Name: preparation, characteristics, toxicity, and efficacy evaluation of the nasal self-assembled nanoemulsion tumor vaccine in vitro and in vivo
Uploaded: 2022-09-28T13:40:00
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Este estudo foi apoiado pelo No. 31670938, 32070924, 32000651 do Programa da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China, No. 2014jcyjA0107 e No. 2019jcyjA-msxmx0159 do Programa de Projeto da Fundação de Ciências Naturais de Chongqing, No. 2020XBK24 e No. 2020XBK26 dos projetos especiais da Universidade de Medicina do Exército, e No. 202090031021 e No. 202090031035 do Programa Nacional de Inovação e Empreendedorismo para estudantes universitários.

Os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com o Laboratory Animal – Guideline for ethical review of animal welfare (GB/T 35892-2018) e foram aprovados pelo Comitê de Ética e Bem-Estar Animal de Laboratório da Terceira Universidade Médica Militar. Os camundongos foram eutanasiados por injeção intraperitoneal de 100 mg/kg de pentobarbital sódico a 1%.
1. Preparação do I-OVA NE
<ol><li>Misture 1 mg de lipídio monofosforílico A (MPLA) com 100 μL de DM...

<ol>
	<li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2020:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).</li><li>Mohammed, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+and+effectiveness+of+the+COVID-19+vaccines+in+reducing+infection,+severity,+hospitalization,+and+mortality:+A+systematic+review.">The efficacy and effectiveness of the COVID-19 vaccines in reducing infection, severity, hospitalization, and mortality: A systematic review.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 18 (1), 2027160 (2022).</li><li>Tsung, K., Norton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+vaccine,+immunological+memory+and+cancer+cure.">In situ vaccine, immunological memory and cancer cure.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 12 (1), 117-119 (2016).</li><li>Abd-Aziz, N., Poh, C. L., Ding, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+peptide-based+vaccines+for+cancer.">Development of peptide-based vaccines for cancer.</a> Journal of Oncology. 2022, 9749363 (2022).</li><li>Mochizuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+antigenic+peptides+complexed+with+beta-glucan+induces+potent+cytotoxic+T-lymphocyte+activity+in+combination+with+CpG-ODNs.">Immunization with antigenic peptides complexed with beta-glucan induces potent cytotoxic T-lymphocyte activity in combination with CpG-ODNs.</a> Journal of Controlled Release. 220, 495-502 (2015).</li><li>Kalita, P., Tripathi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+advances+in+the+design+of+peptide-based+vaccines.">Methodological advances in the design of peptide-based vaccines.</a> Drug Discovery Today. 27 (5), 1367-1380 (2022).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+self-assembled+epitope+peptide+nanoemulsion+vaccine+targeting+nasal+mucosal+epithelial+cell+for+reinvigorating+CD8(+)+T+cell+immune+activity+and+inhibiting+tumor+progression.">A novel self-assembled epitope peptide nanoemulsion vaccine targeting nasal mucosal epithelial cell for reinvigorating CD8(+) T cell immune activity and inhibiting tumor progression.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 183, 1891-1902 (2021).</li><li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OVA-specific+CD8++T+cells+do+not+express+granzyme+B+during+anterior+chamber+associated+immune+deviation.">OVA-specific CD8+ T cells do not express granzyme B during anterior chamber associated immune deviation.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 244 (10), 1315-1321 (2006).</li><li>Suzuki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+hyaluronic+acid-coated+polymeric+micelles+for+nasal+vaccine+delivery.">Preparation of hyaluronic acid-coated polymeric micelles for nasal vaccine delivery.</a> Biomaterials Science. 10 (8), 1920-1928 (2022).</li><li>Georas, S. N., Rezaee, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+barrier+function:+at+the+front+line+of+asthma+immunology+and+allergic+airway+inflammation.">Epithelial barrier function: at the front line of asthma immunology and allergic airway inflammation.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 509-520 (2014).</li><li>Lam, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nasal+omicron+vaccine+booster+elicits+potent+neutralizing+antibody+response+against+emerging+SARS-CoV-2+variants.">A nasal omicron vaccine booster elicits potent neutralizing antibody response against emerging SARS-CoV-2 variants.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 11 (1), 964-967 (2022).</li><li>Chai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+functional+recovery+of+rat+transected+spinal+cord+by+peptide-grafted+PNIPAM+based+hydrogel.">Improved functional recovery of rat transected spinal cord by peptide-grafted PNIPAM based hydrogel.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 210, 112220 (2022).</li><li>Paiva Dos Santos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+purification+and+characterization+of+an+elastin-like+polypeptide+containing+the+Ile-Lys-Val-Ala-Val+(IKVAV)+peptide+for+tissue+engineering+applications.">Production, purification and characterization of an elastin-like polypeptide containing the Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) peptide for tissue engineering applications.</a> Journal of Biotechnology. 298, 35-44 (2019).</li><li>Okur, A. C., Erkoc, P., Kizilel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+cells+via+tumor-homing+peptide+CREKA+functional+PEG+nanoparticles.">Targeting cancer cells via tumor-homing peptide CREKA functional PEG nanoparticles.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 147, 191-200 (2016).</li><li>Makidon, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+evaluation+of+a+novel+nanoemulsion-based+hepatitis+B+mucosal+vaccine.">Pre-clinical evaluation of a novel nanoemulsion-based hepatitis B mucosal vaccine.</a> PLoS One. 3 (8), 2954 (2008).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oil-in-ionic+liquid+nanoemulsion-based+intranasal+delivery+system+for+influenza+split-virus+vaccine.">Oil-in-ionic liquid nanoemulsion-based intranasal delivery system for influenza split-virus vaccine.</a> Journal of Controlled Release. 346, 380-391 (2022).</li><li>O'Konek, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+nanoemulsion+vaccine+confers+long-lasting+immunomodulation+and+sustained+unresponsiveness+in+a+murine+model+of+milk+allergy.">Intranasal nanoemulsion vaccine confers long-lasting immunomodulation and sustained unresponsiveness in a murine model of milk allergy.</a> Allergy. 75 (4), 872-881 (2020).</li><li>Ahmed, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+nanoemulsion+vaccine+induces+mucosal+Interleukin-17+responses+and+confers+protection+upon+Mycobacterium+tuberculosis+challenge+in+mice.">A novel nanoemulsion vaccine induces mucosal Interleukin-17 responses and confers protection upon Mycobacterium tuberculosis challenge in mice.</a> Vaccine. 35 (37), 4983-4989 (2017).</li><li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+systemic+and+mucosal+immunity+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+infection+by+a+novel+nanoemulsion+adjuvant+vaccine.">Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated-macrophage-membrane-coated+nanoparticles+for+improved+photodynamic+immunotherapy.">Tumor-associated-macrophage-membrane-coated nanoparticles for improved photodynamic immunotherapy.</a> Nano Letters. 21 (13), 5522-5531 (2021).</li><li>Prasanna, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+nanoscale+drug+delivery+and+the+future+of+nano-vaccine+development+for+leishmaniasis+-+A+review.">Current status of nanoscale drug delivery and the future of nano-vaccine development for leishmaniasis - A review.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 141, 111920 (2021).</li><li>George, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+defects+on+plate-shaped+silver+nanoparticles+contribute+to+its+hazard+potential+in+a+fish+gill+cell+line+and+zebrafish+embryos.">Surface defects on plate-shaped silver nanoparticles contribute to its hazard potential in a fish gill cell line and zebrafish embryos.</a> ACS Nano. 6 (5), 3745-3759 (2012).</li><li>Jafari Eskandari, M., Gostariani, R., Asadi Asadabad, M., Singh, D., Condurache-Bota, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+Electron+Microscopy+of+Nanomaterials.">Transmission Electron Microscopy of Nanomaterials.</a> Electron Crystallography. , (2020).</li><li>Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+nanoindentation+method+on+collagen+fibrils.">Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils.</a> Materials. 15 (7), 2477 (2022).</li><li>Zielinska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+nanoparticles:+Production,+characterization,+toxicology+and+ecotoxicology.">Polymeric nanoparticles: Production, characterization, toxicology and ecotoxicology.</a> Molecules. 25 (16), 3731 (2020).</li><li>Doncom, K. E. B., Blackman, L. D., Wright, D. B., Gibson, M. I., O'Reilly, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersity+effects+in+polymer+self-assemblies:+A+matter+of+hierarchical+control.">Dispersity effects in polymer self-assemblies: A matter of hierarchical control.</a> Chemical Society Reviews. 46 (14), 4119-4134 (2017).</li><li>Pei, M., Li, H., Zhu, Y., Lu, J., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evidence+of+oncofetal+antigen+and+TLR-9+agonist+co-delivery+by+alginate+nanovaccines+for+liver+cancer+immunotherapy.">In vitro evidence of oncofetal antigen and TLR-9 agonist co-delivery by alginate nanovaccines for liver cancer immunotherapy.</a> Biomaterials Science. 10 (11), 2865-2876 (2022).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Titanium+dioxide+nanoparticles+induced+reactive+oxygen+species+(ROS)+related+changes+of+metabolomics+signatures+in+human+normal+bronchial+epithelial+(BEAS-2B)+cells.">Titanium dioxide nanoparticles induced reactive oxygen species (ROS) related changes of metabolomics signatures in human normal bronchial epithelial (BEAS-2B) cells.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 444, 116020 (2022).</li><li>Kumar, V., Sharma, N., Maitra, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+toxicity+assessment+of+nanoparticles.">In vitro and in vivo toxicity assessment of nanoparticles.</a> International Nano Letters. 7 (4), 243-256 (2017).</li><li>Tong, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunopotentiator,+ophiopogonin+D,+encapsulated+in+a+nanoemulsion+as+a+robust+adjuvant+to+improve+vaccine+efficacy.">An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy.</a> Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).</li><li>Elliott, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy:+Principles+and+modern+practices.">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).</li><li>Huang, Y., Zou, Y., Lin, L., Zheng, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ginsenoside+Rg1+activates+dendritic+cells+and+acts+as+a+vaccine+adjuvant+inducing+protective+cellular+responses+against+lymphomas.">Ginsenoside Rg1 activates dendritic cells and acts as a vaccine adjuvant inducing protective cellular responses against lymphomas.</a> DNA and Cell Biology. 36 (12), 1168-1177 (2017).</li></ol>

Nanovacinas funcionalizadas com membranas de imunoócitos têm grandes vantagens na terapia doença-alvo, e os efeitos colaterais são minimizados por propriedades como tropismo tumoral único, identificação de alvos específicos, circulação prolongada, interações intercelulares aumentadas e baixa toxicidade sistêmica. Também podem ser facilmente integrados com outros módulos de tratamento para tratar os cânceres de forma cooperativa16,20. Atributos des...

Como uma das inovações de saúde pública mais críticas, as vacinas desempenham um papel fundamental no combate à carga global de doenças humanas1. Por exemplo, atualmente, mais de 120 vacinas candidatas para doenças COVID-19 estão sendo testadas, algumas das quais foram aprovadas em muitos países2. Relatos recentes afirmam que as vacinas contra o câncer têm efetivamente melhorado o progresso dos tratamentos clínicos do câncer, pois direcionam o sistema imunológico de pacientes com câncer a reconhecer antígenos como estranhos ao corpo3. Além disso, múltiplos epítopos de células T localizados dentro ou fora de células tumorais podem ser usados para projetar vacinas peptídicas, que têm mostrado vantagens no tratamento de cânceres metastáticos devido à falta de toxicidade significativa associada à radioterapia e quimioterapia 4,5. Desde meados da década de 1990, ensaios pré-clínicos e clínicos para tratamento tumoral têm sido conduzidos principalmente utilizando vacinas antipeptídicas, mas poucas vacinas exibem efeito terapêutico adequado em pacientes comcâncer6. Além disso, as vacinas contra o câncer com epítopos peptídicos apresentam baixa imunogenicidade e insuficiente eficiência de liberação, o que pode ser devido à rápida degradação de peptídeos extracelulares que se difundem rapidamente do local de administração, o que leva à captação insuficiente de antígenos pelas células imunes7. Portanto, é necessário superar esses obstáculos com a tecnologia de entrega de vacinas.
OVA 257-264, o epítopo257-264 de ligação MHC classe I expresso como uma proteína de fusão, é um epítopo modelo frequentemente usado8. Além disso, o OVA257-264 é crucial para a resposta imune adaptativa contra tumores, que depende da resposta citotóxica de linfócitos T (CTL). É mediada por células T CD8+ antígeno-específicas no tumor, que são induzidas pelo peptídeo OVA257-264 . Caracteriza-se pela insuficiência de granzima B, que é liberada por células T citotóxicas, levando à apoptose das células-alvo8. No entanto, a administração livre do peptídeo OVA257-264 pode induzir pouca atividade da CTL porque a captação desses antígenos ocorre em células inespecíficas em vez de células apresentadoras de antígenos (APCs). A deficiência de estimulação imunológica adequada resulta em atividade da CTL5. Portanto, a indução de atividade eficaz da CTL exige avanços consideráveis.
Devido à barreira proporcionada pelas células epiteliais e à secreção contínua de muco, antígenos vacinais são rapidamente removidos da mucosanasal9,10. O desenvolvimento de um vetor vacinal eficiente que possa atravessar o tecido mucoso é crucial, pois as células apresentadoras de antígenos estão situadas sob o epitéliomucoso9. A injeção intranasal de vacinas teoricamente induz imunidade da mucosa para combater a infecção da mucosa11. Além disso, a administração nasal é um método eficaz e seguro de administração de vacinas, devido à sua conveniência, à evitação da administração intestinal e à melhor adesão do paciente7. Portanto, a liberação nasal é um bom meio de administração para a nova nanovacina de epítopos peptídicos.
Vários biomateriais sintéticos foram desenvolvidos para combinar epítopos de interações célula-tecido e célula-célula. Certas proteínas bioativas, como Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), foram introduzidas como parte da estrutura do hidrogel para conferir bioatividade12. Este peptídeo provavelmente contribui para a ligação celular, migração, e crescimento13 e liga integrinas α 3β1 e α6β1 para interagir com diferentes tipos de células cancerosas. O IKVAV é um peptídeo de adesão celular derivado da cadeia 1 da proteína da membrana basal da laminina αque foi originalmente utilizado para modelar o microambiente neural e causar a diferenciação neuronal14. Portanto, encontrar um veículo de entrega eficiente para esta nova vacina é importante para o controle da doença.
Sistemas de emulsão recentemente relatados, como W805EC e MF59, também têm sido compostos para a liberação na cavidade nasal de vacina inativada contra influenza ou antígeno de superfície recombinante da hepatite B e ilustrados para desencadear imunidade tanto da mucosa quanto dasistêmica15. As nanoemulsões (NEs) têm as vantagens de fácil administração e conveniente co-formação com adjuvantes efetivos em comparação com sistemas de liberação de mucosa particulada16. Tem sido relatado que as vacinas em nanoemulsão alteram o fenótipo alérgico de forma sustentada, diferente da dessensibilização tradicional, o que resulta em efeitos supressivos de longo prazo17. Outros relataram que nanoemulsões combinadas com antígenos imunodominantes específicos para o M. tuberculosis poderiam induzir respostas celulares potentes da mucosa e conferir proteção significativa18. Portanto, uma nova nanovacina auto-montada intranasal com o peptídeo sintético IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, o peptídeo que consiste em IKVAV ligado ao OVA257-264) foi projetada. É importante avaliar esta nova nanovacina sistematicamente.
O objetivo deste protocolo é avaliar sistematicamente as características físico-químicas, toxicidade e estabilidade da nanovacina, detectar se a captação do antígeno e os efeitos protetores e terapêuticos são potencializados por meios técnicos e elaborar os principais conteúdos experimentais. Neste estudo, estabelecemos uma série de protocolos para estudar as características físico-químicas e a estabilidade, determinar a magnitude da toxicidade do I-OVA NE para células BEAS-2B por CCK-8, e observar a capacidade de apresentação de antígenos de células BEAS-2B para a vacina usando microscopia confocal, avaliar os perfis de liberação desta nova nanovacina in vivo e in vitro, e detectar o efeito protetor e terapêutico desta vacina usando um modelo de camundongo portador de tumor E.G7-OVA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning Incorporated, USA</td>
			<td>CLS3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad 6.0 microplate reader</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA</td>
			<td>&#160;Bio-Rad 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK-8 kits</td>
			<td>Dojindo, Japan</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>5811000398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone (Life Technology, USA)</td>
			<td>SH30088.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-labeled I-OVA</td>
			<td>Shanghai Botai 
			Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HF 90/240 Incubator</td>
			<td>Heal Force, Switzerland</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC&#160;</td>
			<td>Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd.</td>
			<td>E2695</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon,Japan</td>
			<td>DSZ5000X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPC-208</td>
			<td>Chong Qing University, China</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS system&#160;</td>
			<td>Caliper Life Science Limited Company</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1230 TEM</td>
			<td>JEOL Limited Company of Japan</td>
			<td>1230 TEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern NANO ZS</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd., UK</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPLA</td>
			<td>&#160;Invivogen 
			Lit. Co.</td>
			<td>tlrl-mpla</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin Sulfate Ointment</td>
			<td>Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd.</td>
			<td>H31022262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVA257&#8211;264</td>
			<td>Shanghai Botai 
			Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Hyclone (Life Technology, USA)</td>
			<td>SH30809.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA</td>
			<td>Shanghai Botai 
			Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td>Zeiss LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation, characteristics, toxicity, and efficacy evaluation of the nasal self-assembled nanoemulsion tumor vaccine in vitro and in vivo

Peptídeos de epítopos têm atraído ampla atenção no campo das vacinas tumorais por causa de sua segurança, alta especificidade e produção conveniente; em particular, alguns epítopos restritos ao MHC I podem induzir atividade citotóxica efetiva de linfócitos T para limpar células tumorais. Além disso, a administração nasal é uma técnica de administração eficaz e segura para vacinas tumorais devido à sua conveniência e melhor adesão do paciente. No entanto, peptídeos de epítopos são inadequados para entrega nasal devido à sua baixa imunogenicidade e falta de eficiência de entrega. Nanoemulsões (NEs) são sistemas termodinamicamente estáveis que podem ser carregados com antígenos e entregues diretamente à superfície da mucosa nasal. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) é o pentapeptídeo central da laminina, um peptídeo ligador de integrina expresso por células epiteliais respiratórias humanas. Neste estudo, uma vacina intranasal auto-montada do peptídeo epítopo NE tumoral contendo o peptídeo sintético IKVAV-OVA257-264 (I-OVA ) foi preparada por um método de emulsificação de baixa energia. A combinação de IKVAV e OVA257-264 pode aumentar a captação de antígenos pelas células epiteliais da mucosa nasal. Aqui, estabelecemos um protocolo para estudar as características físico-químicas por microscopia eletrônica de transmissão (MET), microscopia de força atômica (AFM) e espalhamento dinâmico de luz (DLS); estabilidade na presença de proteína mucina; toxicidade pelo exame da viabilidade celular das células BEAS-2B e dos tecidos nasal e pulmonar de camundongos C57BL/6; captação celular por microscopia confocal de varredura a laser (MMC); perfis de liberação por imagem de pequenos animais in vivo; e o efeito protetor e terapêutico da vacina usando um modelo portador de tumor E.G7. Antecipamos que o protocolo fornecerá pistas técnicas e teóricas para o desenvolvimento futuro de novas vacinas de mucosa de peptídeos epítopos de células T.

De acordo com o protocolo, concluímos o preparo e a avaliação experimental in vitro e in vivo da liberação da nanovacina tumoral nasal. MET, AFM e DLS são meios eficazes para a avaliação das características básicas do potencial zeta superficial e do tamanho de partícula da nanovacina (Figura 1). As células epiteliais BEAS-2B são um modelo de triagem útil para o teste de toxicidade in vitro de vacinas nasais (Figura 2A). A...

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Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo

Aqui, apresentamos métodos detalhados para a preparação e avaliação da vacina tumoral em nanoemulsão auto-montada nasal in vitro e in vivo.

Preparação, características, toxicidade e avaliação da eficácia da vacina contra tumores em nanoemulsão automontada nasal in vitro e in vivo

Epitope peptides have attracted widespread attention in the field of tumor vaccines because of their safety, high specificity, and convenient production; ...

A nova vacina em nanoemulsão apresenta grandes vantagens na terapia tática da doença. Esses efeitos são minimizados por propriedades como o chopismo tumoral único, a identificação de táticas específicas e a baixa toxicidade sistêmica. Antecipamos que o protocolo fornecerá pistas técnicas e teóricas para o desenvolvimento futuro de novas vacinas de mucosa de peptídeos ectipo de células T.Comece misturando um miligrama de lipídio monofosforol A com 100 microlitros de DMSO. Vórtice por cinco minutos e deixe dissolver por quatro horas em temperatura ambiente. Adicione quantitativamente TWEEN 80 e I-OVA.Misture os componentes e adicione esqualeno. Em seguida, adicione 100 microlitros de solução de MPLA à mistura preparada. Para preparar a vacina de nanoemulsão, adicione a solução misturada às gotículas de água a aproximadamente 70% do volume total e mexa suavemente para obter uma mistura transparente e de fácil fluidez.Para ensaios in vitro, comece com a reanimação das células epiteliais BEAS2B. Ligue o banho-maria e ajuste a temperatura para 37 graus Celsius. Descongele os frascos de células congeladas rapidamente em banho-maria, temperado a 37 graus Celsius.Após o descongelamento, pipetar rapidamente as células em um tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros e adicionar dois mililitros do meio de crescimento completo. Centrifugar o tubo a 129 G durante cinco minutos. Remova o supinatant e ressuspenda as células em dois mililitros do meio de crescimento completo.Depois de centrifugar as células mais uma vez, remova o supinatant e adicione seis mililitros de meio de crescimento completo para ressuspender as células. Em seguida, transfira as células para um frasco de cultura T25 e incube a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono a 5%. Quando a densidade celular atingir 80% a 90%, descarte o meio de cultura e lave as células duas vezes com dois mililitros de PBS.Adicione um mililitro de 0,25% de tripsina para digerir as células por um a dois minutos. Quando o arredondamento das células é observado, adicione imediatamente quatro mililitros do meio de crescimento completo para neutralizar a tripsina. Misture e aspirar as amostras em um tubo centrífugo estéril de 15 mililitros.Centrifugar as amostras a 129 G durante cinco minutos. Retire o supinatant e ressuspenda as células em um mililitro de meio completo RPMI 1640. Use 20 microlitros da suspensão celular para contagem de células e dilua as células para uma vez 10 a quinta células por mililitro.Em seguida, plaquear as células BEAS2B a uma densidade de uma vez 10 a quarta células por poço em placas de 96 poços em 100 microlitros de meio completo RPMI 1640 e pré-incubar as placas por 24 horas, como demonstrado anteriormente. Ao final da incubação, descarte o supinatant e adicione 100 microlitros de RPMI 1640 a cada poço da placa de 96 poços. Adicionar 100 microlitros cada de nanoemulsão I-OVA, I-OVA misturado com BNE e I-OVA pré-diluído com um meio de crescimento completo em várias concentrações finais com BNE como controle e incubar por 24 horas a 37 graus Celsius.Quando a incubação estiver completa, remova o meio e transfira a placa para um local escuro. Adicione 90 microlitros de meio de crescimento completo e 10 microlitros de solução CCK8 a cada poço da placa. Incubar a placa por duas horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Meça a absorbância de cada poço a 450 nanômetros usando um leitor de placas marcado com enzima. Use pontas de pipeta de 10 microlitros para realizar a imunização nasal dos camundongos com I-OVA, I-OVA mais BNE e I-OVA NE por três dias. Utilizar BNE e PBA como controle experimental.Em seguida, cortar amostras de tecidos nasais com tesoura de aproximadamente três milímetros de espessura e colocá-las em paraformaldeído a 4%. Remover os tecidos pulmonares e fixar os tecidos nasais e pulmonares inteiros em paraformaldeído a 4% por 24 horas. MET e AFM são utilizados para a avaliação de características básicas do potencial zeta de superfície e do tamanho de partícula da nanovacina.Tamanhos de partículas, índices de polidispersidade, potenciais zeta e mobilidade eletroforética do I-OVA NE em análises de estabilidade de musina são mostrados. A viabilidade relativa das células BEAS2B é superior a 80% em culturas expostas a diferentes concentrações peptídicas de I-OVA, BNE+I-OVA e I-OVA NE por 24 horas. O grupo I-OVA EN não apresentou toxicidade óbvia da mucosa, dano tecidual, sangramento ou infiltração de células inflamatórias.As células epiteliais BEAS2B capturaram mais I-OVA NE marcadas com FITC do que a solução aquosa. O efeito de liberação sustentada do I-OVA NE in vitro foi analisado usando o sistema IV-IS. A vacina I-OVA NE teve um efeito de liberação sustentada em comparação com a solução aquosa de I-OVA.No grupo I-OVA NE, o tempo percentual de sobrevida é maior em comparação com outros grupos, e o volume tumoral foi significativamente menor, sugerindo que tem um melhor efeito preventivo de proteção do que os outros grupos. No modelo terapêutico, a mediana do tempo de sobrevida foi significativamente diferente entre os diferentes grupos. O volume tumoral do grupo I-OVA NE foi significativamente menor do que o do grupo I-OVA.Mexer a mistura uniformemente é importante neste procedimento. Caso contrário, reduzirá a eficiência das nanovacinas.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Isolamento T de linfócitos humanos, Cultura e Análise da Migração In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Imunologia e Infecção

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Análise quantitativa de todos Influenza Tipo A Hemaglutininas Virais e neuraminidases usando anticorpos Universal em Ensaios Blot simples slot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Uso de meio de escarro Artificial para testar a eficácia antibiótica contra<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Em condições mais relevantes para o Pulmão Fibrose Cística

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Geração de Arenavirus recombinante de Desenvolvimento de Vacinas no FDA-approved células Vero

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

A Enzima de Restrição método baseado Clonagem para avaliar a<em&gt; In vitro</em&gt; Replicação Capacidade de HIV-1 do subtipo C gag-MJ4 quiméricos Vírus

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Análise do mediada por Myd88 Cellular resposta imune a vírus do Nilo Ocidental Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Avaliação da eficácia e toxicidade de RNAs Segmentação HIV-1 Produção para uso em Gene ou Quimioterapia

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Quantificar o humano Monocyte Chemotaxis In Vitro e linfócitos murino tráfico Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Avaliação das respostas do hospedeiro-patógeno e eficácia da vacina em camundongos

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

Teste in vitro ELISA para avaliar a potência da vacina antirrábica

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...