Name: preparation, characteristics, toxicity, and efficacy evaluation of the nasal self-assembled nanoemulsion tumor vaccine in vitro and in vivo
Uploaded: 2022-09-28T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Это исследование было поддержано No 31670938, 32070924, 32000651 Программы Национального фонда естественных наук Китая, No 2014jcyjA0107 и No 2019jcyjA-msxmx0159 Проектной программы Фонда естественных наук Чунцина, No 2020XBK24 и No 2020XBK26 специальных проектов Армейского медицинского университета, а также No 202090031021 и No 202090031035 Национальной программы инноваций и предпринимательства для студентов колледжей.

Эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством по этической экспертизе благополучия животных на лабораторных животных (GB/T 35892-2018) и были одобрены Комитетом по благополучию и этике лабораторных животных Третьего военно-медицинского университета. Мышей усыпляли вн...

<ol>
	<li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2020:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).</li><li>Mohammed, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+and+effectiveness+of+the+COVID-19+vaccines+in+reducing+infection,+severity,+hospitalization,+and+mortality:+A+systematic+review.">The efficacy and effectiveness of the COVID-19 vaccines in reducing infection, severity, hospitalization, and mortality: A systematic review.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 18 (1), 2027160 (2022).</li><li>Tsung, K., Norton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+vaccine,+immunological+memory+and+cancer+cure.">In situ vaccine, immunological memory and cancer cure.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 12 (1), 117-119 (2016).</li><li>Abd-Aziz, N., Poh, C. L., Ding, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+peptide-based+vaccines+for+cancer.">Development of peptide-based vaccines for cancer.</a> Journal of Oncology. 2022, 9749363 (2022).</li><li>Mochizuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+antigenic+peptides+complexed+with+beta-glucan+induces+potent+cytotoxic+T-lymphocyte+activity+in+combination+with+CpG-ODNs.">Immunization with antigenic peptides complexed with beta-glucan induces potent cytotoxic T-lymphocyte activity in combination with CpG-ODNs.</a> Journal of Controlled Release. 220, 495-502 (2015).</li><li>Kalita, P., Tripathi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+advances+in+the+design+of+peptide-based+vaccines.">Methodological advances in the design of peptide-based vaccines.</a> Drug Discovery Today. 27 (5), 1367-1380 (2022).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+self-assembled+epitope+peptide+nanoemulsion+vaccine+targeting+nasal+mucosal+epithelial+cell+for+reinvigorating+CD8(+)+T+cell+immune+activity+and+inhibiting+tumor+progression.">A novel self-assembled epitope peptide nanoemulsion vaccine targeting nasal mucosal epithelial cell for reinvigorating CD8(+) T cell immune activity and inhibiting tumor progression.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 183, 1891-1902 (2021).</li><li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OVA-specific+CD8++T+cells+do+not+express+granzyme+B+during+anterior+chamber+associated+immune+deviation.">OVA-specific CD8+ T cells do not express granzyme B during anterior chamber associated immune deviation.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 244 (10), 1315-1321 (2006).</li><li>Suzuki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+hyaluronic+acid-coated+polymeric+micelles+for+nasal+vaccine+delivery.">Preparation of hyaluronic acid-coated polymeric micelles for nasal vaccine delivery.</a> Biomaterials Science. 10 (8), 1920-1928 (2022).</li><li>Georas, S. N., Rezaee, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+barrier+function:+at+the+front+line+of+asthma+immunology+and+allergic+airway+inflammation.">Epithelial barrier function: at the front line of asthma immunology and allergic airway inflammation.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 509-520 (2014).</li><li>Lam, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nasal+omicron+vaccine+booster+elicits+potent+neutralizing+antibody+response+against+emerging+SARS-CoV-2+variants.">A nasal omicron vaccine booster elicits potent neutralizing antibody response against emerging SARS-CoV-2 variants.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 11 (1), 964-967 (2022).</li><li>Chai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+functional+recovery+of+rat+transected+spinal+cord+by+peptide-grafted+PNIPAM+based+hydrogel.">Improved functional recovery of rat transected spinal cord by peptide-grafted PNIPAM based hydrogel.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 210, 112220 (2022).</li><li>Paiva Dos Santos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+purification+and+characterization+of+an+elastin-like+polypeptide+containing+the+Ile-Lys-Val-Ala-Val+(IKVAV)+peptide+for+tissue+engineering+applications.">Production, purification and characterization of an elastin-like polypeptide containing the Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) peptide for tissue engineering applications.</a> Journal of Biotechnology. 298, 35-44 (2019).</li><li>Okur, A. C., Erkoc, P., Kizilel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+cells+via+tumor-homing+peptide+CREKA+functional+PEG+nanoparticles.">Targeting cancer cells via tumor-homing peptide CREKA functional PEG nanoparticles.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 147, 191-200 (2016).</li><li>Makidon, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+evaluation+of+a+novel+nanoemulsion-based+hepatitis+B+mucosal+vaccine.">Pre-clinical evaluation of a novel nanoemulsion-based hepatitis B mucosal vaccine.</a> PLoS One. 3 (8), 2954 (2008).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oil-in-ionic+liquid+nanoemulsion-based+intranasal+delivery+system+for+influenza+split-virus+vaccine.">Oil-in-ionic liquid nanoemulsion-based intranasal delivery system for influenza split-virus vaccine.</a> Journal of Controlled Release. 346, 380-391 (2022).</li><li>O'Konek, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+nanoemulsion+vaccine+confers+long-lasting+immunomodulation+and+sustained+unresponsiveness+in+a+murine+model+of+milk+allergy.">Intranasal nanoemulsion vaccine confers long-lasting immunomodulation and sustained unresponsiveness in a murine model of milk allergy.</a> Allergy. 75 (4), 872-881 (2020).</li><li>Ahmed, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+nanoemulsion+vaccine+induces+mucosal+Interleukin-17+responses+and+confers+protection+upon+Mycobacterium+tuberculosis+challenge+in+mice.">A novel nanoemulsion vaccine induces mucosal Interleukin-17 responses and confers protection upon Mycobacterium tuberculosis challenge in mice.</a> Vaccine. 35 (37), 4983-4989 (2017).</li><li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+systemic+and+mucosal+immunity+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+infection+by+a+novel+nanoemulsion+adjuvant+vaccine.">Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated-macrophage-membrane-coated+nanoparticles+for+improved+photodynamic+immunotherapy.">Tumor-associated-macrophage-membrane-coated nanoparticles for improved photodynamic immunotherapy.</a> Nano Letters. 21 (13), 5522-5531 (2021).</li><li>Prasanna, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+nanoscale+drug+delivery+and+the+future+of+nano-vaccine+development+for+leishmaniasis+-+A+review.">Current status of nanoscale drug delivery and the future of nano-vaccine development for leishmaniasis - A review.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 141, 111920 (2021).</li><li>George, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+defects+on+plate-shaped+silver+nanoparticles+contribute+to+its+hazard+potential+in+a+fish+gill+cell+line+and+zebrafish+embryos.">Surface defects on plate-shaped silver nanoparticles contribute to its hazard potential in a fish gill cell line and zebrafish embryos.</a> ACS Nano. 6 (5), 3745-3759 (2012).</li><li>Jafari Eskandari, M., Gostariani, R., Asadi Asadabad, M., Singh, D., Condurache-Bota, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+Electron+Microscopy+of+Nanomaterials.">Transmission Electron Microscopy of Nanomaterials.</a> Electron Crystallography. , (2020).</li><li>Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+nanoindentation+method+on+collagen+fibrils.">Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils.</a> Materials. 15 (7), 2477 (2022).</li><li>Zielinska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+nanoparticles:+Production,+characterization,+toxicology+and+ecotoxicology.">Polymeric nanoparticles: Production, characterization, toxicology and ecotoxicology.</a> Molecules. 25 (16), 3731 (2020).</li><li>Doncom, K. E. B., Blackman, L. D., Wright, D. B., Gibson, M. I., O'Reilly, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersity+effects+in+polymer+self-assemblies:+A+matter+of+hierarchical+control.">Dispersity effects in polymer self-assemblies: A matter of hierarchical control.</a> Chemical Society Reviews. 46 (14), 4119-4134 (2017).</li><li>Pei, M., Li, H., Zhu, Y., Lu, J., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evidence+of+oncofetal+antigen+and+TLR-9+agonist+co-delivery+by+alginate+nanovaccines+for+liver+cancer+immunotherapy.">In vitro evidence of oncofetal antigen and TLR-9 agonist co-delivery by alginate nanovaccines for liver cancer immunotherapy.</a> Biomaterials Science. 10 (11), 2865-2876 (2022).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Titanium+dioxide+nanoparticles+induced+reactive+oxygen+species+(ROS)+related+changes+of+metabolomics+signatures+in+human+normal+bronchial+epithelial+(BEAS-2B)+cells.">Titanium dioxide nanoparticles induced reactive oxygen species (ROS) related changes of metabolomics signatures in human normal bronchial epithelial (BEAS-2B) cells.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 444, 116020 (2022).</li><li>Kumar, V., Sharma, N., Maitra, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+toxicity+assessment+of+nanoparticles.">In vitro and in vivo toxicity assessment of nanoparticles.</a> International Nano Letters. 7 (4), 243-256 (2017).</li><li>Tong, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunopotentiator,+ophiopogonin+D,+encapsulated+in+a+nanoemulsion+as+a+robust+adjuvant+to+improve+vaccine+efficacy.">An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy.</a> Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).</li><li>Elliott, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy:+Principles+and+modern+practices.">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).</li><li>Huang, Y., Zou, Y., Lin, L., Zheng, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ginsenoside+Rg1+activates+dendritic+cells+and+acts+as+a+vaccine+adjuvant+inducing+protective+cellular+responses+against+lymphomas.">Ginsenoside Rg1 activates dendritic cells and acts as a vaccine adjuvant inducing protective cellular responses against lymphomas.</a> DNA and Cell Biology. 36 (12), 1168-1177 (2017).</li></ol>

Нановакцины, функционализированные мембранами иммуноцитов, имеют большие преимущества в терапии, направленной на болезнь, а побочные эффекты сводятся к минимуму благодаря таким свойствам, как уникальный опухолевый тропизм, идентификация специфических мишеней, длительная циркуляция...

Являясь одной из наиболее важных инноваций в области общественного здравоохранения, вакцины играют ключевую роль в борьбе с глобальным бременем болезней человека1. Например, в настоящее время тестируется более 120 вакцин-кандидатов от болезней COVID-19, некоторые из которых были одобрены во многих странах2. В недавних сообщениях говорится, что противораковые вакцины эффективно улучшили прогресс клинического лечения рака, поскольку они направляют иммунную систему больных раком на распознавание антигенов как чужеродных для организма3. Кроме того, множественные Т-клеточные эпитопы, расположенные внутри или снаружи опухолевых клеток, могут быть использованы для разработки пептидных вакцин, которые показали преимущества в лечении метастатического рака из-за отсутствия значительной токсичности, связанной с лучевой терапией и химиотерапией 4,5. С середины 1990-х годов доклинические и клинические испытания для лечения опухолей проводились в основном с использованием антигенных пептидных вакцин, но лишь немногие вакцины проявляют адекватный терапевтический эффект у онкологических больных6. Кроме того, противораковые вакцины с пептидными эпитопами имеют плохую иммуногенность и недостаточную эффективность доставки, что может быть связано с быстрой деградацией внеклеточных пептидов, которые быстро диффундируют от места введения, что приводит к недостаточному поглощению антигена иммунными клетками7. Поэтому необходимо преодолевать эти препятствия с помощью технологии доставки вакцин.
OVA 257-264, MHC класс I-связывающий эпитоп257-264, экспрессируемый в виде слитого белка, является часто используемым модельным эпитопом8. Кроме того, OVA257-264 имеет решающее значение для адаптивного иммунного ответа против опухолей, который зависит от ответа цитотоксического Т-лимфоцита (CTL). Он опосредован антиген-специфическими CD8+ Т-клетками в опухоли, которые индуцируются пептидом OVA257-264 . Характеризуется недостаточным количеством гранзима В, который высвобождается цитотоксическими Т-клетками, что приводит к апоптозу клеток-мишеней8. Однако введение свободного пептида OVA257-264 может вызывать небольшую активность CTL, поскольку поглощение этих антигенов происходит в неспецифических клетках, а не в антигенпрезентирующих клетках (APC). Дефицит соответствующей иммунной стимуляции приводит к активности CTL5. Следовательно, индукция эффективной активности CTL требует значительного прогресса.
Благодаря барьеру, обеспечиваемому эпителиальными клетками, и непрерывной секреции слизи вакцинные антигены быстро удаляются из слизистой оболочки носа 9,10. Разработка эффективного вакцинного вектора, который может проходить через ткань слизистой оболочки, имеет решающее значение, поскольку антигенпрезентирующие клетки расположены под эпителиемслизистой оболочки 9. Интраназальное введение вакцин теоретически индуцирует иммунитет слизистой оболочки для борьбы с инфекцией слизистой оболочки11. Кроме того, назальная доставка является эффективным и безопасным методом введения вакцин из-за ее удобства, предотвращения кишечного введения и улучшения комплаентности пациентов7. Таким образом, назальная доставка является хорошим средством введения новой пептидной эпитопной нановакцины.
Было разработано несколько синтетических биоматериалов для объединения эпитопов межклеточных и клеточных взаимодействий. Некоторые биологически активные белки, такие как Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), были введены как часть структуры гидрогеля для придания биологической активности12. Этот пептид, вероятно, способствует прикреплению, миграции и ростуклеток 13 и связывает интегрины α 3β1 и α6β1 для взаимодействия с различными типами раковых клеток. IKVAV представляет собой пептид клеточной адгезии, полученный из белка базальной мембраны ламинина αцепи 1, который первоначально использовался для моделирования нейронного микроокружения и вызывания дифференцировки нейронов14. Поэтому поиск эффективного средства доставки этой новой вакцины важен для борьбы с болезнью.
Недавно зарегистрированные эмульсионные системы, такие как W805EC и MF59, также были составлены для доставки в нос инактивированной вакцины против гриппа или рекомбинантного поверхностного антигена гепатита В и проиллюстрированы как запускающие как слизистый, так и системный иммунитет15. Наноэмульсии (НЭ) обладают такими преимуществами, как простота введения и удобное совместное образование с эффективными адъювантами по сравнению с системами доставки слизистой оболочки твердых частиц16. Сообщалось, что наноэмульсионные вакцины изменяют аллергический фенотип устойчивым образом, отличным от традиционной десенсибилизации, что приводит к долгосрочным подавляющим эффектам17. Другие сообщили, что наноэмульсии в сочетании с Mtb-специфическими иммунодоминантными антигенами могут индуцировать мощные реакции клеток слизистой оболочки и обеспечивать значительную защиту18. Поэтому была разработана новая интраназальная самоорганизующаяся нановакцина с синтетическим пептидом IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, пептид, состоящий из IKVAV, связанного с OVA257-264). Важно систематически оценивать эту новую нановакцину.
Целью этого протокола является систематическая оценка физико-химических характеристик, токсичности и стабильности нановакцины, определение того, усиливается ли поглощение антигена, а также защитные и терапевтические эффекты с помощью технических средств, и уточнение основного содержания эксперимента. В этом исследовании мы установили ряд протоколов для изучения физико-химических характеристик и стабильности, определения величины токсичности клеток I-OVA NE to BEAS-2B с помощью CCK-8 и наблюдения за антигенпрезентирующей способностью клеток BEAS-2B к вакцине с помощью конфокальной микроскопии, оценки профилей высвобождения этой новой нановакцины in vivo и in vitroи определить защитный и терапевтический эффект этой вакцины с помощью модели мыши с опухолью E.G7-OVA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning Incorporated, USA</td>
			<td>CLS3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad 6.0 microplate reader</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA</td>
			<td>&#160;Bio-Rad 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK-8 kits</td>
			<td>Dojindo, Japan</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>5811000398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone (Life Technology, USA)</td>
			<td>SH30088.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-labeled I-OVA</td>
			<td>Shanghai Botai 
			Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HF 90/240 Incubator</td>
			<td>Heal Force, Switzerland</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC&#160;</td>
			<td>Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd.</td>
			<td>E2695</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon,Japan</td>
			<td>DSZ5000X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPC-208</td>
			<td>Chong Qing University, China</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS system&#160;</td>
			<td>Caliper Life Science Limited Company</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1230 TEM</td>
			<td>JEOL Limited Company of Japan</td>
			<td>1230 TEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern NANO ZS</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd., UK</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPLA</td>
			<td>&#160;Invivogen 
			Lit. Co.</td>
			<td>tlrl-mpla</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin Sulfate Ointment</td>
			<td>Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd.</td>
			<td>H31022262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVA257&#8211;264</td>
			<td>Shanghai Botai 
			Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Hyclone (Life Technology, USA)</td>
			<td>SH30809.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA</td>
			<td>Shanghai Botai 
			Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td>Zeiss LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation, characteristics, toxicity, and efficacy evaluation of the nasal self-assembled nanoemulsion tumor vaccine in vitro and in vivo

Эпитопные пептиды привлекли широкое внимание в области противоопухолевых вакцин из-за их безопасности, высокой специфичности и удобного производства; в частности, некоторые эпитопы, ограниченные MHC I, могут индуцировать эффективную активность цитотоксических Т-лимфоцитов для очистки опухолевых клеток. Кроме того, назальное введение является эффективным и безопасным методом доставки опухолевых вакцин из-за его удобства и улучшенной комплаентности пациентов. Однако эпитопные пептиды непригодны для назальной доставки из-за их плохой иммуногенности и недостаточной эффективности доставки. Наноэмульсии (НЭ) представляют собой термодинамически стабильные системы, которые могут быть загружены антигенами и доставлены непосредственно на поверхность слизистой оболочки носа. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) является основным пентапептидом ламинина, интегринсвязывающего пептида, экспрессируемого респираторными эпителиальными клетками человека. В этом исследовании методом низкоэнергетического эмульгирования была получена интраназальная самоорганизующаяся эпитопная пептидная пептидная опухолевая вакцина NE, содержащая синтетический пептид IKVAV-OVA257-264 (I-OVA ). Комбинация IKVAV и OVA257-264 может усиливать поглощение антигена эпителиальными клетками слизистой оболочки носа. Здесь мы устанавливаем протокол для изучения физико-химических характеристик с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), атомно-силовой микроскопии (АСМ) и динамического рассеяния света (DLS); стабильность в присутствии белка муцина; токсичность путем изучения жизнеспособности клеток BEAS-2B, а также тканей носа и легких мышей C57BL/6; клеточное поглощение с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM); профили высвобождения путем визуализации мелких животных in vivo; и защитный и терапевтический эффект вакцины с использованием модели E.G7, несущей опухоль. Мы ожидаем, что протокол предоставит технические и теоретические подсказки для будущей разработки новых Т-клеточных эпитопных пептидных вакцин для слизистых оболочек.

В соответствии с протоколом мы завершили подготовку и экспериментальную оценку in vitro и in vivo доставки нановакцины против опухоли носа. TEM, AFM и DLS являются эффективными средствами для оценки основных характеристик поверхностного дзета-потенциала и размера частиц нановакцины (<st...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo

Здесь мы представляем подробные методы приготовления и оценки назальной самоорганизующейся наноэмульсионной противоопухолевой вакцины in vitro и in vivo.

Препарат, характеристики, токсичность и оценка эффективности назальной самоорганизующейся наноэмульсионной противоопухолевой вакцины in vitro и in vivo

Epitope peptides have attracted widespread attention in the field of tumor vaccines because of their safety, high specificity, and convenient production; ...

Новая наноэмульсионная вакцина имеет большие преимущества в тактике лечения заболеваний. Эти эффекты сведены к минимуму благодаря таким свойствам, как уникальный опухолевый шопизм, идентификация специфической тактики и низкая системная токсичность. Мы ожидаем, что протокол предоставит технические и теоретические подсказки для будущей разработки новых Т-клеточных пептидных вакцин для слизистой оболочки.Начните с смешивания одного миллиграмма монофосфоролового липида А со 100 микролитрами ДМСО. Встряхните в течение пяти минут и оставьте растворяться на четыре часа при комнатной температуре. Количественно добавьте TWEEN 80 и I-OVA.Смешайте компоненты и добавьте сквален. Далее в приготовленную смесь добавляют 100 микролитров раствора МПЛА. Чтобы приготовить наноэмульсионную вакцину, добавьте смешанный раствор в капли воды примерно на 70% от общего объема и осторожно перемешайте, чтобы получить прозрачную и легко текучую смесь.Для анализов in vitro начните с оживления эпителиальных клеток BEAS2B. Включите водяную баню и отрегулируйте температуру до 37 градусов по Цельсию. Быстро разморозьте замороженные флаконы с клетками на водяной бане, закаленной при температуре 37 градусов по Цельсию.После размораживания быстро поместите клетки пипеткой в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров и добавьте два миллилитра полной питательной среды. Центрифугируйте пробирку при 129 G в течение пяти минут. Удалите супинатант и ресуспендируйте клетки в двух миллилитрах полной питательной среды.После повторного центрифугирования клеток удалите супинатант и добавьте шесть миллилитров полной питательной среды, чтобы ресуспендировать клетки. Затем перенесите клетки в колбу для культивирования T25 и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в 5%-ном инкубаторе углекислого газа. Как только плотность клеток достигнет 80-90%, выбросьте питательную среду и дважды промойте клетки двумя миллилитрами PBS.Добавьте один миллилитр 0,25% трипсина, чтобы переварить клетки в течение одной-двух минут. Когда наблюдается округление клеток, немедленно добавляют четыре миллилитра полной питательной среды для нейтрализации трипсина. Смешайте и аспирируйте образцы в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров.Центрифугируйте образцы при 129 г в течение пяти минут. Удалите супинатант и ресуспендируйте клетки в одном миллилитре полной среды RPMI 1640. Используйте 20 микролитров клеточной суспензии для подсчета клеток и разбавьте клетки до 10 раз до пятых клеток на миллилитр.Затем помещают ячейки BEAS2B с плотностью от 10 до четвертой ячейки на лунку в 96 луночных планшетах в 100 микролитрах полной среды RPMI 1640 и предварительно инкубируют планшеты в течение 24 часов, как показано ранее. По окончании инкубации выбросьте супинатант и добавьте по 100 микролитров RPMI 1640 в каждую лунку 96-луночной пластины. Добавьте по 100 микролитров наноэмульсии I-OVA, I-OVA, смешанную с BNE, и I-OVA, предварительно разбавленную полной питательной средой в различных конечных концентрациях с BNE в качестве контроля, и инкубируйте в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия.Как только инкубация будет завершена, удалите среду и перенесите тарелку в темное место. Добавьте 90 микролитров полной питательной среды и 10 микролитров раствора CCK8 в каждую лунку планшета. Выдерживайте тарелку в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.Измерьте поглощение каждой лунки на глубине 450 нанометров с помощью планшетного считывателя с ферментной меткой. Используйте 10-литровые наконечники пипеток для проведения назальной иммунизации мышей I-OVA, I-OVA плюс BNE и I-OVA NE в течение трех дней. Используйте BNE и PBA в качестве экспериментального контроля.После этого вырежьте ножницами образцы тканей носа толщиной около трех миллиметров и поместите их в 4% параформальдегид. Удалите ткани легких и зафиксируйте нос и целые легочные ткани в 4% параформальдегиде в течение 24 часов. ТЭМ и АСМ используются для оценки основных характеристик поверхностного дзета-потенциала и размера частиц нановакцины.Показаны размеры частиц, показатели полидисперсности, дзета-потенциалы и электрофорезная подвижность I-OVA NE в анализе стабильности мусина. Относительная жизнеспособность клеток BEAS2B составляет более 80% в культурах, подвергшихся воздействию различных концентраций пептидов I-OVA, BNE+I-OVA и I-OVA NE в течение 24 часов. В группе I-OVA EN не было явной токсичности слизистой оболочки, повреждения тканей, кровотечения или воспалительной клеточной инфильтрации.Эпителиальные клетки BEAS2B захватили больше метеных FITC I-OVA NE, чем его водный раствор. Эффект замедленного высвобождения I-OVA NE in vitro был проанализирован с использованием системы IV-IS. Вакцина I-OVA NE имела эффект замедленного высвобождения по сравнению с водным раствором I-OVA.В группе I-OVA NE процент выживаемости выше по сравнению с другими группами, а объем опухоли был значительно меньше, что позволяет предположить, что она имеет лучший эффект профилактической защиты, чем в других группах. В терапевтической модели среднее время выживания значительно различалось между разными группами. Объем опухоли в группе I-OVA NE был значительно меньше, чем в группе I-OVA.В этой процедуре важно равномерное перемешивание смеси. В противном случае это снизит эффективность нановакцин.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Человеческий Т-лимфоцитов изоляции, культуры и анализ миграции In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Количественный анализ всех гриппа типа Вирусный Hemagglutinins и нейраминидазы использованием универсального антител в простом Анализы Blot Слот

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Использование искусственного среднего мокроты для тестирования антибиотиков эффективность против<em&gt; Синегнойной палочки</em&gt; В условиях более актуальными для кистозного фиброза легких

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Генерация рекомбинантного ареновирус для разработки вакцины в FDA-Approved клетках Веро

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

Рестриктазой основе Клонирование метод оценки<em&gt; В пробирке</em&gt; Репликация Емкость ВИЧ-1 подтипа С Gag-MJ4 химерных вирусов

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro анализ MyD88-опосредованной клеточного иммунного ответа на вирус Западного Нила мутантный штамм инфекции

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Оценка эффективности и токсичности РНК Ориентация ВИЧ-1 Производство для использования в генной или терапии наркотиками

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Количественная оценка человека Моноцит хемотаксис в пробирке и мышиных лимфоцитов, торговля в естественных условиях

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Оценка хост возбудитель ответы и эффективность вакцины в мышей

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

В Vitro ELISA тест для оценки бешенства вакцины потенции

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...