line of asthma immunology and allergic airway inflammation.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 509-520 (2014).</li><li>Lam, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nasal+omicron+vaccine+booster+elicits+potent+neutralizing+antibody+response+against+emerging+SARS-CoV-2+variants.">A nasal omicron vaccine booster elicits potent neutralizing antibody response against emerging SARS-CoV-2 variants.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 11 (1), 964-967 (2022).</li><li>Chai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+functional+recovery+of+rat+transected+spinal+cord+by+peptide-grafted+PNIPAM+based+hydrogel.">Improved functional recovery of rat transected spinal cord by peptide-grafted PNIPAM based hydrogel.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 210, 112220 (2022).</li><li>Paiva Dos Santos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+purification+and+characterization+of+an+elastin-like+polypeptide+containing+the+Ile-Lys-Val-Ala-Val+(IKVAV)+peptide+for+tissue+engineering+applications.">Production, purification and characterization of an elastin-like polypeptide containing the Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) peptide for tissue engineering applications.</a> Journal of Biotechnology. 298, 35-44 (2019).</li><li>Okur, A. C., Erkoc, P., Kizilel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+cells+via+tumor-homing+peptide+CREKA+functional+PEG+nanoparticles.">Targeting cancer cells via tumor-homing peptide CREKA functional PEG nanoparticles.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 147, 191-200 (2016).</li><li>Makidon, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+evaluation+of+a+novel+nanoemulsion-based+hepatitis+B+mucosal+vaccine.">Pre-clinical evaluation of a novel nanoemulsion-based hepatitis B mucosal vaccine.</a> PLoS One. 3 (8), 2954 (2008).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oil-in-ionic+liquid+nanoemulsion-based+intranasal+delivery+system+for+influenza+split-virus+vaccine.">Oil-in-ionic liquid nanoemulsion-based intranasal delivery system for influenza split-virus vaccine.</a> Journal of Controlled Release. 346, 380-391 (2022).</li><li>O'Konek, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+nanoemulsion+vaccine+confers+long-lasting+immunomodulation+and+sustained+unresponsiveness+in+a+murine+model+of+milk+allergy.">Intranasal nanoemulsion vaccine confers long-lasting immunomodulation and sustained unresponsiveness in a murine model of milk allergy.</a> Allergy. 75 (4), 872-881 (2020).</li><li>Ahmed, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+nanoemulsion+vaccine+induces+mucosal+Interleukin-17+responses+and+confers+protection+upon+Mycobacterium+tuberculosis+challenge+in+mice.">A novel nanoemulsion vaccine induces mucosal Interleukin-17 responses and confers protection upon Mycobacterium tuberculosis challenge in mice.</a> Vaccine. 35 (37), 4983-4989 (2017).</li><li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+systemic+and+mucosal+immunity+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+infection+by+a+novel+nanoemulsion+adjuvant+vaccine.">Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated-macrophage-membrane-coated+nanoparticles+for+improved+photodynamic+immunotherapy.">Tumor-associated-macrophage-membrane-coated nanoparticles for improved photodynamic immunotherapy.</a> Nano Letters. 21 (13), 5522-5531 (2021).</li><li>Prasanna, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+nanoscale+drug+delivery+and+the+future+of+nano-vaccine+development+for+leishmaniasis+-+A+review.">Current status of nanoscale drug delivery and the future of nano-vaccine development for leishmaniasis - A review.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 141, 111920 (2021).</li><li>George, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+defects+on+plate-shaped+silver+nanoparticles+contribute+to+its+hazard+potential+in+a+fish+gill+cell+line+and+zebrafish+embryos.">Surface defects on plate-shaped silver nanoparticles contribute to its hazard potential in a fish gill cell line and zebrafish embryos.</a> ACS Nano. 6 (5), 3745-3759 (2012).</li><li>Jafari Eskandari, M., Gostariani, R., Asadi Asadabad, M., Singh, D., Condurache-Bota, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+Electron+Microscopy+of+Nanomaterials.">Transmission Electron Microscopy of Nanomaterials.</a> Electron Crystallography. , (2020).</li><li>Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+nanoindentation+method+on+collagen+fibrils.">Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils.</a> Materials. 15 (7), 2477 (2022).</li><li>Zielinska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+nanoparticles:+Production,+characterization,+toxicology+and+ecotoxicology.">Polymeric nanoparticles: Production, characterization, toxicology and ecotoxicology.</a> Molecules. 25 (16), 3731 (2020).</li><li>Doncom, K. E. B., Blackman, L. D., Wright, D. B., Gibson, M. I., O'Reilly, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersity+effects+in+polymer+self-assemblies:+A+matter+of+hierarchical+control.">Dispersity effects in polymer self-assemblies: A matter of hierarchical control.</a> Chemical Society Reviews. 46 (14), 4119-4134 (2017).</li><li>Pei, M., Li, H., Zhu, Y., Lu, J., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evidence+of+oncofetal+antigen+and+TLR-9+agonist+co-delivery+by+alginate+nanovaccines+for+liver+cancer+immunotherapy.">In vitro evidence of oncofetal antigen and TLR-9 agonist co-delivery by alginate nanovaccines for liver cancer immunotherapy.</a> Biomaterials Science. 10 (11), 2865-2876 (2022).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Titanium+dioxide+nanoparticles+induced+reactive+oxygen+species+(ROS)+related+changes+of+metabolomics+signatures+in+human+normal+bronchial+epithelial+(BEAS-2B)+cells.">Titanium dioxide nanoparticles induced reactive oxygen species (ROS) related changes of metabolomics signatures in human normal bronchial epithelial (BEAS-2B) cells.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 444, 116020 (2022).</li><li>Kumar, V., Sharma, N., Maitra, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+toxicity+assessment+of+nanoparticles.">In vitro and in vivo toxicity assessment of nanoparticles.</a> International Nano Letters. 7 (4), 243-256 (2017).</li><li>Tong, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunopotentiator,+ophiopogonin+D,+encapsulated+in+a+nanoemulsion+as+a+robust+adjuvant+to+improve+vaccine+efficacy.">An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy.</a> Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).</li><li>Elliott, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy:+Principles+and+modern+practices.">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).</li><li>Huang, Y., Zou, Y., Lin, L., Zheng, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ginsenoside+Rg1+activates+dendritic+cells+and+acts+as+a+vaccine+adjuvant+inducing+protective+cellular+responses+against+lymphomas.">Ginsenoside Rg1 activates dendritic cells and acts as a vaccine adjuvant inducing protective cellular responses against lymphomas.</a> DNA and Cell Biology. 36 (12), 1168-1177 (2017).</li></ol>

Nanoimpfstoffe, die mit Immunozytenmembranen funktionalisiert sind, haben große Vorteile in der krankheitsspezifischen Therapie, und die Nebenwirkungen werden durch Eigenschaften wie einzigartigen Tumortropismus, die Identifizierung spezifischer Ziele, eine verlängerte Durchblutung, verstärkte interzelluläre Interaktionen und eine geringe systemische Toxizität minimiert. Sie lassen sich auch leicht in andere Behandlungsmodule integrieren, um Krebserkrankungen kooperativ zu behandeln16,20...

Als eine der wichtigsten Innovationen im Bereich der öffentlichen Gesundheit spielen Impfstoffe eine Schlüsselrolle bei der Bekämpfung der globalen Krankheitslast beim Menschen1. So werden derzeit mehr als 120 Impfstoffkandidaten gegen COVID-19-Erkrankungen getestet, von denen einige in vielen Ländern zugelassen sind2. Jüngste Berichte besagen, dass Krebsimpfstoffe den Fortschritt klinischer Krebsbehandlungen effektiv verbessert haben, da sie das Immunsystem von Krebspatienten dazu bringen, Antigene als körperfremd zu erkennen3. Darüber hinaus können mehrere T-Zell-Epitope, die sich innerhalb oder außerhalb von Tumorzellen befinden, zur Entwicklung von Peptidimpfstoffen verwendet werden, die sich bei der Behandlung von metastasierendem Krebs als vorteilhaft erwiesen haben, da sie nicht die signifikante Toxizität aufweisen, die mit Strahlen- und Chemotherapie verbunden ist 4,5. Seit Mitte der 1990er Jahre werden präklinische und klinische Studien zur Tumorbehandlung hauptsächlich mit Antigenpeptid-Impfstoffen durchgeführt, aber nur wenige Impfstoffe zeigen eine ausreichende therapeutische Wirkung bei Krebspatienten6. Darüber hinaus weisen Krebsimpfstoffe mit Peptidepitopen eine schlechte Immunogenität und eine unzureichende Verabreichungseffizienz auf, was auf den schnellen Abbau extrazellulärer Peptide zurückzuführen sein kann, die schnell von der Verabreichungsstelle diffundieren, was zu einer unzureichenden Antigenaufnahme durch Immunzellen führt7. Daher ist es notwendig, diese Hindernisse mit Technologie zur Verabreichung von Impfstoffen zu überwinden.
OVA 257-264, das MHC-Klasse-I-bindende257-264-Epitop, das als Fusionsprotein exprimiert wird, ist ein häufig verwendetes Modellepitop8. Darüber hinaus ist OVA257-264 entscheidend für die adaptive Immunantwort gegen Tumore, die von der zytotoxischen T-Lymphozyten-Antwort (CTL) abhängt. Sie wird durch antigenspezifische CD8+ T-Zellen im Tumor vermittelt, die durch das OVA257-264 Peptid induziert werden. Es ist gekennzeichnet durch unzureichendes Granzym B, das von zytotoxischen T-Zellen freigesetzt wird, was zur Apoptose der Zielzellen führt8. Die Verabreichung von freiem OVA257-264-Peptid kann jedoch eine geringe CTL-Aktivität induzieren, da die Aufnahme dieser Antigene in unspezifischen Zellen und nicht in antigenpräsentierenden Zellen (APCs) erfolgt. Das Fehlen einer geeigneten Immunstimulation führt zu einer CTL-Aktivität5. Daher erfordert die Induktion einer wirksamen CTL-Aktivität erhebliche Fortschritte.
Aufgrund der Barriere durch Epithelzellen und der kontinuierlichen Schleimsekretion werden Impfantigene schnell aus dem Nasenschleim entfernt 9,10. Die Entwicklung eines effizienten Impfstoffvektors, der das Schleimhautgewebe passieren kann, ist von entscheidender Bedeutung, da sich die antigenpräsentierenden Zellen unter dem Schleimhautepithel befinden9. Die intranasale Injektion von Impfstoffen induziert theoretisch eine Immunität der Schleimhäute zur Bekämpfung von Schleimhautinfektionen11. Darüber hinaus ist die nasale Verabreichung eine effektive und sichere Verabreichungsmethode für Impfstoffe, da sie bequem ist, die Verabreichung des Darms vermeidet und dieCompliance der Patienten verbessert 7. Daher ist die nasale Verabreichung ein gutes Mittel zur Verabreichung des neuartigen Peptid-Epitop-Nanoimpfstoffs.
Es wurden mehrere synthetische Biomaterialien entwickelt, um Epitope von Zellgewebe und Zell-Zell-Interaktionen zu kombinieren. Bestimmte bioaktive Proteine, wie z. B. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), wurden als Teil der Struktur des Hydrogels eingeführt, um Bioaktivität zu verleihen12. Dieses Peptid trägt wahrscheinlich zur Zellanhaftung, -migration und -ausbildungbei 13 und bindet Integrine α 3β1 und α6β1, um mit verschiedenen Krebszelltypen zu interagieren. IKVAV ist ein Zelladhäsionspeptid, das sich von der Laminin-Basalmembranprotein-α-1-Kette ableitet, die ursprünglich zur Modellierung der neuronalen Mikroumgebung und zur neuronalen Differenzierung verwendet wurde14. Daher ist es wichtig, ein effizientes Verabreichungsvehikel für diesen neuartigen Impfstoff zu finden, um Krankheiten zu kontrollieren.
Kürzlich beschriebene Emulsionssysteme wie W805EC und MF59 wurden ebenfalls für die Verabreichung von inaktiviertem Influenza-Impfstoff oder rekombinantem Hepatitis-B-Oberflächenantigen in die Nasenhöhle hergestellt und es wurde gezeigt, dass sie sowohl eine mukosale als auch eine systemische Immunität auslösen15. Nanoemulsionen (NEs) haben im Vergleich zu partikulären Schleimhautverabreichungssystemen die Vorteile einer einfachen Verabreichung und einer bequemen Co-Bildung mit wirksamen Adjuvantien16. Es wurde berichtet, dass Nanoemulsionsimpfstoffe den allergischen Phänotyp nachhaltig verändern, anders als bei der herkömmlichen Desensibilisierung, was zu langfristigen unterdrückenden Wirkungen führt17. Andere berichteten, dass Nanoemulsionen in Kombination mit Mtb-spezifischen immundominanten Antigenen starke Schleimhautzellantworten induzieren und einen signifikanten Schutz verleihen könnten18. Daher wurde ein neuartiger intranasaler selbstassemblierter Nanoimpfstoff mit dem synthetischen Peptid IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, das Peptid bestehend aus IKVAV gebunden an OVA257-264) entwickelt. Es ist wichtig, diesen neuartigen Nanoimpfstoff systematisch zu bewerten.
Ziel dieses Protokolls ist es, die physikalisch-chemischen Eigenschaften, die Toxizität und die Stabilität des Nanoimpfstoffs systematisch zu bewerten, festzustellen, ob die Antigenaufnahme und die schützende und therapeutische Wirkung mit technischen Mitteln verbessert werden, und die wichtigsten experimentellen Inhalte zu erläutern. In dieser Studie haben wir eine Reihe von Protokollen erstellt, um die physikalisch-chemischen Eigenschaften und die Stabilität zu untersuchen, das Ausmaß der Toxizität der I-OVA NE zu BEAS-2B-Zellen durch CCK-8 zu bestimmen und die Antigen-präsentierende Fähigkeit von BEAS-2B-Zellen zum Impfstoff mittels konfokaler Mikroskopie zu beobachten, die Freisetzungsprofile dieses neuartigen Nanoimpfstoffs in vivo und in vitro zu bewertenund die schützende und therapeutische Wirkung dieses Impfstoffs anhand eines E.G7-OVA-Tumor-tragenden Mausmodells nachzuweisen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning Incorporated, USA</td>
			<td>CLS3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad 6.0 microplate reader</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA</td>
			<td>&#160;Bio-Rad 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK-8 kits</td>
			<td>Dojindo, Japan</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>5811000398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone (Life Technology, USA)</td>
			<td>SH30088.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-labeled I-OVA</td>
			<td>Shanghai Botai 
			Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HF 90/240 Incubator</td>
			<td>Heal Force, Switzerland</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC&#160;</td>
			<td>Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd.</td>
			<td>E2695</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon,Japan</td>
			<td>DSZ5000X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPC-208</td>
			<td>Chong Qing University, China</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS system&#160;</td>
			<td>Caliper Life Science Limited Company</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1230 TEM</td>
			<td>JEOL Limited Company of Japan</td>
			<td>1230 TEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern NANO ZS</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd., UK</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPLA</td>
			<td>&#160;Invivogen 
			Lit. Co.</td>
			<td>tlrl-mpla</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin Sulfate Ointment</td>
			<td>Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd.</td>
			<td>H31022262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVA257&#8211;264</td>
			<td>Shanghai Botai 
			Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Hyclone (Life Technology, USA)</td>
			<td>SH30809.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA</td>
			<td>Shanghai Botai 
			Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td>Zeiss LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation, characteristics, toxicity, and efficacy evaluation of the nasal self-assembled nanoemulsion tumor vaccine in vitro and in vivo

Epitoppeptide haben auf dem Gebiet der Tumorimpfstoffe aufgrund ihrer Sicherheit, hohen Spezifität und bequemen Herstellung große Aufmerksamkeit erregt. Insbesondere einige MHC-I-restriktive Epitope können eine effektive zytotoxische T-Lymphozytenaktivität induzieren, um Tumorzellen zu beseitigen. Darüber hinaus ist die nasale Verabreichung aufgrund ihrer Bequemlichkeit und verbesserten Patientencompliance eine effektive und sichere Verabreichungstechnik für Tumorimpfstoffe. Epitoppeptide sind jedoch aufgrund ihrer schlechten Immunogenität und mangelnden Abgabeeffizienz für die nasale Verabreichung ungeeignet. Nanoemulsionen (NEs) sind thermodynamisch stabile Systeme, die mit Antigenen beladen und direkt an die Nasenschleimhautoberfläche abgegeben werden können. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) ist das Kernpentapeptid von Laminin, einem Integrin-bindenden Peptid, das von menschlichen Epithelzellen der Atemwege exprimiert wird. In dieser Arbeit wurde ein intranasaler selbstassemblierter Epitoppeptid-NE-Tumorimpfstoff, der das synthetische Peptid IKVAV-OVA257-264 (I-OVA ) enthielt, durch eine niederenergetische Emulgiermethode hergestellt. Die Kombination von IKVAV und OVA257-264 kann die Antigenaufnahme durch die Epithelzellen der Nasenschleimhaut verbessern. Hier erstellen wir ein Protokoll zur Untersuchung der physikalisch-chemischen Eigenschaften mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Rasterkraftmikroskopie (AFM) und dynamischer Lichtstreuung (DLS); Stabilität in Gegenwart von Muzinprotein; Toxizität durch Untersuchung der Zellviabilität von BEAS-2B-Zellen und des Nasen- und Lungengewebes von C57BL/6-Mäusen; zelluläre Aufnahme durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM); Freisetzungsprofile durch Bildgebung von Kleintieren in vivo; und die schützende und therapeutische Wirkung des Impfstoffs unter Verwendung eines E.G7-Tumor-tragenden Modells. Wir gehen davon aus, dass das Protokoll technische und theoretische Hinweise für die zukünftige Entwicklung neuartiger T-Zell-Epitop-Peptid-Mukosa-Impfstoffe liefern wird.

Gemäß dem Protokoll haben wir die Vorbereitung und die experimentelle In-vitro- und In-vivo-Bewertung der Verabreichung des Nanoimpfstoffs für Nasentumore abgeschlossen. TEM, AFM und DLS sind effektive Mittel zur Beurteilung der grundlegenden Eigenschaften des Zetapotenzials an der Oberfläche und der Partikelgröße des Nanoimpfstoffs (Abbildung 1). BEAS-2B-Epithelzellen sind ein nützliches Screening-Modell für die In-vitro-Toxizitätsprüfung von nasalen Impfstoffen ...

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Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo

Hier stellen wir detaillierte Methoden zur Herstellung und Evaluierung des nasalen selbstassemblierten Nanoemulsions-Tumorimpfstoffs in vitro und in vivo vor.

Herstellung, Eigenschaften, Toxizität und Wirksamkeitsbewertung des nasalen selbstassemblierten Nanoemulsions-Tumorimpfstoffs in vitro und in vivo

Epitope peptides have attracted widespread attention in the field of tumor vaccines because of their safety, high specificity, and convenient production; ...

Neuartiger Nanoemulsionsimpfstoff hat große Vorteile in der Therapie von Krankheiten. Diese Set-Effekte werden durch Eigenschaften wie den einzigartigen Tumorchopismus, die Identifizierung spezifischer Taktiken und die geringe systemische Toxizität minimiert. Wir gehen davon aus, dass das Protokoll technische und theoretische Hinweise für die zukünftige Entwicklung neuartiger T-Zell-Ectype-Peptid-Mukosa-Impfstoffe liefern wird.Mischen Sie zunächst ein Milligramm Monophosphorollipid A mit 100 Mikrolitern DMSO. Fünf Minuten vortexen und vier Stunden bei Raumtemperatur auflösen lassen. Fügen Sie TWEEN 80 und I-OVA quantitativ hinzu.Mischen Sie die Komponenten und fügen Sie Squalen hinzu. Als nächstes fügen Sie der vorbereiteten Mischung 100 Mikroliter MPLA-Lösung hinzu. Zur Herstellung des Nanoemulsionsimpfstoffs wird die gemischte Lösung bei ca. 70 % des Gesamtvolumens zu Wassertröpfchen gegeben und vorsichtig umgerührt, um eine transparente und leicht fließende Mischung zu erhalten.Beginnen Sie bei In-vitro-Assays mit der Wiederbelebung der BEAS2B-Epithelzellen. Schalten Sie das Wasserbad ein und stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein. Tauen Sie die gefrorenen Zellfläschchen schnell in einem Wasserbad auf, das bei 37 Grad Celsius temperiert ist.Nach dem Auftauen werden die Zellen schnell in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen pipettiert und zwei Milliliter des gesamten Nährmediums hinzugefügt. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 129 G fünf Minuten lang. Entfernen Sie das Supinatant und resuspendieren Sie die Zellen in zwei Millilitern des gesamten Nährmediums.Nachdem Sie die Zellen erneut zentrifugiert haben, entfernen Sie das Supinatant und fügen Sie sechs Milliliter des vollständigen Wachstumsmediums hinzu, um die Zellen wieder zu suspendieren. Anschließend werden die Zellen in einen T25-Kulturkolben überführt und bei 37 Grad Celsius in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator inkubiert. Sobald die Zelldichte 80 % bis 90 % erreicht hat, verwerfen Sie das Nährmedium und waschen Sie die Zellen zweimal mit zwei Millilitern PBS.Fügen Sie einen Milliliter 0,25%Tripsin hinzu, um die Zellen ein bis zwei Minuten lang zu verdauen. Wenn eine Rundung der Zellen beobachtet wird, fügen Sie sofort vier Milliliter des gesamten Wachstumsmediums hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Mischen und saugen Sie die Proben in einem sterilen 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen ab.Zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 129 G. Entfernen Sie das Supinatant und resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter RPMI 1640 Komplettmedium. Verwenden Sie 20 Mikroliter der Zellsuspension für die Zellzählung und verdünnen Sie die Zellen auf einmal 10 bis fünfte Zellen pro Milliliter.Dann werden die BEAS2B-Zellen mit einer Dichte von einmal 10 bis vier Zellen pro Well in 96-Well-Platten in 100 Mikrolitern RPMI 1640-Komplettmedium plattiert und die Platten 24 Stunden lang vorinkubiert, wie zuvor gezeigt. Am Ende der Inkubation wird das Supinatant verworfen und 100 Mikroliter RPMI 1640 in jede Vertiefung der 96-Well-Platte gegeben. Jeweils 100 Mikroliter I-OVA Nanoemulsion, I-OVA gemischt mit BNE und I-OVA mit einem kompletten Nährmedium in verschiedenen Endkonzentrationen mit BNE als Kontrolle vorverdünnt und 24 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren.Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, entfernen Sie das Medium und stellen Sie die Platte an einen dunklen Ort. Geben Sie 90 Mikroliter des vollständigen Wachstumsmediums und 10 Mikroliter CCK8-Lösung in jede Vertiefung der Platte. Inkubieren Sie die Platte zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.Messen Sie die Absorption jedes Wells bei 450 Nanometern mit einem enzymmarkierten Plattenleser. Verwenden Sie 10-Mikroliter-Pipettenspitzen, um die Mäuse drei Tage lang nasal mit I-OVA, I-OVA plus BNE und I-OVA NE zu immunisieren. Verwenden Sie BNE und PBA als experimentelle Kontrolle.Schneiden Sie anschließend mit einer Schere etwa drei Millimeter dicke Proben des Nasengewebes ab und legen Sie sie in 4%iges Paraformaldehyd. Entfernen Sie das Lungengewebe und fixieren Sie das Nasen- und das gesamte Lungengewebe 24 Stunden lang in 4%igem Paraformaldehyd. TEM und AFM werden zur Beurteilung der grundlegenden Eigenschaften des Zetapotentials an der Oberfläche und der Partikelgröße des Nanoimpfstoffs verwendet.Partikelgrößen, Polydispersitätsindizes, Zetapotentiale und Elektrophoresemobilität von I-OVA NE in Musin-Stabilitätsanalysen werden gezeigt. Die relative Lebensfähigkeit von BEAS2B-Zellen beträgt mehr als 80 % in Kulturen, die 24 Stunden lang unterschiedlichen Peptidkonzentrationen von I-OVA, BNE+I-OVA und I-OVA NE ausgesetzt waren. Die I-OVA EN-Gruppe hatte keine offensichtliche Schleimhauttoxizität, Gewebeschädigung, Blutung oder entzündliche Zellinfiltration.Die epithelialen BEAS2B-Zellen fingen mehr FITC-markierte I-OVA NE ein als die ihrer wässrigen Lösung. Der Retardeffekt von I-OVA NE in vitro wurde mit dem IV-IS-System analysiert. Der Impfstoff I-OVA NE hatte im Vergleich zur wässrigen Lösung von I-OVA eine verzögerte Freisetzung.In der I-OVA NE-Gruppe ist die prozentuale Überlebenszeit im Vergleich zu anderen Gruppen höher, und das Tumorvolumen war signifikant kleiner, was darauf hindeutet, dass er eine bessere präventive Schutzwirkung hat als die anderen Gruppen. Im therapeutischen Modell unterschied sich die mediane Überlebenszeit signifikant zwischen den verschiedenen Gruppen. Das Tumorvolumen der I-OVA NE-Gruppe war signifikant kleiner als das der I-OVA-Gruppe.Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Mischung gleichmäßig zu rühren. Andernfalls verringert sich die Effizienz von Nanoimpfstoffen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Menschliche T-Lymphozyten-Isolierung, Kultur und Analyse der Migration In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Quantitative Analysen aller Influenza Typ A Viral Hämagglutininen und Neuraminidasen mit Universal Antikörper in Einfache Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Einsatz von künstlichen Sputum Mittlere bis antibiotische Wirkung gegen die getestet<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; AGB in einen engeren Bezug zu den Mukoviszidose-Lunge

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Erzeugung von rekombinanten Arenavirus für die Impfstoffentwicklung in FDA-zugelassenen Vero-Zellen

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

Einem Restriktionsenzym basierte Klonen Methode, um das Beurteilen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Replikation Kapazität von HIV-1 Subtyp C-Gag MJ4 chimären Viren

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In-vitro-Analyse Myd88-vermittelte zelluläre Immunantwort gegen das West-Nil-Virus-Infektion Mutantenstamm

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Quantifizierung der menschliche Monocyte Chemotaxis In Vitro und murinen Lymphozyten Menschenhandel In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Bewertung der Wirt-Pathogen-Antworten und Wirksamkeit des Impfstoffes bei Mäusen

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

In Vitro ELISA-Test zur Bewertung der Wirksamkeit von Tollwut-Impfstoffen

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...