Name: preparation, characteristics, toxicity, and efficacy evaluation of the nasal self-assembled nanoemulsion tumor vaccine in vitro and in vivo
Uploaded: 2022-09-28T13:40:00
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Este estudio fue apoyado por el No. 31670938, 32070924, 32000651 del Programa de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China, No. 2014jcyjA0107 y No. 2019jcyjA-msxmx0159 del Programa de Proyectos de la Fundación de Ciencias Naturales de Chongqing, No. 2020XBK24 y No. 2020XBK26 de los proyectos especiales de la Universidad Médica del Ejército, y No. 202090031021 y No. 202090031035 del Programa Nacional de Innovación y Emprendimiento para estudiantes universitarios.

Los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para la revisión ética del bienestar animal (GB / T 35892-2018) y fueron aprobados por el Comité de Ética y Bienestar de los Animales de Laboratorio de la Tercera Universidad Médica Militar. Los ratones fueron sacrificados por una inyección intraperitoneal de 100 mg / kg de pentobarbital de sodio al 1%.
1. Preparación del I-OVA NE
<ol><li>Mezcle 1 mg de monofosforilo lípido A (MPLA) con 100 μL...

<ol>
	<li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2020:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).</li><li>Mohammed, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+and+effectiveness+of+the+COVID-19+vaccines+in+reducing+infection,+severity,+hospitalization,+and+mortality:+A+systematic+review.">The efficacy and effectiveness of the COVID-19 vaccines in reducing infection, severity, hospitalization, and mortality: A systematic review.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 18 (1), 2027160 (2022).</li><li>Tsung, K., Norton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+vaccine,+immunological+memory+and+cancer+cure.">In situ vaccine, immunological memory and cancer cure.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 12 (1), 117-119 (2016).</li><li>Abd-Aziz, N., Poh, C. L., Ding, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+peptide-based+vaccines+for+cancer.">Development of peptide-based vaccines for cancer.</a> Journal of Oncology. 2022, 9749363 (2022).</li><li>Mochizuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+antigenic+peptides+complexed+with+beta-glucan+induces+potent+cytotoxic+T-lymphocyte+activity+in+combination+with+CpG-ODNs.">Immunization with antigenic peptides complexed with beta-glucan induces potent cytotoxic T-lymphocyte activity in combination with CpG-ODNs.</a> Journal of Controlled Release. 220, 495-502 (2015).</li><li>Kalita, P., Tripathi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+advances+in+the+design+of+peptide-based+vaccines.">Methodological advances in the design of peptide-based vaccines.</a> Drug Discovery Today. 27 (5), 1367-1380 (2022).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+self-assembled+epitope+peptide+nanoemulsion+vaccine+targeting+nasal+mucosal+epithelial+cell+for+reinvigorating+CD8(+)+T+cell+immune+activity+and+inhibiting+tumor+progression.">A novel self-assembled epitope peptide nanoemulsion vaccine targeting nasal mucosal epithelial cell for reinvigorating CD8(+) T cell immune activity and inhibiting tumor progression.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 183, 1891-1902 (2021).</li><li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OVA-specific+CD8++T+cells+do+not+express+granzyme+B+during+anterior+chamber+associated+immune+deviation.">OVA-specific CD8+ T cells do not express granzyme B during anterior chamber associated immune deviation.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 244 (10), 1315-1321 (2006).</li><li>Suzuki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+hyaluronic+acid-coated+polymeric+micelles+for+nasal+vaccine+delivery.">Preparation of hyaluronic acid-coated polymeric micelles for nasal vaccine delivery.</a> Biomaterials Science. 10 (8), 1920-1928 (2022).</li><li>Georas, S. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nasal+omicron+vaccine+booster+elicits+potent+neutralizing+antibody+response+against+emerging+SARS-CoV-2+variants.">A nasal omicron vaccine booster elicits potent neutralizing antibody response against emerging SARS-CoV-2 variants.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 11 (1), 964-967 (2022).</li><li>Chai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+functional+recovery+of+rat+transected+spinal+cord+by+peptide-grafted+PNIPAM+based+hydrogel.">Improved functional recovery of rat transected spinal cord by peptide-grafted PNIPAM based hydrogel.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 210, 112220 (2022).</li><li>Paiva Dos Santos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+purification+and+characterization+of+an+elastin-like+polypeptide+containing+the+Ile-Lys-Val-Ala-Val+(IKVAV)+peptide+for+tissue+engineering+applications.">Production, purification and characterization of an elastin-like polypeptide containing the Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) peptide for tissue engineering applications.</a> Journal of Biotechnology. 298, 35-44 (2019).</li><li>Okur, A. C., Erkoc, P., Kizilel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+cells+via+tumor-homing+peptide+CREKA+functional+PEG+nanoparticles.">Targeting cancer cells via tumor-homing peptide CREKA functional PEG nanoparticles.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 147, 191-200 (2016).</li><li>Makidon, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+evaluation+of+a+novel+nanoemulsion-based+hepatitis+B+mucosal+vaccine.">Pre-clinical evaluation of a novel nanoemulsion-based hepatitis B mucosal vaccine.</a> PLoS One. 3 (8), 2954 (2008).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oil-in-ionic+liquid+nanoemulsion-based+intranasal+delivery+system+for+influenza+split-virus+vaccine.">Oil-in-ionic liquid nanoemulsion-based intranasal delivery system for influenza split-virus vaccine.</a> Journal of Controlled Release. 346, 380-391 (2022).</li><li>O'Konek, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+nanoemulsion+vaccine+confers+long-lasting+immunomodulation+and+sustained+unresponsiveness+in+a+murine+model+of+milk+allergy.">Intranasal nanoemulsion vaccine confers long-lasting immunomodulation and sustained unresponsiveness in a murine model of milk allergy.</a> Allergy. 75 (4), 872-881 (2020).</li><li>Ahmed, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+nanoemulsion+vaccine+induces+mucosal+Interleukin-17+responses+and+confers+protection+upon+Mycobacterium+tuberculosis+challenge+in+mice.">A novel nanoemulsion vaccine induces mucosal Interleukin-17 responses and confers protection upon Mycobacterium tuberculosis challenge in mice.</a> Vaccine. 35 (37), 4983-4989 (2017).</li><li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+systemic+and+mucosal+immunity+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+infection+by+a+novel+nanoemulsion+adjuvant+vaccine.">Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated-macrophage-membrane-coated+nanoparticles+for+improved+photodynamic+immunotherapy.">Tumor-associated-macrophage-membrane-coated nanoparticles for improved photodynamic immunotherapy.</a> Nano Letters. 21 (13), 5522-5531 (2021).</li><li>Prasanna, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+nanoscale+drug+delivery+and+the+future+of+nano-vaccine+development+for+leishmaniasis+-+A+review.">Current status of nanoscale drug delivery and the future of nano-vaccine development for leishmaniasis - A review.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 141, 111920 (2021).</li><li>George, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+defects+on+plate-shaped+silver+nanoparticles+contribute+to+its+hazard+potential+in+a+fish+gill+cell+line+and+zebrafish+embryos.">Surface defects on plate-shaped silver nanoparticles contribute to its hazard potential in a fish gill cell line and zebrafish embryos.</a> ACS Nano. 6 (5), 3745-3759 (2012).</li><li>Jafari Eskandari, M., Gostariani, R., Asadi Asadabad, M., Singh, D., Condurache-Bota, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+Electron+Microscopy+of+Nanomaterials.">Transmission Electron Microscopy of Nanomaterials.</a> Electron Crystallography. , (2020).</li><li>Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+nanoindentation+method+on+collagen+fibrils.">Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils.</a> Materials. 15 (7), 2477 (2022).</li><li>Zielinska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+nanoparticles:+Production,+characterization,+toxicology+and+ecotoxicology.">Polymeric nanoparticles: Production, characterization, toxicology and ecotoxicology.</a> Molecules. 25 (16), 3731 (2020).</li><li>Doncom, K. E. B., Blackman, L. D., Wright, D. B., Gibson, M. I., O'Reilly, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersity+effects+in+polymer+self-assemblies:+A+matter+of+hierarchical+control.">Dispersity effects in polymer self-assemblies: A matter of hierarchical control.</a> Chemical Society Reviews. 46 (14), 4119-4134 (2017).</li><li>Pei, M., Li, H., Zhu, Y., Lu, J., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evidence+of+oncofetal+antigen+and+TLR-9+agonist+co-delivery+by+alginate+nanovaccines+for+liver+cancer+immunotherapy.">In vitro evidence of oncofetal antigen and TLR-9 agonist co-delivery by alginate nanovaccines for liver cancer immunotherapy.</a> Biomaterials Science. 10 (11), 2865-2876 (2022).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Titanium+dioxide+nanoparticles+induced+reactive+oxygen+species+(ROS)+related+changes+of+metabolomics+signatures+in+human+normal+bronchial+epithelial+(BEAS-2B)+cells.">Titanium dioxide nanoparticles induced reactive oxygen species (ROS) related changes of metabolomics signatures in human normal bronchial epithelial (BEAS-2B) cells.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 444, 116020 (2022).</li><li>Kumar, V., Sharma, N., Maitra, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+toxicity+assessment+of+nanoparticles.">In vitro and in vivo toxicity assessment of nanoparticles.</a> International Nano Letters. 7 (4), 243-256 (2017).</li><li>Tong, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunopotentiator,+ophiopogonin+D,+encapsulated+in+a+nanoemulsion+as+a+robust+adjuvant+to+improve+vaccine+efficacy.">An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy.</a> Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).</li><li>Elliott, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy:+Principles+and+modern+practices.">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).</li><li>Huang, Y., Zou, Y., Lin, L., Zheng, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ginsenoside+Rg1+activates+dendritic+cells+and+acts+as+a+vaccine+adjuvant+inducing+protective+cellular+responses+against+lymphomas.">Ginsenoside Rg1 activates dendritic cells and acts as a vaccine adjuvant inducing protective cellular responses against lymphomas.</a> DNA and Cell Biology. 36 (12), 1168-1177 (2017).</li></ol>

Las nanovacunas funcionalizadas con membranas de inmunocitos tienen grandes ventajas en la terapia dirigida a la enfermedad, y los efectos secundarios se minimizan por propiedades tales como tropismo tumoral único, la identificación de objetivos específicos, circulación prolongada, interacciones intercelulares mejoradas y baja toxicidad sistémica. También se pueden integrar fácilmente con otros módulos de tratamiento para tratar cánceres de forma cooperativa16,20<sup class="xre...

Como una de las innovaciones de salud pública más importantes, las vacunas desempeñan un papel clave en la lucha contra la carga mundial de enfermedades humanas1. Por ejemplo, en la actualidad, se están probando más de 120 vacunas candidatas para enfermedades COVID-19, algunas de las cuales han sido aprobadas en muchos países2. Informes recientes afirman que las vacunas contra el cáncer han mejorado efectivamente el progreso de los tratamientos clínicos contra el cáncer porque dirigen el sistema inmunológico de los pacientes con cáncer para reconocer los antígenos como extraños al cuerpo3. Además, múltiples epítopos de células T localizados dentro o fuera de las células tumorales pueden ser utilizados para diseñar vacunas peptídicas, que han mostrado ventajas en el tratamiento de cánceres metastásicos debido a la falta de toxicidad significativa asociada con la radioterapia y la quimioterapia 4,5. Desde mediados de la década de 1990, los ensayos preclínicos y clínicos para el tratamiento de tumores se han realizado principalmente utilizando vacunas de péptidos de antígeno, pero pocas vacunas exhiben un efecto terapéutico adecuado en pacientes con cáncer6. Además, las vacunas contra el cáncer con epítopos peptídicos tienen una inmunogenicidad deficiente y una eficiencia de administración insuficiente, lo que puede deberse a la rápida degradación de péptidos extracelulares que se difunden rápidamente desde el sitio de administración, lo que conduce a una absorción insuficiente de antígenos por las células inmunes7. Por lo tanto, es necesario superar estos obstáculos con la tecnología de administración de vacunas.
OVA 257-264, el epítopo MHC de unión a la clase I257-264 expresado como una proteína de fusión, es un epítopo modelo8 de uso frecuente. Además, OVA257-264 es crucial para la respuesta inmune adaptativa contra los tumores, que depende de la respuesta de los linfocitos T citotóxicos (CTL). Está mediada por células T CD8+ específicas de antígeno en el tumor, que son inducidas por el péptido OVA257-264 . Se caracteriza por una insuficiencia de granzima B, que es liberada por las células T citotóxicas, lo que lleva a la apoptosis de las células diana8. Sin embargo, la administración de péptidos OVA257-264 libres puede inducir poca actividad CTL porque la captación de estos antígenos ocurre en células no específicas en lugar de células presentadoras de antígeno (APC). La deficiencia de estimulación inmune adecuada resulta en actividad CTL5. Por lo tanto, la inducción de una actividad eficaz de CTL exige un avance considerable.
Debido a la barrera proporcionada por las células epiteliales y la secreción continua de moco, los antígenos de la vacuna se eliminan rápidamente de la mucosa nasal 9,10. El desarrollo de un vector vacunal eficiente que pueda pasar a través del tejido mucoso es crucial porque las células presentadoras de antígeno están situadas debajo del epitelio de la mucosa9. La inyección intranasal de vacunas teóricamente induce inmunidad mucosa para combatir la infección de la mucosa11. Además, la administración nasal es un método de administración eficaz y seguro para las vacunas debido a su conveniencia, la evitación de la administración intestinal y la mejora de la conformidad del paciente7. Por lo tanto, la administración nasal es un buen medio de administración para la nueva nanovacuna peptídica epitopo.
Se han ideado varios biomateriales sintéticos para combinar epítopos de tejido celular e interacciones célula-célula. Ciertas proteínas bioactivas, como Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), han sido introducidas como parte de la estructura del hidrogel para conferir bioactividad12. Este péptido probablemente contribuye a la unión celular, la migración y el crecimiento13 y se une a las integrinas α 3β1 y α6β1 para interactuar con diferentes tipos de células cancerosas. IKVAV es un péptido de adhesión celular derivado de la proteína de la membrana basal de laminina αcadena 1 que se utilizó originalmente para modelar el microambiente neural y causar la diferenciación neuronal14. Por lo tanto, encontrar un vehículo de entrega eficiente para esta nueva vacuna es importante para el control de la enfermedad.
Los sistemas de emulsión recientemente reportados, como W805EC y MF59, también se han compuesto para la administración en la cavidad nasal de la vacuna inactivada contra la influenza o el antígeno de superficie de la hepatitis B recombinante y se ha demostrado que desencadenan la inmunidad mucosa y sistémica15. Las nanoemulsiones (NE) tienen las ventajas de una fácil administración y una coformación conveniente con adyuvantes efectivos en comparación con los sistemas de administración de partículasmucosas 16. Se ha informado que las vacunas de nanoemulsión alteran el fenotipo alérgico de una manera sostenida diferente de la desensibilización tradicional, lo que resulta en efectos supresores a largo plazo17. Otros informaron que las nanoemulsiones combinadas con antígenos inmunodominantes específicos de Mtb podrían inducir potentes respuestas de las células de la mucosa y conferir una protección significativa18. Por lo tanto, se diseñó una nueva nanovacuna intranasal autoensamblada con el péptido sintético IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, el péptido que consiste en IKVAV unido a OVA257-264). Es importante evaluar sistemáticamente esta nueva nanovacuna.
El objetivo de este protocolo es evaluar sistemáticamente las características fisicoquímicas, la toxicidad y la estabilidad de la nanovacuna, detectar si la captación de antígenos y los efectos protectores y terapéuticos se potencian utilizando medios técnicos, y elaborar los principales contenidos experimentales. En este estudio, establecimos una serie de protocolos para estudiar las características fisicoquímicas y la estabilidad, determinar la magnitud de la toxicidad de la I-OVA NE a las células BEAS-2B por CCK-8, y observar la capacidad de presentación de antígeno de las células BEAS-2B a la vacuna mediante microscopía confocal, evaluar los perfiles de liberación de esta nueva nanovacuna in vivo e in vitro., y detectar el efecto protector y terapéutico de esta vacuna mediante el uso de un modelo de ratón portador de tumores E.G7-OVA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning Incorporated, USA</td>
			<td>CLS3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad 6.0 microplate reader</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA</td>
			<td>&#160;Bio-Rad 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK-8 kits</td>
			<td>Dojindo, Japan</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf, Germany&#160;</td>
			<td>5811000398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone (Life Technology, USA)</td>
			<td>SH30088.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-labeled I-OVA</td>
			<td>Shanghai Botai 
			Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HF 90/240 Incubator</td>
			<td>Heal Force, Switzerland</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC&#160;</td>
			<td>Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd.</td>
			<td>E2695</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon,Japan</td>
			<td>DSZ5000X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPC-208</td>
			<td>Chong Qing University, China</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS system&#160;</td>
			<td>Caliper Life Science Limited Company</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1230 TEM</td>
			<td>JEOL Limited Company of Japan</td>
			<td>1230 TEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern NANO ZS</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd., UK</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPLA</td>
			<td>&#160;Invivogen 
			Lit. Co.</td>
			<td>tlrl-mpla</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin Sulfate Ointment</td>
			<td>Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd.</td>
			<td>H31022262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVA257&#8211;264</td>
			<td>Shanghai Botai 
			Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Hyclone (Life Technology, USA)</td>
			<td>SH30809.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA</td>
			<td>Shanghai Botai 
			Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td>Zeiss LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation, characteristics, toxicity, and efficacy evaluation of the nasal self-assembled nanoemulsion tumor vaccine in vitro and in vivo

Los péptidos epítopos han atraído una atención generalizada en el campo de las vacunas tumorales debido a su seguridad, alta especificidad y producción conveniente; en particular, algunos epítopos restringidos por MHC I pueden inducir una actividad efectiva de linfocitos T citotóxicos para eliminar las células tumorales. Además, la administración nasal es una técnica de administración efectiva y segura para las vacunas tumorales debido a su conveniencia y mejora el cumplimiento del paciente. Sin embargo, los péptidos de epítopos no son adecuados para la administración nasal debido a su pobre inmunogenicidad y falta de eficiencia de administración. Las nanoemulsiones (NE) son sistemas termodinámicamente estables que pueden cargarse con antígenos y administrarse directamente a la superficie de la mucosa nasal. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) es el pentapéptido central de la laminina, un péptido de unión a integrina expresado por las células epiteliales respiratorias humanas. En este estudio, se preparó una vacuna intranasal autoensamblada para el tumor NE del péptido epítopo que contiene el péptido sintético IKVAV-OVA257-264 (I-OVA ) mediante un método de emulsificación de baja energía. La combinación de IKVAV y OVA257-264 puede mejorar la captación de antígenos por las células epiteliales de la mucosa nasal. Aquí, establecemos un protocolo para estudiar las características fisicoquímicas mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM), microscopía de fuerza atómica (AFM) y dispersión dinámica de luz (DLS); estabilidad en presencia de proteína mucina; toxicidad mediante el examen de la viabilidad celular de las células BEAS-2B y los tejidos nasales y pulmonares de ratones C57BL/6; captación celular por microscopía de barrido láser confocal (CLSM); perfiles de liberación mediante imágenes de animales pequeños in vivo; y el efecto protector y terapéutico de la vacuna mediante el uso de un modelo portador de tumores E.G7. Anticipamos que el protocolo proporcionará pistas técnicas y teóricas para el desarrollo futuro de nuevas vacunas mucosas de péptidos de epítopos de células T.

De acuerdo con el protocolo, completamos la preparación y la evaluación experimental in vitro e in vivo de la administración de la nanovacuna tumoral nasal. TEM, AFM y DLS son medios eficaces para la evaluación de las características básicas del potencial zeta superficial y el tamaño de partícula de la nanovacuna (Figura 1). Las células epiteliales BEAS-2B son un modelo de cribado útil para las pruebas de toxicidad in vitro de vacunas nasales (<strong cla...

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Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo

Aquí, presentamos métodos detallados para la preparación y evaluación de la vacuna nasal autoensamblada para tumores de nanoemulsión in vitro e in vivo.

Preparación, características, toxicidad y evaluación de la eficacia de la vacuna nasal autoensamblada para tumores de nanoemulsión in vitro e in vivo

Epitope peptides have attracted widespread attention in the field of tumor vaccines because of their safety, high specificity, and convenient production; ...

La nueva vacuna de nanoemulsión tiene grandes ventajas en la terapia táctica de la enfermedad. Estos efectos establecidos se minimizan mediante propiedades tales como el chopismo tumoral único, la identificación de tácticas específicas y la baja toxicidad sistémica. Anticipamos que el protocolo proporcionará pistas técnicas y teóricas para el desarrollo futuro de nuevas vacunas mucosas de péptidos de tipo ectipo de células T.Comience mezclando un miligramo de monofosrol lípido A con 100 microlitros de DMSO. Vortex durante cinco minutos y dejar que se disuelva durante cuatro horas a temperatura ambiente. Agregue cuantitativamente TWEEN 80 e I-OVA.Mezclar los componentes y añadir el escualeno. A continuación, agregue 100 microlitros de solución MPLA a la mezcla preparada. Para preparar la vacuna de nanoemulsión, agregue la solución mezclada a las gotas de agua a aproximadamente el 70% del volumen total y revuelva suavemente para obtener una mezcla transparente y que fluya fácilmente.Para los ensayos in vitro, comience con la reactivación de las células epiteliales BEAS2B. Encienda el baño de agua y ajuste la temperatura a 37 grados centígrados. Descongele los viales de células congeladas rápidamente en un baño de agua, templado a 37 grados centígrados.Después de la descongelación, pipetear rápidamente las células en un tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros y agregar dos mililitros del medio de crecimiento completo. Centrifugar el tubo a 129 G durante cinco minutos. Retire el supinato y resuspenda las células en dos mililitros del medio de crecimiento completo.Después de centrifugar las células una vez más, retire el supinante y agregue seis mililitros de medio de crecimiento completo para resuspender las células. Luego transfiera las células a un matraz de cultivo T25 e incube a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al 5%. Una vez que la densidad celular alcance el 80% al 90%, deseche el medio de cultivo y lave las células dos veces con dos mililitros de PBS.Añadir un mililitro de 0,25%tripsin para digerir las células durante uno o dos minutos. Cuando se observe el redondeo de las células, agregue inmediatamente cuatro mililitros del medio de crecimiento completo para neutralizar la tripsina. Mezclar y aspirar las muestras en un tubo centrífugo estéril de 15 mililitros.Centrifugar las muestras a 129 G durante cinco minutos. Retirar el supinato y resuspender las células en un mililitro de RPMI 1640 medio completo. Use 20 microlitros de la suspensión celular para el conteo de células y diluya las células a una vez de 10 a la quinta celda por mililitro.Luego platear las células BEAS2B a una densidad de una vez 10 a la cuarta células por pocillo en placas de 96 pocillos en 100 microlitros de medio completo RPMI 1640, y pre incubar las placas durante 24 horas como se demostró anteriormente. Al final de la incubación, deseche el supinato y agregue 100 microlitros de RPMI 1640 a cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Agregue 100 microlitros de nanoemulsión I-OVA, I-OVA mezclado con BNE e I-OVA prediluido con un medio de crecimiento completo a varias concentraciones finales con BNE como control e incube durante 24 horas a 37 grados centígrados.Una vez que se complete la incubación, retire el medio y transfiera la placa a un lugar oscuro. Agregue 90 microlitros de medio de crecimiento completo y 10 microlitros de solución CCK8 a cada pocillo de la placa. Incubar la placa durante dos horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.Mida la absorbancia de cada pocillo a 450 nanómetros utilizando un lector de placas marcado con enzimas. Use puntas de pipeta de 10 microlitros para realizar la inmunización nasal de los ratones con I-OVA, I-OVA más BNE e I-OVA NE durante tres días. Utilice BNE y PBA como control experimental.Después, cortar muestras de aproximadamente tres milímetros de espesor de tejidos nasales con tijeras y colocarlas en paraformaldehído al 4%. Retire los tejidos pulmonares y fije los tejidos nasales y pulmonares enteros en paraformaldehído al 4% durante 24 horas. TEM y AFM se utilizan para la evaluación de las características básicas del potencial zeta superficial y el tamaño de partícula de la nanovacuna.Se muestran los tamaños de partícula, los índices de polidispersidad, los potenciales zeta y la movilidad de electroforesis de I-OVA NE en los análisis de estabilidad de la musina. La viabilidad relativa de las células BEAS2B es superior al 80% en cultivos expuestos a diferentes concentraciones peptídicas de I-OVA, BNE+I-OVA e I-OVA NE durante 24 horas. El grupo I-OVA EN no tuvo toxicidad mucosa obvia, daño tisular, sangrado o infiltración celular inflamatoria.Las células epiteliales BEAS2B capturaron más I-OVA NE etiquetadas con FITC que las de su solución de agua. El efecto de liberación sostenida de I-OVA NE in vitro se analizó utilizando el sistema IV-IS. La vacuna I-OVA NE tuvo un efecto de liberación sostenida en comparación con la solución acuosa de I-OVA.En el grupo I-OVA NE, el porcentaje de tiempo de supervivencia es mayor en comparación con otros grupos, y el volumen tumoral fue significativamente menor, lo que sugiere que tiene un mejor efecto de protección preventiva que los otros grupos. En el modelo terapéutico, el tiempo medio de supervivencia fue significativamente diferente entre los diferentes grupos. El volumen tumoral del grupo I-OVA NE fue significativamente menor que el del grupo I-OVA.Remover la mezcla uniformemente es importante en este procedimiento. De lo contrario, reducirá la eficiencia de las nanovacunas.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Aislamiento de linfocitos T humanos, cultura y análisis de la migración In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Investigación

Inmunología e Infección

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

El análisis cuantitativo de todos Influenza Tipo A Hemaglutininas viral y neuraminidasas el uso de anticuerpos Universal en simples ensayos Slot Blot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Uso de un medio artificial de esputo para probar la eficacia de antibióticos contra la<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; En condiciones más pertinentes a la fibrosis quística pulmonar

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Generación de Arenavirus recombinante para el Desarrollo de Vacunas de la FDA aprobados células Vero

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

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Una enzima de restricción método basado clonación para evaluar la<em&gt; In vitro</em&gt; Capacidad de replicación del VIH-1 subtipo C Gag-MJ4 quiméricos virus

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Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Cuantificación de la Quimiotaxis de monocitos humanos In Vitro y linfocitos murinos, tráfico en Vivo

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Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

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