Name: efficient genome editing of mice by crispr electroporation of zygotes
Uploaded: 2022-12-16T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes at JoVE.com

A.J.M. skabte det oprindelige koncept, der førte til udviklingen af CRISPR-EZ og producerede figurerne. C.K.D. samlede og tilpassede de interne og offentliggjorte protokoller til dette aktuelle manuskript. A.J.M. understøttes af NIH (R00HD096108).

Al dyrepleje og brug i hele denne protokol overholdt dyrevelfærdslovens politikker, ILAR Guide for Care and Use of Laboratory Animals og fulgte retningslinjer fra AVMA for eutanasi og University of Pennsylvania Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) retningslinjer og politikker. Protokollen for pasning og brug af dyr blev gennemgået og godkendt af University of Pennsylvania IACUC til dette projekt. Som et spørgsmål om overholdelse og forsigtighed skal du søge alle nødvendige tilladelser, før du forsø...

<ol>
	<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+determinants+of+improved+CRISPR+sgRNA+design.">Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design.</a> Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).</li><li>Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR/Cas9+delivery.">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> eLife. 3, 04766 (2014).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CRISPR/HDR-mediated+knock-in+for+mouse+embryonic+stem+cells+and+zygotes.">Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes.</a> Biotechniques. 59 (4), 201-208 (2015).</li><li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li><li>Fujii, W., Onuma, A., Sugiura, K., Naito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+phenotype-expressing+triple-knockout+mice+with+heritable+mutated+alleles+by+the+CRISPR/Cas9+system.">One-step generation of phenotype-expressing triple-knockout mice with heritable mutated alleles by the CRISPR/Cas9 system.</a> Journal of Reproduction and Development. 60 (4), 324-327 (2014).</li><li>Kaneko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+genome+editing+of+rodent+intact+embryos+by+electroporation.">Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation.</a> PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).</li><li>Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaicism+in+CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing.">Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing.</a> Developmental Biology. 445 (2), 156-162 (2019).</li><li>Modzelewski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+mouse+genome+engineering+by+CRISPR-EZ+technology.">Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology.</a> Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).</li><li>Gurumurthy, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+CRISPR-based+germline-genome-engineered+mice+without+ex+vivo+handling+of+zygotes+by+i-GONAD.">Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD.</a> Nature Protocols. 14 (8), 2452-2482 (2019).</li><li>Hur, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+in+mice+by+electroporation+of+Cpf1+ribonucleoproteins.">Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins.</a> Nature Biotechnology. 34 (8), 807-808 (2016).</li><li>Tr&#246;der, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+electroporation+approach+for+efficient+CRISPR/Cas9+genome+editing+in+murine+zygotes.">An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes.</a> PLoS One. 13 (5), 0196891 (2018).</li><li>Qin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR/cas9-mediated+genome+editing+in+mice+by+zygote+electroporation+of+nuclease.">Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease.</a> Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).</li><li>Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+Cas9+protein/sgRNA+into+early+pronuclear+zygotes+generates+non-mosaic+mutants+in+the+mouse.">Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse.</a> Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).</li><li>Teixeira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+mice+zygotes+with+dual+guide+RNA/Cas9+complexes+for+simple+and+efficient+cloning-free+genome+editing.">Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing.</a> Scientific Reports. 8, 474 (2018).</li><li>Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. -. F., Modzelewski, A. J., He, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+mouse+genome+editing+by+CRISPR+ribonucleoprotein+electroporation+of+zygotes.">Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+Cas9+protein+into+mouse+zygotes+through+a+series+of+electroporation+dramatically+increased+the+efficiency+of+model+creation.">Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increased the efficiency of model creation.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).</li><li>Mizuno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-embryo+gene+cassette+knockin+by+CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing+with+adeno-associated+viral+vector.">Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector.</a> iScience. 9, 286-297 (2018).</li><li>Remy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+gene-edited+rats+by+delivery+of+CRISPR/Cas9+protein+and+donor+DNA+into+intact+zygotes+using+electroporation.">Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation.</a> Scientific Reports. 7, 16554 (2017).</li><li>Tanihara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+PDX-1+mutant+porcine+blastocysts+by+introducing+CRISPR/Cas9-system+into+porcine+zygotes+via+electroporation.">Generation of PDX-1 mutant porcine blastocysts by introducing CRISPR/Cas9-system into porcine zygotes via electroporation.</a> Animal Science Journal. 90 (1), 55-61 (2019).</li><li>Zhou, X., Guo, H., Chen, K., Cheng, H., Zhou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+chromosomal+mapping+and+conserved+synteny+of+porcine+Argonaute+family+of+genes.">Identification, chromosomal mapping and conserved synteny of porcine Argonaute family of genes.</a> Genetica. 138 (7), 805-812 (2010).</li><li>Nishio, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+voltage+strength+during+electroporation+on+the+development+and+quality+of+in+vitro-produced+porcine+embryos.">Effects of voltage strength during electroporation on the development and quality of in vitro-produced porcine embryos.</a> Reproduction in Domestic Animals. 53 (2), 313-318 (2018).</li><li>Camargo, L. S. A., Owen, J. R., van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+one-step+knockout+by+electroporation+of+ribonucleoproteins+into+zona-intact+bovine+embryos.">Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos.</a> Frontiers in Genetics. 11, 570069 (2020).</li><li>Escoffre, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+(still+not)+known+of+the+mechanism+by+which+electroporation+mediates+gene+transfer+and+expression+in+cells+and+tissues.">What is (still not) known of the mechanism by which electroporation mediates gene transfer and expression in cells and tissues.</a> Molecular Biotechnology. 41 (3), 286-295 (2009).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-READI:+Efficient+generation+of+knockin+mice+by+CRISPR+RNP+electroporation+and+AAV+donor+infection.">CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection.</a> Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).</li><li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+validation+strategies+for+CRISPR-Cas9+editing.">A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing.</a> Scientific Reports. 8, 888 (2018).</li><li>Modzelewski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse-specific+retrotransposon+drives+a+conserved+Cdk2ap1+isoform+essential+for+development.">A mouse-specific retrotransposon drives a conserved Cdk2ap1 isoform essential for development.</a> Cell. 184 (22), 5541-5558 (2021).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+determinants+of+improved+CRISPR+sgRNA+design.">Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design.</a> Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).</li><li>Sanson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+libraries+for+CRISPR-Cas9+genetic+screens+with+multiple+modalities.">Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities.</a> Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).</li><li>Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+genome+editing+for+single-base+substitutions+using+optimized+ssODNs+with+Cas9-RNPs.">Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs.</a> Scientific Reports. 9, 14811 (2019).</li><li>Duselis, A. R., Vrana, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrieval+of+mouse+oocytes.">Retrieval of mouse oocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (3), e185 (2007).</li><li>Takahashi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GONAD:+Genome-editing+via+oviductal+nucleic+acids+delivery+system:+A+novel+microinjection+independent+genome+engineering+method+in+mice.">GONAD: Genome-editing via oviductal nucleic acids delivery system: A novel microinjection independent genome engineering method in mice.</a> Scientific Reports. 5, 11406 (2015).</li><li>Tu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+Cas9+degradation+reduces+mosaic+mutations+in+non-human+primate+embryos.">Promoting Cas9 degradation reduces mosaic mutations in non-human primate embryos.</a> Scientific Reports. 7, 42081 (2017).</li><li>Aida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning-free+CRISPR/Cas+system+facilitates+functional+cassette+knock-in+in+mice.">Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice.</a> Genome Biology. 16 (1), 87 (2015).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+exon-intron+architecture+variation+of+genes+in+eukaryotic+genomes.">Patterns of exon-intron architecture variation of genes in eukaryotic genomes.</a> BMC Genomics. 10, 47 (2009).</li><li>Quadros, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easi-CRISPR:+a+robust+method+for+one-step+generation+of+mice+carrying+conditional+and+insertion+alleles+using+long+ssDNA+donors+and+CRISPR+ribonucleoproteins.">Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins.</a> Genome Biology. 18, 92 (2017).</li><li>Gurumurthy, C. B., Saunders, T. L., Ohtsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+and+generating+a+mouse+model:+frequently+asked+questions.">Designing and generating a mouse model: frequently asked questions.</a> Journal of Biomedical Research. 35 (2), 76-90 (2021).</li><li>Nakajima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+in+the+knockin+mice+generated+using+the+CRISPR/+Cas+system.">Exome sequencing in the knockin mice generated using the CRISPR/ Cas system.</a> Scientific Reports. 6, 34703 (2016).</li><li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+mutations+are+rare+in+Cas9-modified+mice.">Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice.</a> Nature Methods. 12 (6), 479 (2015).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li></ol>

Præsenteret her er en ligetil og yderst effektiv musegenomredigeringsteknologi. Elektroporation kan bruges til at generere modificerede embryoner på 1-2 uger (figur 1) og kan producere redigerede mus inden for 6 uger9. Sammenlignet med samtidigt udviklede elektroporationsbaserede protokoller, der leverer RNP'er 7,10,11,12,13,14,15,17,32<...

Genomredigering i levende mus er blevet betydeligt forenklet og er blevet tilgængelig og mere overkommelig siden fremkomsten af CRISPR-redigering 1,2,3. Indledende dyreredigeringsforsøg brugte mikroinjektion til at levere CRISPR Cas9 mRNA/sgRNA i embryoneri nukleart stadium 4,5,6. Mens mikroinjektion er ret effektiv, er mængden af praksis, der kræves for fuldt ud at mestre det, muligvis ikke passende for praktikanter og studerende og kræver også dyrt udstyr, som et beskedent finansieret laboratorium ikke har råd til. Mikroinjektion udføres normalt af ekspertteknikere på transgene faciliteter med tidsplaner og servicepriser, der er hastighedsbegrænsende for mange forskere. En mere tilgængelig tilgang er elektroporation, som har vist sig at være ret effektiv til levering af CRISPR Cas9 mRNA/sgRNA i embryoner i nukleart stadium7. Yderligere forbedringer i CRISPR-genomredigering og leveringsstrategier antydede, at færdigmonterede RNP'er, der allerede er involveret i sgRNA'er, kan være et effektivt middel til at reducere mosaikisme8.
Rationalet bag udviklingen og brugen af denne protokol var at omgå mange af de begrænsninger og forhindringer, der er forbundet med mikroinjektion. Som navnet antyder, ville en nem, intern og omkostningseffektiv metode, der hurtigt kunne afgøre, om uprøvede sgRNA-designs ville være umagen værd at bruge under et mikroinjektionseksperiment, være et meget praktisk kvalitetskontroltrin i første omgang (figur 1). Selvom denne metode ikke kan erstatte mikroinjektion til mere komplekse strategier, som at introducere lange donor-DNA-sekvenser til rekombinationsbaserede resultater, er den ideel til mindre komplekse strategier som små deletioner eller indsættelser og mærkning af gener. Denne metode er velegnet til forskere med grundlæggende embryomanipulationsfærdigheder, der har enkle redigeringsbehov, gerne vil teste deres hypotese inden for tidsrammen for præimplantationsudvikling eller foretrækker at teste sgRNA'er i embryoner, før de planlægger en aftale med en mikroinjektionsspecialist. Her leveres redigeringsreagenser forbigående til embryoner i nukleart stadium som Cas9 / sgRNA RNP'er via elektroporation (en række elektriske impulser) for at maksimere effektiviteten og samtidig reducere mosaikisme8. Ved hjælp af en embryogenotypemetode er redigeringsresultater tilgængelige i ca. 1 uge9, hvilket reducerer behovet for forskellige mikroinjektionsapplikationer til en betydeligt reduceret pris.
Denne metodes effektivitet topper på pronukleært embryostadiet, når embryoet endnu ikke har smeltet moderens og faderens pronuclei eller er gået ind i S-fase (figur 2). Superovulation bruges til at maksimere antallet af zygoter, men producerer både pronukleære zygoter og ubefrugtede æg. Sunde zygoter kan også vælges før elektroporation for at øge den samlede effektivitet. Da andre elektroporationsprotokoller effektivt har redigeret zygoter uden behov for at inkludere et lignende trin 7,10,11,12,13,14,15, er et valgfrit trin i denne protokol den lille erosion af zona pellucida (ZP). ZP er et glycoproteinlag, der hjælper spermatozobinding, akrosomrespons og befrugtning omkring embryoner i nukleart stadium. I vores erfaring fandt vi, at en mild syrebaseret erosion af ZP giver pålidelig Cas9 RNP-elektroporationslevering med kun en marginal indvirkning på levedygtigheden.
Vi har observeret RNP-leveringshastigheder på op til 100% effektivitet via elektroporation i musestammer, der almindeligvis anvendes i forskning som C57BL / 6J og C57BL / 6N 9,16. Uafhængige grupper har også udviklet elektroporationsbaserede procedurer med effektiviteter større end eller matchende mikroinjektion 11,12,13,14,15,17, hvor elektroporationsprotokoller fungerer godt hos rotter18,19, svin 20,21,22 og ko 23 , så vi foreslår, at læserne sammenligner protokollerne for at finde de forhold, der bedst passer til deres eksperimentelle og udstyrsbehov. Det her beskrevne system anvender almindelige materialer og udstyr, der kun kræver grundlæggende embryomanipulationsfærdigheder. Denne teknik er effektiv til en række redigeringsstrategier, hvilket gør denne metode bredt tilgængelig for forskersamfundet.
Design af ideelle små guide-RNA'er (sgRNA'er) er afgørende for effektiv redigering. Vi anbefaler screening af to til tre sgRNA-strategier pr. målsted direkte i museembryoner, især hvis muselinjegenerering ønskes. Når de er designet, anbefales kloningsfrie metoder som in vitro transkription (IVT) til fremstilling af sgRNA'er af høj kvalitet3. RNP'erne og sgRNA'erne blandes med 30-50 behandlede embryoner i nukleart stadium og udsættes for en række elektriske impulser for først midlertidigt at permeabilisere ZP og cellemembranen med efterfølgende impulser for at holde porerne åbne og elektroforese RNP'erne gennem zygoten24. Efter optimering fandt vi, at seks 3 ms impulser ved 30 V for bulkembryoner (~ 50) var optimale til redigering af effektivitet og levedygtighed, hvilket gav meget effektiv Cas9 / sgRNA RNP levering 9,16,25. Redigeringshændelser i individuelle musemorula kan bekræftes ved hjælp af en række valideringsstrategier, der er almindelige for CRISPR-redigering, såsom restriktionsfragmentlængdepolymorfisme (RFLP), T7-endonukleasefordøjelse og Sanger-sekventering af interesseområdet26.
Den nuværende metode er mest velegnet til enkle redigeringsskemaer (figur 3), såsom indsættelse/sletninger (indels), sletninger i exon-størrelse i størrelsesordenen 500-2000 bp og levering af punktmutationer og små indsættelser såsom C- eller N-terminaltags (f.eks. FLAG, HA eller V5)9,16,27. Potentialet for kompleks genomredigering, som store indsættelser af fluorescerende tags eller betingede alleler, forbliver usikkert og er det nuværende fokus for kommende forbedringer.
Denne metode er let at mestre og kan bruges til hurtigt at teste sgRNA'er i dyrkede museembryoner i 1 uge9 (figur 1). Præsenteret i dette arbejde er en seks-trins protokol, som omfatter 1) sgRNA design; 2) sgRNA-syntese; 3) superovulation og parring; 4) embryonkultur, indsamling og behandling 5) RNP-samling og elektroporation; 6) Embryokultur og genotypebestemmelse. Oplysninger om alle anvendte materialer findes (Tabel over materialer). Som en positiv kontrol er reagenser til redigering af Tyrosinase (Tyr) locus 9,16 medtaget i den supplerende tabel 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1-cm-gap electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>cat. no. 1652089</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26-G, 1/2-inch needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>cat. no. 305111</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8211;8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>cat. no. 000664</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm Tissue culture dish</td>
			<td>Greiner Bio-One,</td>
			<td>cat. no. 627-160</td>
			<td>Embryo Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-mm Tissue culture dish</td>
			<td>Greiner Bio-One,</td>
			<td>cat. no. 628-160</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x loading dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>cat. no. R0611</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic Tyrode&#39;s (AT) solution, embryo culture grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich,</td>
			<td>cat. no. T1788</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, embryo culture grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. A3311</td>
			<td>Embryo Processing and Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein</td>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS</td>
			<td>cat. no. 1074181</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, RNase-free</td>
			<td>New England BioLabs,</td>
			<td>cat. no. M0303</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS(calcium and magnesium free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>cat. no. 14190-144</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>cat. no. R3101S</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. EDS-100G</td>
			<td>RNP Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>cat. no. V1016</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (powder) type B, laboratory grade</td>
			<td>Fisher,</td>
			<td>cat. no. G7-500</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol,&#160;molecular-biology grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>cat. no. BP229</td>
			<td>RNP Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>cat. no. M712</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, cell culture grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. H4034</td>
			<td>RNP Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HinfI (10,000 U/mL)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>cat. no. R0155S</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td>
			<td>New England BioLabs,</td>
			<td>cat. no. E2040</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorion gonadotropin, lyophilized&#160;(hCG)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. 230734</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase/M2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. MR-051-F</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids)</td>
			<td>Zenith Biotech</td>
			<td>cat. no. ZEKS-050</td>
			<td>Embryo Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE agarose, analytical grade</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>cat. no. E-3120-500</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Zenith Biotech</td>
			<td>cat. no. ZFM2-050</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. M8266</td>
			<td>RNP and Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. ES-005C</td>
			<td>Embryo Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40,substitute (NP-40)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. 74385</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water, molecular-biology grade</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>cat. no. AM9937</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>custom orders</td>
			<td>sgRNA Design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>cat. no. 31985062</td>
			<td>Embryo Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England BioLabs,</td>
			<td>cat. no. M0530</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. P9333</td>
			<td>RNP and Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG)</td>
			<td>ProspecBio</td>
			<td>cat. no. HOR-272</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, molecular-biology grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>cat. no. BP1700-100</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>cat. no. 20170-333</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free eight-well PCR strip tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>cat. no. 82006-606</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic purification beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>cat. no. 65152105050250</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. C4706</td>
			<td>RNP Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>cat. no. T1085</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 molecular-biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. P7949-500</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient genome editing of mice by crispr electroporation of zygotes

Med enestående effektivitet, nøjagtighed og lethed har CRISPR/Cas9-systemet forbedret genomredigering betydeligt i cellekultur og laboratoriedyreforsøg. Ved generering af dyremodeller tilbyder elektroporation af zygoter højere effektivitet, enkelhed, omkostninger og gennemstrømning som et alternativ til guldstandardmetoden til mikroinjektion. Elektroporation er også blidere, med højere levedygtighed og leverer pålideligt Cas9 / single-guide RNA (sgRNA) ribonukleoproteiner (RNP'er) i zygoterne af almindelige laboratoriemusestammer (f.eks. C57BL / 6J og C57BL / 6N), der nærmer sig 100% leveringseffektivitet. Denne teknik muliggør insertion/deletion (indels) mutationer, punktmutationer, deletion af hele gener eller exoner og små insertioner i området 100-200 bp for at indsætte LoxP eller korte tags som FLAG, HA eller V5. Mens vi konstant forbedres, præsenterer vi her den aktuelle tilstand af CRISPR-EZ i en protokol, der inkluderer sgRNA-produktion gennem in vitro-transkription, embryobehandling, RNP-samling, elektroporation og genotypning af præimplantationsembryoner. En forsker på kandidatniveau med minimal erfaring med at manipulere embryoner kan få genetisk redigerede embryoner på mindre end 1 uge ved hjælp af denne protokol. Her tilbyder vi en enkel, billig, effektiv metode med høj kapacitet, der kan bruges med museembryoner.

Denne metode genererer mere end 100 μg sgRNA (20 μL ved >6.000 ng/L koncentration) til effektiv Cas9/sgRNA RNP-samling. Den rutinemæssige superovulationsmetode, der er beskrevet her, producerer typisk 10-20 levedygtige embryoner pr. Tilsluttet kvinde. På grund af håndteringsfejl og typiske tab forbundet med embryomanipulation forventes det, at 80% af embryonerne befrugtes, levedygtige og i fremragende stand efter elektroporation. For at hjælpe forskere med at udføre et vellykket eksperiment har vi givet et eksempe...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes at JoVE.com

Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes

Her beskriver vi en simpel teknik beregnet til effektiv generering af genetisk modificerede mus kaldet CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Denne metode leverer redigering af reagenser ved elektroporation i embryoner med en effektivitet, der nærmer sig 100%. Denne protokol er effektiv til punktmutationer, små genomiske indsættelser og deletioner i pattedyrembryoner.

Effektiv genomredigering af mus ved CRISPR-elektroporation af zygoter

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal ...

Denne metode kunne kontrollere guide-RNA'er i embryoner, teste tidlige udviklingsspørgsmål eller oprette redigerede mus. Eventuelle fremskridt i CRISPR Cas9 kunne bruges med denne metode. Den største fordel ved denne metode er, at den er let at lære og bruger reagenser, der er tilgængelige for laboratorier, der har adgang til mus.I fremtiden vil denne teknik være nyttig til at korrigere en sygdom eller mutation i afkom af et ledsagende dyr eller landbrugsvigtigt dyr. Denne metode er bedst egnet til generering af musemodeller. I vores laboratorium har vi brugt variationer af denne metode til at undersøge begivenhederne omkring befrugtning og tidlig præimplantationsudvikling, specifikt genregulering i embryostyrke.Den mest udfordrende del er at bruge glasnålen til at flytte embryoner fra plade til plade. Demonstrere denne procedure vil være Chantal Diallo, en forskningsspecialist i mit laboratorium. For at begynde embryoindsamling og -behandling skal du placere den aflivede hunmus på ryggen og sprøjte 70% ethanol på maven, der skal åbnes kirurgisk.For at åbne bukhulen og fjerne ovidukterne skal du klippe hudlaget med kirurgisk saks og lokalisere æggestokkene. Fjern derefter begge ovidukter, der ligger proksimalt til æggestokkene, kirurgisk, og læg dem i individuelle 50 mikroliter dråber M2 plus BSA-medium. Under et stereomikroskop skal du bruge dissektionspincet til at hakke oviduktens ampulla for at frigive cumulus-oocytkomplekserne eller COC'erne, der indeholder oocytter, og derefter for at undgå overførsel af affald, overføre og kombinere hver cumulus-oocyt til en enkelt 50-mikroliter dråbe M2 plus BSA med en håndteret pipette indstillet til 20 til 30 mikroliter.For derefter at fjerne cumulusceller fra zygoterne overføres COC'er med lidt ekstra medier til en dråbe på 100 mikroliter M2 plus hyaluronidase og blandes forsigtigt ved pipettering, indtil embryonerne er synligt adskilt fra de meget mindre cumulusceller. For at fortynde hyaluronidase og fjerne løse cumulusceller skal du bruge en mundbetjent pipette til at flytte zygoterne til en frisk 50 mikroliter M2 plus BSA-dråbe. For at ødelægge embryoets zona pellucida og reducere yderligere fysiske hindringer for reagenslevering overføres embryonerne til en forvarmet 100 mikroliter dråbe syre tyrde eller AT-opløsning på en 60 millimeter plade.Kontinuerligt observere zygoterne under et stereomikroskop, indtil 30%af zona pellucida er eroderet, og derefter for at fortynde AT, før embryonerne gennem fire 50-mikroliter dråber M2 plus BSA. Derefter bestemmes et passende antal embryoner, der er blevet behandlet ved at tælle dem under stereomikroskopet. Fortynd BSA ved at føre embryonerne gennem to dråber på 50 mikroliter reduceret serummedie.Derefter mundpipetter 25 til 30 embryoner i en 10-mikroliter dråbe reduceret serummedie, og brug derefter en håndholdt pipette til at tilsætte 10 mikroliter ribonukleoproteinet eller RNP-komplekset. Den viskøse glycerol fortyndes fra RNP-komplekset og homogeniseres prøven ved pipettering 10 gange, eller indtil blandingen ikke længere viser viskositet. Derefter pipetteres 20 mikroliter embryo og RNP-blanding i en 0,1 centimeter elektroporationskuvette, mens du undgår bobler, og derefter for at levere redigeringsreagenserne i zygoten, elektroporere embryonerne ved hjælp af en firkantbølgeprotokol på 30 volt, 4 til 6 impulser med 3 millisekunders pulslængde og 100 pulsintervaller.Derefter tilsættes 50 mikroliter M2 plus BSA i toppen af kuvetten for at skylle embryonerne ud af kuvetten og pipetterer forsigtigt denne blanding ud på en plade. Til embryodyrkning overføres 20 til 30 zygoter til en dråbe KSOM plus BSA i en præekvilibreret kulturplade og flyttes embryonerne til dråben. Inkuber pladen natten over ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid med 95% fugtighed.Den følgende dag overføres kun tocellede embryoner til en frisk dråbe KSOM plus BSA-blanding og returnerer pladen til inkubatoren. Forlad eller kassér de døde eller ubefrugtede embryoner. Før genotypning vaskes morula blastocystembryonerne med to dråber DPBS for at fortynde de mediekomponenter, der kan forstyrre en PCR-reaktion.Brug en mundpipette til at overføre individuelle embryoner til en brønd i en 8-brønds PCR-strimmel og tilsæt 10 mikroliter lysisbuffer. For at lyse embryonerne skal du derefter programmere en termisk cyklist til 55 grader Celsius i 4 timer og derefter inaktivere proteinasen K med en 10-minutters inkubation ved 95 grader Celsius. I denne undersøgelse vises et eksempel på en strategi til at målrette musetyrosinase locus som en positiv kontrol, herunder oligo design og genotypestrategier for ikke-homolog endesammenføjning og homologi rettet reparation.Ved levering af en enkelt guide, eller sgRNA, var leveringen af RNP'er op til og med 100% i C57 sorte 6J og C57 sorte 6N musestammer med indsættelsesdeletionsdannelse, der forekommer ved 50 til 100% og små oligobaserede udskiftninger fra 17 til 63%Ved konstruktion af genomiske sletninger varierer redigeringseffektiviteten fra 3% til 100%Embryoet skal opbevares under så tæt på ideelle forhold som muligt, så jo hurtigere Protokollen er færdig, jo bedre. Minimer også eksponeringen for hyaluronidase og syre Tyrodes. Denne metode beskriver generering af et redigeret dyr, test af implantation eller svangerskabslevedygtighed eller udførelse af eksperimentet flere gange for at indsamle målinger eller billeder og forskellige målinger under udvikling før plantning.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Effektiv Gene Transfer i Chick nethinder for primær cellekultur Studies: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Elektroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Kultur af Embryonale Mouse Cochlear Eksplantater og Gene Transfer fra Elektroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genom-dækkende Snapshot af Chromatin Regulators og stater i<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryoner af Chip-Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer til kylling Auditory Organ med<em&gt; I Ovo</em&gt; Micro-elektroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Mikroinjektion for Transgenese og Genome Redigering i Trepigget Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-medieret tab af funktion analyse i cerebellare granula celler ved hjælp af In Utero elektroporation-baseret overførsel af gener

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

En effektiv strategi til at generere væv-specifikke binære transskription systemer i Drosophila af genom-redigering

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Hurtig og effektiv ekspression af flere proteiner i aviær embryoner ved hjælp af mRNA-elektroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Egg Microinjection og effektiv parring for Genom Redigering i Firebrat Thermobia domestica

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...