Name: preparation, characteristics, toxicity, and efficacy evaluation of the nasal self-assembled nanoemulsion tumor vaccine in vitro and in vivo
Uploaded: 2022-09-28T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מס '31670938, 32070924, 32000651 של תוכנית הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין, מס '2014jcyjA0107 ומס '2019jcyjA-msxmx0159 של תוכנית פרויקט הקרן למדעי הטבע של צ'ונגצ'ינג, מס '2020XBK24 ומס '2020XBK26 של האוניברסיטה הרפואית הצבאית פרויקטים מיוחדים, ומס '202090031021 ומס '202090031035 של התוכנית הלאומית לחדשנות ויזמות לתלמידי מכללות.

הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיה לבחינה אתית של רווחת בעלי חיים (GB/T 35892-2018) ואושרו על ידי ועדת האתיקה ורווחת חיות המעבדה של האוניברסיטה הצבאית השלישית לרפואה. העכברים הומתו על ידי זריקה תוך צפקית של 100 מ"ג / ק"ג של 1% נתרן pentobarbital.
1. הכנת I-OVA NE
<ol><li>Admix 1 מ"ג של מונופ...

<ol>
	<li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2020:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).</li><li>Mohammed, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+and+effectiveness+of+the+COVID-19+vaccines+in+reducing+infection,+severity,+hospitalization,+and+mortality:+A+systematic+review.">The efficacy and effectiveness of the COVID-19 vaccines in reducing infection, severity, hospitalization, and mortality: A systematic review.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 18 (1), 2027160 (2022).</li><li>Tsung, K., Norton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+vaccine,+immunological+memory+and+cancer+cure.">In situ vaccine, immunological memory and cancer cure.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 12 (1), 117-119 (2016).</li><li>Abd-Aziz, N., Poh, C. L., Ding, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+peptide-based+vaccines+for+cancer.">Development of peptide-based vaccines for cancer.</a> Journal of Oncology. 2022, 9749363 (2022).</li><li>Mochizuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+antigenic+peptides+complexed+with+beta-glucan+induces+potent+cytotoxic+T-lymphocyte+activity+in+combination+with+CpG-ODNs.">Immunization with antigenic peptides complexed with beta-glucan induces potent cytotoxic T-lymphocyte activity in combination with CpG-ODNs.</a> Journal of Controlled Release. 220, 495-502 (2015).</li><li>Kalita, P., Tripathi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+advances+in+the+design+of+peptide-based+vaccines.">Methodological advances in the design of peptide-based vaccines.</a> Drug Discovery Today. 27 (5), 1367-1380 (2022).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+self-assembled+epitope+peptide+nanoemulsion+vaccine+targeting+nasal+mucosal+epithelial+cell+for+reinvigorating+CD8(+)+T+cell+immune+activity+and+inhibiting+tumor+progression.">A novel self-assembled epitope peptide nanoemulsion vaccine targeting nasal mucosal epithelial cell for reinvigorating CD8(+) T cell immune activity and inhibiting tumor progression.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 183, 1891-1902 (2021).</li><li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OVA-specific+CD8++T+cells+do+not+express+granzyme+B+during+anterior+chamber+associated+immune+deviation.">OVA-specific CD8+ T cells do not express granzyme B during anterior chamber associated immune deviation.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 244 (10), 1315-1321 (2006).</li><li>Suzuki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+hyaluronic+acid-coated+polymeric+micelles+for+nasal+vaccine+delivery.">Preparation of hyaluronic acid-coated polymeric micelles for nasal vaccine delivery.</a> Biomaterials Science. 10 (8), 1920-1928 (2022).</li><li>Georas, S. N., Rezaee, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+barrier+function:+at+the+front+line+of+asthma+immunology+and+allergic+airway+inflammation.">Epithelial barrier function: at the front line of asthma immunology and allergic airway inflammation.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 509-520 (2014).</li><li>Lam, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nasal+omicron+vaccine+booster+elicits+potent+neutralizing+antibody+response+against+emerging+SARS-CoV-2+variants.">A nasal omicron vaccine booster elicits potent neutralizing antibody response against emerging SARS-CoV-2 variants.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 11 (1), 964-967 (2022).</li><li>Chai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+functional+recovery+of+rat+transected+spinal+cord+by+peptide-grafted+PNIPAM+based+hydrogel.">Improved functional recovery of rat transected spinal cord by peptide-grafted PNIPAM based hydrogel.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 210, 112220 (2022).</li><li>Paiva Dos Santos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+purification+and+characterization+of+an+elastin-like+polypeptide+containing+the+Ile-Lys-Val-Ala-Val+(IKVAV)+peptide+for+tissue+engineering+applications.">Production, purification and characterization of an elastin-like polypeptide containing the Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) peptide for tissue engineering applications.</a> Journal of Biotechnology. 298, 35-44 (2019).</li><li>Okur, A. C., Erkoc, P., Kizilel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+cells+via+tumor-homing+peptide+CREKA+functional+PEG+nanoparticles.">Targeting cancer cells via tumor-homing peptide CREKA functional PEG nanoparticles.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 147, 191-200 (2016).</li><li>Makidon, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+evaluation+of+a+novel+nanoemulsion-based+hepatitis+B+mucosal+vaccine.">Pre-clinical evaluation of a novel nanoemulsion-based hepatitis B mucosal vaccine.</a> PLoS One. 3 (8), 2954 (2008).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oil-in-ionic+liquid+nanoemulsion-based+intranasal+delivery+system+for+influenza+split-virus+vaccine.">Oil-in-ionic liquid nanoemulsion-based intranasal delivery system for influenza split-virus vaccine.</a> Journal of Controlled Release. 346, 380-391 (2022).</li><li>O'Konek, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+nanoemulsion+vaccine+confers+long-lasting+immunomodulation+and+sustained+unresponsiveness+in+a+murine+model+of+milk+allergy.">Intranasal nanoemulsion vaccine confers long-lasting immunomodulation and sustained unresponsiveness in a murine model of milk allergy.</a> Allergy. 75 (4), 872-881 (2020).</li><li>Ahmed, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+nanoemulsion+vaccine+induces+mucosal+Interleukin-17+responses+and+confers+protection+upon+Mycobacterium+tuberculosis+challenge+in+mice.">A novel nanoemulsion vaccine induces mucosal Interleukin-17 responses and confers protection upon Mycobacterium tuberculosis challenge in mice.</a> Vaccine. 35 (37), 4983-4989 (2017).</li><li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+systemic+and+mucosal+immunity+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+infection+by+a+novel+nanoemulsion+adjuvant+vaccine.">Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated-macrophage-membrane-coated+nanoparticles+for+improved+photodynamic+immunotherapy.">Tumor-associated-macrophage-membrane-coated nanoparticles for improved photodynamic immunotherapy.</a> Nano Letters. 21 (13), 5522-5531 (2021).</li><li>Prasanna, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+nanoscale+drug+delivery+and+the+future+of+nano-vaccine+development+for+leishmaniasis+-+A+review.">Current status of nanoscale drug delivery and the future of nano-vaccine development for leishmaniasis - A review.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 141, 111920 (2021).</li><li>George, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+defects+on+plate-shaped+silver+nanoparticles+contribute+to+its+hazard+potential+in+a+fish+gill+cell+line+and+zebrafish+embryos.">Surface defects on plate-shaped silver nanoparticles contribute to its hazard potential in a fish gill cell line and zebrafish embryos.</a> ACS Nano. 6 (5), 3745-3759 (2012).</li><li>Jafari Eskandari, M., Gostariani, R., Asadi Asadabad, M., Singh, D., Condurache-Bota, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+Electron+Microscopy+of+Nanomaterials.">Transmission Electron Microscopy of Nanomaterials.</a> Electron Crystallography. , (2020).</li><li>Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+nanoindentation+method+on+collagen+fibrils.">Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils.</a> Materials. 15 (7), 2477 (2022).</li><li>Zielinska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+nanoparticles:+Production,+characterization,+toxicology+and+ecotoxicology.">Polymeric nanoparticles: Production, characterization, toxicology and ecotoxicology.</a> Molecules. 25 (16), 3731 (2020).</li><li>Doncom, K. E. B., Blackman, L. D., Wright, D. B., Gibson, M. I., O'Reilly, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersity+effects+in+polymer+self-assemblies:+A+matter+of+hierarchical+control.">Dispersity effects in polymer self-assemblies: A matter of hierarchical control.</a> Chemical Society Reviews. 46 (14), 4119-4134 (2017).</li><li>Pei, M., Li, H., Zhu, Y., Lu, J., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evidence+of+oncofetal+antigen+and+TLR-9+agonist+co-delivery+by+alginate+nanovaccines+for+liver+cancer+immunotherapy.">In vitro evidence of oncofetal antigen and TLR-9 agonist co-delivery by alginate nanovaccines for liver cancer immunotherapy.</a> Biomaterials Science. 10 (11), 2865-2876 (2022).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Titanium+dioxide+nanoparticles+induced+reactive+oxygen+species+(ROS)+related+changes+of+metabolomics+signatures+in+human+normal+bronchial+epithelial+(BEAS-2B)+cells.">Titanium dioxide nanoparticles induced reactive oxygen species (ROS) related changes of metabolomics signatures in human normal bronchial epithelial (BEAS-2B) cells.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 444, 116020 (2022).</li><li>Kumar, V., Sharma, N., Maitra, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+toxicity+assessment+of+nanoparticles.">In vitro and in vivo toxicity assessment of nanoparticles.</a> International Nano Letters. 7 (4), 243-256 (2017).</li><li>Tong, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunopotentiator,+ophiopogonin+D,+encapsulated+in+a+nanoemulsion+as+a+robust+adjuvant+to+improve+vaccine+efficacy.">An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy.</a> Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).</li><li>Elliott, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy:+Principles+and+modern+practices.">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).</li><li>Huang, Y., Zou, Y., Lin, L., Zheng, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ginsenoside+Rg1+activates+dendritic+cells+and+acts+as+a+vaccine+adjuvant+inducing+protective+cellular+responses+against+lymphomas.">Ginsenoside Rg1 activates dendritic cells and acts as a vaccine adjuvant inducing protective cellular responses against lymphomas.</a> DNA and Cell Biology. 36 (12), 1168-1177 (2017).</li></ol>

לננו-חיסונים המתפקדים עם קרומי אימונוציטים יש יתרונות גדולים בטיפול ממוקד מחלה, ותופעות הלוואי ממוזערות על ידי תכונות כגון טרופיזם גידולי ייחודי, זיהוי מטרות ספציפיות, זרימת דם ממושכת, אינטראקציות בין-תאיות משופרות ורעילות מערכתית נמוכה. הם יכולים גם להיות משולבים בקלות עם מודולי טיפול ?...

כאחד החידושים הקריטיים ביותר בתחום בריאות הציבור, חיסונים ממלאים תפקיד מפתח במאבק בנטל העולמי של מחלות אנושיות1. כך למשל, בימים אלה נבדקים למעלה מ-120 חיסונים מועמדים לקורונה, חלקם אושרו במדינות רבות2. דיווחים אחרונים קובעים כי חיסונים נגד סרטן שיפרו ביעילות את התקדמות הטיפולים הקליניים בסרטן מכיוון שהם מכוונים את המערכת החיסונית של חולי סרטן לזהות אנטיגנים כזרים לגוף3. יתר על כן, אפיטופים מרובים של תאי T הממוקמים בתוך או מחוץ לתאי הגידול יכולים לשמש לתכנון חיסונים פפטידיים, אשר הראו יתרונות בטיפול בסרטן גרורתי בגלל היעדר הרעילות המשמעותית הקשורה להקרנות וכימותרפיה 4,5. מאז אמצע שנות התשעים נערכו ניסויים פרה-קליניים וקליניים לטיפול בגידולים בעיקר באמצעות חיסונים נגד פפטידי אנטיגן, אך מעטים החיסונים המציגים השפעה טיפולית מספקת על חולי סרטן6. יתר על כן, חיסונים לסרטן עם אפיטופים פפטידים הם בעלי אימונוגניות ירודה ויעילות אספקה לא מספקת, אשר עשויה לנבוע מהתפרקות מהירה של פפטידים חוץ-תאיים המתפזרים במהירות ממקום הנתינה, מה שמוביל לספיגת אנטיגן לא מספקת על ידי תאי החיסון7. לכן, יש צורך להתגבר על מכשולים אלה עם טכנולוגיית משלוח חיסונים.
OVA 257-264, אפיטופ MHC Class I-binding257-264 מבוטא כחלבון היתוך, הוא אפיטופ מודל8 הנמצא בשימוש תכוף. בנוסף, OVA257-264 חיוני לתגובה החיסונית הנרכשת נגד גידולים, אשר תלויה בתגובת לימפוציטים ציטוטוקסיים מסוג T (CTL). הוא מתווך על ידי תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן בגידול, המושרים על ידי פפטיד OVA257-264 . הוא מאופיין על ידי גרנים B מספיק, אשר משוחרר על ידי תאי T ציטוטוקסיים, המוביל אפופטוזיס של תאי המטרה8. עם זאת, מתן פפטידי OVA257-264 חופשי עשוי לגרום לפעילות CTL מועטה מכיוון שהספיגה של אנטיגנים אלה מתרחשת בתאים לא ספציפיים ולא בתאים מציגי אנטיגן (APC). מחסור בגירוי חיסוני מתאים גורם לפעילות CTL5. לכן, השראת פעילות CTL יעילה דורשת התקדמות ניכרת.
בשל המחסום המסופק על ידי תאי אפיתל והפרשת ריר מתמשכת, אנטיגנים חיסוניים מוסרים במהירות מרירית האף 9,10. פיתוח וקטור חיסון יעיל שיכול לעבור דרך הרקמה הרירית הוא חיוני מכיוון שהתאים מציגי האנטיגן ממוקמים מתחת לאפיתל הרירית9. הזרקה תוך אפית של חיסונים גורמת תיאורטית לחסינות רירית להילחם בזיהום רירית11. בנוסף, מתן האף הוא שיטת מתן יעילה ובטוחה לחיסונים בשל הנוחות שלה, הימנעות ממתן מעיים ושיפור היענות המטופל7. לכן, אספקת האף היא אמצעי טוב למתן ננו-חיסון אפיטופ פפטידי חדש.
מספר ביו-חומרים סינתטיים פותחו כדי לשלב אפיטופים של אינטראקציות בין רקמת התא לתא. חלבונים ביו-אקטיביים מסוימים, כגון Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), הוכנסו כחלק ממבנה ההידרוג'ל כדי להעניק פעילות ביולוגית12. פפטיד זה תורם ככל הנראה להיקשרות, נדידה וצמיחה של תאים13 וקושר אינטגרינים α-3β1ו-α-6β1 כדי לקיים אינטראקציה עם סוגי תאים סרטניים שונים. IKVAV הוא פפטיד היצמדות תאים הנגזר מחלבון קרום מרתף למינין α שרשרת1 ששימש במקור למדל את המיקרו-סביבה העצבית ולגרום להתמיינות עצבית14. לכן, מציאת רכב משלוח יעיל לחיסון חדשני זה חשובה לבקרת מחלות.
מערכות תחליב שדווחו לאחרונה, כגון W805EC ו- MF59, הורכבו גם עבור אספקת חלל האף של חיסון שפעת מומת או אנטיגן משטח רקומביננטי של הפטיטיס B והודגמו כמעוררות חסינות רירית ומערכתית15. לננו-תחליבים (NEs) יש את היתרונות של ניהול קל וקופורמציה נוחה עם אדג'ובנטים יעילים בהשוואה למערכות העברת רירית חלקיקים16. חיסוני ננו-תחליב דווחו כמשנים את הפנוטיפ האלרגי באופן מתמשך שונה מדסנסיטיזציה מסורתית, המביאה להשפעות דיכוי ארוכות טווח17. אחרים דיווחו כי ננו-תחליבים בשילוב עם אנטיגנים אימונודומיננטיים ספציפיים ל-Mtb יכולים לגרום לתגובות חזקות של תאי רירית ולהעניק הגנה משמעותית18. לכן, תוכנן ננו-חיסון חדשני בהרכבה עצמית תוך אפית עם הפפטיד הסינתטי IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, הפפטיד המורכב מ- IKVAV הקשור ל- OVA257-264). חשוב להעריך ננו-חיסון חדשני זה באופן שיטתי.
מטרת פרוטוקול זה היא להעריך באופן שיטתי את המאפיינים הפיזיקוכימיים, הרעילות והיציבות של הננו-חיסון, לזהות אם ספיגת האנטיגן וההשפעות המגינות והטיפוליות משופרות באמצעים טכניים, ולפרט את תכני הניסוי העיקריים. במחקר זה, ביססנו סדרה של פרוטוקולים לחקר המאפיינים הפיזיקוכימיים והיציבות, לקבוע את עוצמת הרעילות של תאי I-OVA NE עד BEAS-2B על ידי CCK-8, ולבחון את יכולת הצגת האנטיגן של תאי BEAS-2B לחיסון באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, להעריך את פרופילי השחרור של ננו-חיסון חדשני זה in vivo ו-in vitroולזהות את ההשפעה המגנה והטיפולית של חיסון זה באמצעות מודל עכבר נושא גידול E.G7-OVA.,

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning Incorporated, USA</td>
			<td>CLS3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad 6.0 microplate reader</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA</td>
			<td>&#160;Bio-Rad 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK-8 kits</td>
			<td>Dojindo, Japan</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>5811000398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone (Life Technology, USA)</td>
			<td>SH30088.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-labeled I-OVA</td>
			<td>Shanghai Botai 
			Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HF 90/240 Incubator</td>
			<td>Heal Force, Switzerland</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC&#160;</td>
			<td>Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd.</td>
			<td>E2695</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon,Japan</td>
			<td>DSZ5000X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPC-208</td>
			<td>Chong Qing University, China</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS system&#160;</td>
			<td>Caliper Life Science Limited Company</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1230 TEM</td>
			<td>JEOL Limited Company of Japan</td>
			<td>1230 TEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern NANO ZS</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd., UK</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPLA</td>
			<td>&#160;Invivogen 
			Lit. Co.</td>
			<td>tlrl-mpla</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin Sulfate Ointment</td>
			<td>Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd.</td>
			<td>H31022262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVA257&#8211;264</td>
			<td>Shanghai Botai 
			Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Hyclone (Life Technology, USA)</td>
			<td>SH30809.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA</td>
			<td>Shanghai Botai 
			Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td>Zeiss LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation, characteristics, toxicity, and efficacy evaluation of the nasal self-assembled nanoemulsion tumor vaccine in vitro and in vivo

פפטידים אפיטופיים משכו תשומת לב נרחבת בתחום חיסוני הגידול בגלל בטיחותם, ספציפיות גבוהה וייצור נוח; בפרט, כמה אפיטופים מוגבלים MHC I יכולים לגרום לפעילות לימפוציטים ציטוטוקסיים T יעילה כדי לנקות תאים סרטניים. בנוסף, מתן אף הוא טכניקת מסירה יעילה ובטוחה לחיסונים לגידולים בשל הנוחות שלה והיענות משופרת למטופלים. עם זאת, פפטידים אפיטופיים אינם מתאימים לאספקת האף בגלל האימונוגניות הירודה שלהם וחוסר יעילות ההעברה. ננו-תחליבים (NEs) הם מערכות יציבות מבחינה תרמודינמית שניתן לטעון באנטיגנים ולהעביר ישירות לפני השטח של רירית האף. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) הוא פנטפפטיד הליבה של למינין, פפטיד קושר אינטגרין המתבטא על ידי תאי אפיתל נשימתיים אנושיים. במחקר זה, חיסון לגידול אפיטופ פפטיד NE בהרכבה עצמית תוך אפי המכיל את הפפטיד הסינתטי IKVAV-OVA257-264 (I-OVA ) הוכן בשיטת תחליב באנרגיה נמוכה. השילוב של IKVAV ו- OVA257-264 יכול לשפר את ספיגת האנטיגן על ידי תאי אפיתל ברירית האף. כאן, אנו קובעים פרוטוקול לחקר המאפיינים הפיזיקוכימיים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM), מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ופיזור אור דינמי (DLS); יציבות בנוכחות חלבון מוצין; רעילות על ידי בחינת יכולת הקיום התאית של תאי BEAS-2B ורקמות האף והריאות של עכברי C57BL/6; קליטה סלולרית על ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM); לשחרר פרופילים על ידי הדמיה של חיות קטנות in vivo; וההשפעה המגנה והטיפולית של החיסון באמצעות מודל נושא גידול E.G7. אנו צופים כי הפרוטוקול יספק רמזים טכניים ותיאורטיים לפיתוח עתידי של חיסונים ריריים חדשניים מסוג תאי T אפיטופים פפטידיים.

על פי הפרוטוקול, השלמנו את ההכנה ואת ההערכה הניסויית in vitro and in vivo של אספקת ננו-חיסון הגידול באף. TEM, AFM ו-DLS הם אמצעים יעילים להערכת המאפיינים הבסיסיים של פוטנציאל הזטה בפני השטח וגודל החלקיקים של ננו-חיסון (איור 1). תאי אפיתל BEAS-2B הם מודל סינון שימושי לבדיקת רעילות ח...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo

כאן, אנו מציגים שיטות מפורטות להכנה והערכה של החיסון לגידול ננו-תחליב בהרכבה עצמית באף במבחנה ו-in vivo.

הכנה, מאפיינים, רעילות והערכת יעילות של החיסון לגידול ננו-תחליב באף בהרכבה עצמית במבחנה וב-Vivo

Epitope peptides have attracted widespread attention in the field of tumor vaccines because of their safety, high specificity, and convenient production; ...

לחיסון ננו-תחליב חדשני יש יתרונות גדולים בטיפול טקטי במחלה. השפעות קבועות אלה ממוזערות על ידי תכונות כגון חיתוך גידול ייחודי, זיהוי טקטיקות ספציפיות והרעילות המערכתית הנמוכה. אנו צופים כי הפרוטוקול יספק רמזים טכניים ותיאורטיים לפיתוח עתידי של חיסונים חדשים נגד רירית מסוג תאי T.התחל על ידי ערבוב מיליגרם אחד של שומנים מונופוספורול A עם 100 מיקרוליטר של DMSO. מערבלים במשך חמש דקות ומשאירים אותו להתמוסס במשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר. הוסיפו כמותית את TWEEN 80 ואת I-OVA.מערבבים את הרכיבים ומוסיפים סקוואלן. לאחר מכן, להוסיף 100 מיקרוליטר של פתרון MPLA לתערובת מוכנה. להכנת החיסון נגד ננו תחליב, הוסיפו את התמיסה המעורבת לטיפות מים בכ-70% מהנפח הכולל וערבבו בעדינות לקבלת תערובת שקופה וזורמת בקלות.עבור בדיקות במבחנה, התחל עם החייאת תאי אפיתל BEAS2B. הפעל את אמבט המים והתאם את הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס. הפשירו את בקבוקוני התאים הקפואים במהירות באמבט מים, בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.לאחר ההפשרה, במהירות פיפטה את התאים לתוך צינור צנטריפוגה סטרילית 15 מיליליטר, ולהוסיף שני מיליליטר של מדיום הגידול השלם. צנטריפוגה את הצינור ב 129 G במשך חמש דקות. הסר את supinatant ו resuspend את התאים בשני מיליליטר של מדיום הגידול המלא.לאחר צנטריפוגה של התאים שוב, להסיר את supinatant ולהוסיף שישה מיליליטר של מדיום גידול מלא כדי להשעות מחדש את התאים. לאחר מכן מעבירים את התאים לבקבוק תרבית T25 ודגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני. ברגע שצפיפות התא מגיעה ל-80% עד 90%, השליכו את מדיום התרבית ושטפו את התאים פעמיים עם שני מיליליטר PBS.מוסיפים מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין כדי לעכל את התאים למשך דקה עד שתי דקות. כאשר עיגול של התאים הוא ציין, מיד להוסיף ארבעה מיליליטר של מדיום הגידול המלא כדי לנטרל את טריפסין. מערבבים ושואפים את הדגימות בצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מיליליטר.צנטריפוגה את הדגימות ב 129 G במשך חמש דקות. הסר את supinatant ו resuspend את התאים במיליליטר אחד של RPMI 1640 מדיום שלם. השתמש 20 מיקרוליטר של תרחיף התא לספירת תאים ודלל את התאים לפעם אחת 10 עד התאים החמישיים למיליליטר.לאחר מכן לוחצים את תאי BEAS2B בצפיפות של פי 10 עד התאים הרביעיים לכל באר ב-96 צלחות באר ב-100 מיקרוליטר של סל"ד 1640 תווך שלם, ודוגרים מראש על הלוחות למשך 24 שעות כפי שהודגם קודם לכן. בסוף הדגירה, להשליך את supinatant ולהוסיף 100 מיקרוליטר של RPMI 1640 לכל באר של צלחת 96 באר. הוסף 100 מיקרוליטר כל תחליב ננו I-OVA, I-OVA מעורבב עם BNE, ו- I-OVA מדולל מראש עם מדיום גידול מלא בריכוזים סופיים שונים עם BNE כבקרה ודגרה במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.לאחר השלמת הדגירה, מסירים את המדיום, ומעבירים את הצלחת למקום חשוך. הוסף 90 מיקרוליטר של מדיום גידול שלם ו -10 מיקרוליטר של תמיסת CCK8 לכל באר של הצלחת. דוגרים על הצלחת במשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.מדוד את הספיגה של כל באר ב 450 ננומטר באמצעות אנזים שכותרתו קורא לוחות. השתמש 10 טיפים פיפטה מיקרוליטר לבצע חיסון האף של העכברים עם I-OVA, I-OVA בתוספת BNE, ו- I-OVA NE במשך שלושה ימים. השתמש BNE ו- PBA כבקרה ניסיונית.לאחר מכן, חתכו במספריים דגימות בעובי של כשלושה מילימטרים של רקמות האף והניחו אותן בפרפורמלדהיד 4%. הסר את רקמות הריאה וקבע את רקמות האף והריאה השלמה ב 4% paraformaldehyde למשך 24 שעות. TEM ו-AFM משמשים להערכת המאפיינים הבסיסיים של פוטנציאל הזטה על פני השטח וגודל החלקיקים של חיסון הנאנו.גדלים של חלקיקים, אינדקסי פיזור רב-תכליתי, פוטנציאלי זטה וניידות אלקטרופורזה של I-OVA NE בניתוחי יציבות מוסין. הכדאיות היחסית של תאי BEAS2B היא יותר מ-80% בתרביות שנחשפו לריכוזים פפטידים שונים של I-OVA, BNE+I-OVA ו-I-OVA NE במשך 24 שעות. לקבוצת I-OVA EN לא היו רעילות רירית ברורה, נזק לרקמות, דימום או חדירת תאים דלקתיים.תאי האפיתל BEAS2B לכדו יותר FITC שכותרתו I-OVA NE מאשר זה של תמיסת המים שלו. אפקט השחרור המתמשך של I-OVA NE IN VITRO נותח באמצעות מערכת IV-IS. לחיסון I-OVA NE הייתה השפעת שחרור מתמשכת בהשוואה לתמיסה המימית של I-OVA.בקבוצת I-OVA NE אחוז ההישרדות גבוה יותר בהשוואה לקבוצות אחרות, ונפח הגידול היה קטן משמעותית, מה שמרמז על כך שיש לו אפקט הגנה מונעת טוב יותר מאשר הקבוצות האחרות. במודל הטיפולי, זמן ההישרדות החציוני היה שונה באופן משמעותי בין קבוצות שונות. נפח הגידול בקבוצת I-OVA NE היה קטן משמעותית מזה שבקבוצת I-OVA.ערבוב אחיד של התערובת חשוב בהליך זה. אחרת זה יפחית את היעילות של ננו-חיסונים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

האדם בידוד T לימפוציטים, התרבות ניתוח של הגירה במבחנה</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

ניתוח כמותי של השפעת כל סוג Hemagglutinins ויראלי ו Neuraminidases באמצעות נוגדנים יוניברסל מבחני כתם פשוט חריץ

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; בתנאי רלוונטיים יותר ריאות סיסטיק פיברוזיס

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

דור של Arenavirus רקומביננטי לפיתוח חיסון בתאי Vero-FDA

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

הגבלת אנזים מבוסס שיבוט שיטה להערכה<em&gt; במבחנה</em&gt; יכולת שכפול של HIV-1 Gag-MJ4 וירוסי כימרי C סוג משנה

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

בניתוח חוץ גופייה של תיווך Myd88 הסלולרי תגובה החיסונית לוירוס הנילוס המערבי זיהום הזנים Mutant

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

הערכת היעילות והרעילות של RNAs מיקוד ייצור HIV-1 לשימוש ב ג&#39;ין או טיפול תרופתי

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

לכימות מונוציט האנושי כימוטקסיס במבחנה , לימפוציט מאתר סחר In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

הערכה של פתוגן-פונדקאי תגובות והיעילות החיסון בעכברים

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

בדיקת מחוץ גופית מבחן להערכת כלבת חיסון עוצמת

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...