Name: efficient genome editing of mice by crispr electroporation of zygotes
Uploaded: 2022-12-16T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes at JoVE.com

A.J.M. creëerde het oorspronkelijke concept dat leidde tot de ontwikkeling van CRISPR-EZ en produceerde de figuren. C.K.D. stelde de interne en gepubliceerde protocollen voor dit huidige manuscript samen en bewerkte deze. A.J.M. wordt ondersteund door NIH (R00HD096108).

Alle dierverzorging en -gebruik in dit protocol hielden zich aan het beleid van de Animal Welfare Act, de ILAR Guide for Care and Use of Laboratory Animals en volgden de richtlijnen en het beleid van de AVMA voor euthanasie en de University of Pennsylvania Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Het protocol voor dierverzorging en -gebruik werd beoordeeld en goedgekeurd door de IACUC van de Universiteit van Pennsylvania voor dit project. Als een kwestie van naleving en voorzichtigheid, vraag dan alle benodig...

<ol>
	<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+determinants+of+improved+CRISPR+sgRNA+design.">Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design.</a> Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).</li><li>Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR/Cas9+delivery.">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> eLife. 3, 04766 (2014).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CRISPR/HDR-mediated+knock-in+for+mouse+embryonic+stem+cells+and+zygotes.">Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes.</a> Biotechniques. 59 (4), 201-208 (2015).</li><li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li><li>Fujii, W., Onuma, A., Sugiura, K., Naito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+phenotype-expressing+triple-knockout+mice+with+heritable+mutated+alleles+by+the+CRISPR/Cas9+system.">One-step generation of phenotype-expressing triple-knockout mice with heritable mutated alleles by the CRISPR/Cas9 system.</a> Journal of Reproduction and Development. 60 (4), 324-327 (2014).</li><li>Kaneko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+genome+editing+of+rodent+intact+embryos+by+electroporation.">Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation.</a> PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).</li><li>Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaicism+in+CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing.">Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing.</a> Developmental Biology. 445 (2), 156-162 (2019).</li><li>Modzelewski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+mouse+genome+engineering+by+CRISPR-EZ+technology.">Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology.</a> Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).</li><li>Gurumurthy, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+CRISPR-based+germline-genome-engineered+mice+without+ex+vivo+handling+of+zygotes+by+i-GONAD.">Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD.</a> Nature Protocols. 14 (8), 2452-2482 (2019).</li><li>Hur, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+in+mice+by+electroporation+of+Cpf1+ribonucleoproteins.">Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins.</a> Nature Biotechnology. 34 (8), 807-808 (2016).</li><li>Tr&#246;der, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+electroporation+approach+for+efficient+CRISPR/Cas9+genome+editing+in+murine+zygotes.">An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes.</a> PLoS One. 13 (5), 0196891 (2018).</li><li>Qin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR/cas9-mediated+genome+editing+in+mice+by+zygote+electroporation+of+nuclease.">Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease.</a> Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).</li><li>Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+Cas9+protein/sgRNA+into+early+pronuclear+zygotes+generates+non-mosaic+mutants+in+the+mouse.">Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse.</a> Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).</li><li>Teixeira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+mice+zygotes+with+dual+guide+RNA/Cas9+complexes+for+simple+and+efficient+cloning-free+genome+editing.">Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing.</a> Scientific Reports. 8, 474 (2018).</li><li>Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. -. F., Modzelewski, A. J., He, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+mouse+genome+editing+by+CRISPR+ribonucleoprotein+electroporation+of+zygotes.">Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+Cas9+protein+into+mouse+zygotes+through+a+series+of+electroporation+dramatically+increased+the+efficiency+of+model+creation.">Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increased the efficiency of model creation.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).</li><li>Mizuno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-embryo+gene+cassette+knockin+by+CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing+with+adeno-associated+viral+vector.">Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector.</a> iScience. 9, 286-297 (2018).</li><li>Remy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+gene-edited+rats+by+delivery+of+CRISPR/Cas9+protein+and+donor+DNA+into+intact+zygotes+using+electroporation.">Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation.</a> Scientific Reports. 7, 16554 (2017).</li><li>Tanihara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+PDX-1+mutant+porcine+blastocysts+by+introducing+CRISPR/Cas9-system+into+porcine+zygotes+via+electroporation.">Generation of PDX-1 mutant porcine blastocysts by introducing CRISPR/Cas9-system into porcine zygotes via electroporation.</a> Animal Science Journal. 90 (1), 55-61 (2019).</li><li>Zhou, X., Guo, H., Chen, K., Cheng, H., Zhou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+chromosomal+mapping+and+conserved+synteny+of+porcine+Argonaute+family+of+genes.">Identification, chromosomal mapping and conserved synteny of porcine Argonaute family of genes.</a> Genetica. 138 (7), 805-812 (2010).</li><li>Nishio, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+voltage+strength+during+electroporation+on+the+development+and+quality+of+in+vitro-produced+porcine+embryos.">Effects of voltage strength during electroporation on the development and quality of in vitro-produced porcine embryos.</a> Reproduction in Domestic Animals. 53 (2), 313-318 (2018).</li><li>Camargo, L. S. A., Owen, J. R., van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+one-step+knockout+by+electroporation+of+ribonucleoproteins+into+zona-intact+bovine+embryos.">Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos.</a> Frontiers in Genetics. 11, 570069 (2020).</li><li>Escoffre, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+(still+not)+known+of+the+mechanism+by+which+electroporation+mediates+gene+transfer+and+expression+in+cells+and+tissues.">What is (still not) known of the mechanism by which electroporation mediates gene transfer and expression in cells and tissues.</a> Molecular Biotechnology. 41 (3), 286-295 (2009).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-READI:+Efficient+generation+of+knockin+mice+by+CRISPR+RNP+electroporation+and+AAV+donor+infection.">CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection.</a> Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).</li><li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+validation+strategies+for+CRISPR-Cas9+editing.">A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing.</a> Scientific Reports. 8, 888 (2018).</li><li>Modzelewski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse-specific+retrotransposon+drives+a+conserved+Cdk2ap1+isoform+essential+for+development.">A mouse-specific retrotransposon drives a conserved Cdk2ap1 isoform essential for development.</a> Cell. 184 (22), 5541-5558 (2021).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+determinants+of+improved+CRISPR+sgRNA+design.">Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design.</a> Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).</li><li>Sanson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+libraries+for+CRISPR-Cas9+genetic+screens+with+multiple+modalities.">Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities.</a> Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).</li><li>Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+genome+editing+for+single-base+substitutions+using+optimized+ssODNs+with+Cas9-RNPs.">Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs.</a> Scientific Reports. 9, 14811 (2019).</li><li>Duselis, A. R., Vrana, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrieval+of+mouse+oocytes.">Retrieval of mouse oocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (3), e185 (2007).</li><li>Takahashi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GONAD:+Genome-editing+via+oviductal+nucleic+acids+delivery+system:+A+novel+microinjection+independent+genome+engineering+method+in+mice.">GONAD: Genome-editing via oviductal nucleic acids delivery system: A novel microinjection independent genome engineering method in mice.</a> Scientific Reports. 5, 11406 (2015).</li><li>Tu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+Cas9+degradation+reduces+mosaic+mutations+in+non-human+primate+embryos.">Promoting Cas9 degradation reduces mosaic mutations in non-human primate embryos.</a> Scientific Reports. 7, 42081 (2017).</li><li>Aida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning-free+CRISPR/Cas+system+facilitates+functional+cassette+knock-in+in+mice.">Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice.</a> Genome Biology. 16 (1), 87 (2015).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+exon-intron+architecture+variation+of+genes+in+eukaryotic+genomes.">Patterns of exon-intron architecture variation of genes in eukaryotic genomes.</a> BMC Genomics. 10, 47 (2009).</li><li>Quadros, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easi-CRISPR:+a+robust+method+for+one-step+generation+of+mice+carrying+conditional+and+insertion+alleles+using+long+ssDNA+donors+and+CRISPR+ribonucleoproteins.">Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins.</a> Genome Biology. 18, 92 (2017).</li><li>Gurumurthy, C. B., Saunders, T. L., Ohtsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+and+generating+a+mouse+model:+frequently+asked+questions.">Designing and generating a mouse model: frequently asked questions.</a> Journal of Biomedical Research. 35 (2), 76-90 (2021).</li><li>Nakajima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+in+the+knockin+mice+generated+using+the+CRISPR/+Cas+system.">Exome sequencing in the knockin mice generated using the CRISPR/ Cas system.</a> Scientific Reports. 6, 34703 (2016).</li><li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+mutations+are+rare+in+Cas9-modified+mice.">Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice.</a> Nature Methods. 12 (6), 479 (2015).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li></ol>

Hier wordt een eenvoudige en zeer efficiënte technologie voor het bewerken van het muizengenoom gepresenteerd. Elektroporatie kan worden gebruikt om gemodificeerde embryo's te genereren in 1-2 weken (figuur 1) en kan binnen 6 weken bewerkte muizen produceren9. Vergeleken met gelijktijdig ontwikkelde op elektroporatie gebaseerde protocollen die RNPs 7,10,11,12,13,14,15,17,32<s...

Genoombewerking bij levende muizen is aanzienlijk vereenvoudigd en is toegankelijker en betaalbaarder geworden sinds de opkomst van CRISPR-bewerking 1,2,3. Initiële bewerkingspogingen bij dieren gebruikten micro-injectie om CRISPR Cas9-mRNA/sgRNA af te leveren in embryo's in het pronucleaire stadium 4,5,6. Hoewel micro-injectie vrij effectief is, is de hoeveelheid oefening die nodig is om het volledig onder de knie te krijgen misschien niet geschikt voor stagiairs en studenten en vereist het ook dure apparatuur die een bescheiden gefinancierd laboratorium zich niet kan veroorloven. Micro-injectie wordt normaal gesproken uitgevoerd door deskundige technici in transgene faciliteiten met schema's en serviceprijzen die voor veel onderzoekers snelheidsbeperkend zijn. Een meer toegankelijke benadering is die van elektroporatie, waarvan is aangetoond dat deze vrij effectief is voor de afgifte van CRISPR Cas9-mRNA / sgRNA in embryo's in het pronucleaire stadium7. Verdere verbeteringen in CRISPR-genoombewerkings- en leveringsstrategieën suggereerden dat voorgeassembleerde RRP's die al betrokken zijn bij sgRNA's een effectief middel kunnen zijn om mozaïcisme te verminderen8.
De reden achter de ontwikkeling en het gebruik van dit protocol was om veel van de beperkingen en obstakels in verband met micro-injectie te omzeilen. Zoals de naam al aangeeft, zou een eenvoudige, interne en kosteneffectieve methode die snel zou kunnen bepalen of niet-geteste sgRNA-ontwerpen de moeite waard zouden zijn om te gebruiken tijdens een micro-injectie-experiment, een zeer handige first pass kwaliteitscontrolestap zijn (figuur 1). Hoewel deze methode micro-injectie niet kan vervangen voor complexere strategieën, zoals het introduceren van lange donor-DNA-sequenties voor op recombinatie gebaseerde uitkomsten, is het ideaal voor minder complexe strategieën zoals kleine deleties of inserties en tagginggenen. Deze methode is geschikt voor onderzoekers met elementaire embryomanipulatievaardigheden die eenvoudige bewerkingsbehoeften hebben, hun hypothese willen testen binnen het tijdsbestek van pre-implantatieontwikkeling, of liever sgRNA's in embryo's testen voordat ze een afspraak plannen met een micro-injectiespecialist. Hier worden bewerkingsreagentia tijdelijk afgeleverd in embryo's in het pronucleaire stadium als Cas9 / sgRNA RNPs via elektroporatie (een reeks elektrische pulsen) om de efficiëntie te maximaliseren en tegelijkertijd het mozaïcisme te verminderen8. Met behulp van een embryogenotyperingsmethode zijn bewerkingsresultaten beschikbaar in ongeveer 1 week9, waardoor de behoefte aan verschillende micro-injectietoepassingen tegen aanzienlijk lagere kosten wordt verminderd.
De effectiviteit van deze methode piekt in het pronucleaire embryostadium, wanneer het embryo de maternale en vaderlijke pronuclei nog niet heeft gefuseerd of in de S-fase is gekomen (figuur 2). Superovulatie wordt gebruikt om het aantal zygoten te maximaliseren, maar produceert zowel pronucleaire zygoten als onbevruchte eieren. Gezonde zygoten kunnen ook vooraf worden geselecteerd vóór elektroporatie om de algehele efficiëntie te verhogen. Aangezien andere elektroporatieprotocollen efficiënt bewerkte zygoten hebben zonder de noodzaak om een vergelijkbare stap 7,10,11,12,13,14,15 op te nemen, is een optionele stap van dit protocol de lichte erosie van de zona pellucida (ZP). De ZP is een glycoproteïnelaag die spermatozoabinding, acrosoomrespons en bevruchting rond embryo's in het pronucleaire stadium helpt. In onze ervaring ontdekten we dat een zachte op zuur gebaseerde erosie van de ZP een betrouwbare Cas9 RNP-elektroporatieafgifte biedt met slechts een marginale impact op de levensvatbaarheid.
We hebben RNP-toedieningspercentages tot 100% efficiëntie waargenomen via elektroporatie in muizenstammen die vaak worden gebruikt in onderzoek zoals C57BL / 6J en C57BL / 6N 9,16. Onafhankelijke groepen hebben ook op elektroporatie gebaseerde procedures ontwikkeld met efficiënties groter dan of overeenkomend met micro-injectie 11,12,13,14,15,17, waarbij elektroporatieprotocollen goed functioneren bij rat 18,19, varken 20,21,22 en koe 23 , dus we raden lezers aan de protocollen te vergelijken om de omstandigheden te vinden die het beste passen bij hun experimentele en apparatuurbehoeften. Het hier beschreven systeem maakt gebruik van gemeenschappelijke materialen en apparatuur, waarvoor alleen elementaire embryomanipulatievaardigheden nodig zijn. Deze techniek is effectief voor een reeks bewerkingsstrategieën, waardoor deze methode breed toegankelijk is voor de onderzoeksgemeenschap.
Het ontwerpen van ideale kleine gids-RNA's (sgRNA's) is essentieel voor efficiënte bewerking. We raden aan om twee tot drie sgRNA-strategieën per doellocatie direct in muizenembryo's te screenen, vooral als het genereren van muizenlijnen gewenst is. Eenmaal ontworpen, worden kloonvrije methoden zoals in vitro transcriptie (IVT) aanbevolen om hoogwaardige sgRNA's te produceren3. De RRP's en sgRNA's worden gemengd met 30-50 verwerkte embryo's in het pronucleaire stadium en blootgesteld aan een reeks elektrische pulsen om eerst tijdelijk het ZP- en celmembraan te doordringen, met daaropvolgende pulsen om de poriën open te houden en de RRP's door de zygote24 te elektroforeren. Na optimalisatie ontdekten we dat zes pulsen van 3 ms bij 30 V voor bulkembryo's (~ 50) optimaal waren voor het bewerken van effectiviteit en levensvatbaarheid, waardoor zeer efficiënte Cas9 / sgRNA RNP-afgifte 9,16,25 werd geboden. Bewerkingsgebeurtenissen in individuele muismorula kunnen worden bevestigd met behulp van een verscheidenheid aan validatiestrategieën die gebruikelijk zijn voor CRISPR-bewerking, zoals restrictief fragmentlengtepolymorfisme (RFLP), T7-endonucleasevertering en Sanger-sequencing van het interessegebied26.
De huidige methode is het meest geschikt voor eenvoudige bewerkingsschema's (figuur 3), zoals insertie/deleties (indels), exon-formaat deleties in de orde van 500-2000 bp, en de levering van puntmutaties en kleine inserties zoals C- of N-Terminal-tags (bijv. FLAG, HA of V5)9,16,27. Het potentieel voor complexe genoombewerking, zoals grote inserties van fluorescerende tags of voorwaardelijke allelen, blijft onzeker en is de huidige focus van aankomende verbeteringen.
Deze methode is gemakkelijk onder de knie te krijgen en kan worden gebruikt om sgRNA's snel te testen in gekweekte muizenembryo's in 1 week9 (figuur 1). Gepresenteerd in dit werk is een zesstappenprotocol, dat 1) sgRNA-ontwerp omvat; 2) sgRNA-synthese; 3) superovulatie en paring; 4) embryocultuur, -verzameling en -verwerking; 5) RNP-assemblage en elektroporatie; 6) embryocultuur en genotypering. Informatie over alle gebruikte materialen wordt verstrekt (Tabel van materialen). Als positieve controle zijn reagentia voor het bewerken van de Tyrosinase (Tyr) locus 9,16 opgenomen in de aanvullende tabel 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1-cm-gap electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>cat. no. 1652089</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26-G, 1/2-inch needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>cat. no. 305111</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8211;8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>cat. no. 000664</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm Tissue culture dish</td>
			<td>Greiner Bio-One,</td>
			<td>cat. no. 627-160</td>
			<td>Embryo Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-mm Tissue culture dish</td>
			<td>Greiner Bio-One,</td>
			<td>cat. no. 628-160</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x loading dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>cat. no. R0611</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic Tyrode&#39;s (AT) solution, embryo culture grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich,</td>
			<td>cat. no. T1788</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, embryo culture grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. A3311</td>
			<td>Embryo Processing and Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein</td>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS</td>
			<td>cat. no. 1074181</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, RNase-free</td>
			<td>New England BioLabs,</td>
			<td>cat. no. M0303</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS(calcium and magnesium free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>cat. no. 14190-144</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>cat. no. R3101S</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. EDS-100G</td>
			<td>RNP Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>cat. no. V1016</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (powder) type B, laboratory grade</td>
			<td>Fisher,</td>
			<td>cat. no. G7-500</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol,&#160;molecular-biology grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>cat. no. BP229</td>
			<td>RNP Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>cat. no. M712</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, cell culture grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. H4034</td>
			<td>RNP Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HinfI (10,000 U/mL)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>cat. no. R0155S</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td>
			<td>New England BioLabs,</td>
			<td>cat. no. E2040</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorion gonadotropin, lyophilized&#160;(hCG)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. 230734</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase/M2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. MR-051-F</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids)</td>
			<td>Zenith Biotech</td>
			<td>cat. no. ZEKS-050</td>
			<td>Embryo Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE agarose, analytical grade</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>cat. no. E-3120-500</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Zenith Biotech</td>
			<td>cat. no. ZFM2-050</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. M8266</td>
			<td>RNP and Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. ES-005C</td>
			<td>Embryo Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40,substitute (NP-40)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. 74385</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water, molecular-biology grade</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>cat. no. AM9937</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>custom orders</td>
			<td>sgRNA Design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>cat. no. 31985062</td>
			<td>Embryo Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England BioLabs,</td>
			<td>cat. no. M0530</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. P9333</td>
			<td>RNP and Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG)</td>
			<td>ProspecBio</td>
			<td>cat. no. HOR-272</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, molecular-biology grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>cat. no. BP1700-100</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>cat. no. 20170-333</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free eight-well PCR strip tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>cat. no. 82006-606</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic purification beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>cat. no. 65152105050250</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. C4706</td>
			<td>RNP Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>cat. no. T1085</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 molecular-biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. P7949-500</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient genome editing of mice by crispr electroporation of zygotes

Met uitzonderlijke efficiëntie, nauwkeurigheid en gemak heeft het CRISPR/Cas9-systeem de genoombewerking in celkweek en proefdierproeven aanzienlijk verbeterd. Bij het genereren van diermodellen biedt de elektroporatie van zygoten een hogere efficiëntie, eenvoud, kosten en doorvoer als alternatief voor de gouden standaardmethode van micro-injectie. Elektroporatie is ook zachter, met een hogere levensvatbaarheid, en levert op betrouwbare wijze Cas9/ single-guide RNA (sgRNA) ribonucleoproteïnen (RRP's) in de zygoten van gewone laboratoriummuisstammen (bijv. C57BL / 6J en C57BL / 6N) die 100% leveringsefficiëntie benaderen. Deze techniek maakt insertie/deletie (indels) mutaties, puntmutaties, de deletie van hele genen of exonen en kleine inserties in het bereik van 100-200 bp mogelijk om LoxP of korte tags zoals FLAG, HA of V5 in te voegen. Hoewel voortdurend wordt verbeterd, presenteren we hier de huidige staat van CRISPR-EZ in een protocol dat sgRNA-productie omvat door in vitro transcriptie, embryoverwerking, RNP-assemblage, elektroporatie en de genotypering van pre-implantatieembryo's. Een onderzoeker op graduate niveau met minimale ervaring in het manipuleren van embryo's kan genetisch bewerkte embryo's verkrijgen in minder dan 1 week met behulp van dit protocol. Hier bieden we een eenvoudige, goedkope, efficiënte methode met hoge capaciteit die kan worden gebruikt met muizenembryo's.

Deze methode genereert meer dan 100 μgg sgRNA (20 μL bij >6.000 ng/L concentratie) voor een efficiënte Cas9/sgRNA RNP assemblage. De hier beschreven routinematige superovulatiemethode produceert meestal 10-20 levensvatbare embryo's per geplugd vrouwtje. Als gevolg van hanteringsfouten en typische verliezen in verband met embryomanipulatie, is naar verwachting 80% van de embryo's bevrucht, levensvatbaar en in uitstekende staat na elektroporatie. Om onderzoekers te helpen bij het uitvoeren van een succesvol experiment, ...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes at JoVE.com

Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes

Hier beschrijven we een eenvoudige techniek die bedoeld is voor de efficiënte generatie van genetisch gemodificeerde muizen, CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Deze methode levert bewerkingsreagentia door elektroporatie in embryo's met een efficiëntie van bijna 100%. Dit protocol is effectief voor puntmutaties, kleine genomische inserties en deleties in zoogdierembryo's.

Efficiënte genoombewerking van muizen door CRISPR-elektroporatie van zygoten

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal ...

Deze methode kan gids-RNA's in embryo's controleren, vroege ontwikkelingsvragen testen of bewerkte muizen maken. Eventuele ontwikkelingen in CRISPR Cas9 kunnen met deze methode worden gebruikt. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het gemakkelijk te leren is en reagentia gebruikt die beschikbaar zijn voor laboratoria die toegang hebben tot muizen.In de toekomst zou deze techniek nuttig zijn voor het corrigeren van een ziekte of mutatie in de nakomelingen van een gezelschapsdier of landbouw-belangrijk dier. Deze methode is het meest geschikt voor het genereren van muismodellen. In ons laboratorium hebben we variaties van deze methode gebruikt om de gebeurtenissen rond bevruchting en vroege pre-implantatieontwikkeling te onderzoeken, met name genregulatie in embryonale potentie.Het meest uitdagende deel is het gebruik van de glazen naald om embryo's van plaat naar plaat te verplaatsen. Deze procedure wordt gedemonstreerd door Chantal Diallo, een onderzoeksspecialist in mijn lab. Om te beginnen met het verzamelen en verwerken van embryo's, plaatst u de geëuthanaseerde vrouwelijke muis op zijn rug en spuit u 70% ethanol op de buik om chirurgisch te worden geopend.Om de buikholte te openen en de eileiders te verwijderen, knipt u de huidlaag met een chirurgische schaar en lokaliseert u de eierstokken. Verwijder vervolgens operatief beide eileiders, die zich proximaal aan de eierstokken bevinden, en plaats ze in individuele 50-microliterdruppels M2 plus BSA-medium. Gebruik onder een stereomicroscoop dissectietangen om het ampulla van de eileider te snijden om de cumulus-eicelcomplexen of COC's, die eicellen bevatten, vrij te maken en vervolgens om overdracht van puin te voorkomen, elke cumulus-eicel over te brengen en te combineren tot een enkele 50-microliter druppel M2 plus BSA met een gehanteerde pipet ingesteld op 20 tot 30 microliter.Vervolgens, om cumuluscellen uit de zygoten te verwijderen, breng COC's met een beetje extra media over naar een druppel van 100-microliter M2 plus hyaluronidase en meng voorzichtig door pipetteer totdat de embryo's zichtbaar zijn gescheiden van de veel kleinere cumuluscellen. Om hyaluronidase te verdunnen en losse cumuluscellen op te ruimen, gebruikt u een mondbediende pipet om de zygoten naar een verse M2 plus BSA-druppel van 50 microliter te verplaatsen. Vervolgens, om de zona pellucida van het embryo te eroderen en extra fysieke obstakels voor de afgifte van reagens te verminderen, breng de embryo's over naar een voorgewarmde druppel van 100 microliter zuur Tyrode, of AT-oplossing, op een plaat van 60 millimeter.Observeer de zygoten continu onder een stereomicroscoop totdat 30% van de zona pellucida is geërodeerd, en om de AT te verdunnen, passeren de embryo's door vier druppeltjes M2 plus BSA van 50 microliter. Bepaal vervolgens een geschikt aantal embryo's dat is verwerkt door ze onder de stereomicroscoop te tellen. Verdun BSA door de embryo's door twee druppels van 50 microliter gereduceerde serummedia te laten lopen.Pipetteer vervolgens 25 tot 30 embryo's in een druppel van 10 microliter gereduceerd serummedium en gebruik vervolgens een handpipet om 10 microliter ribonucleoproteïne of RNP-complex toe te voegen. Verdun de viskeuze glycerol uit het RNP-complex en homogeniseer het monster door 10 keer te pipetteren of totdat het mengsel geen viscositeit meer vertoont. Pipetteer vervolgens 20 microliter embryo- en RNP-mengsel in een elektroporatiecuvet van 0,1 centimeter terwijl bellen worden vermeden, en om de bewerkingsreagentia in de zygote af te leveren, elektroporaat de embryo's met behulp van een blokgolfprotocol van 30 volt, 4 tot 6 pulsen met 3 milliseconden pulslengte en 100 pulsintervallen.Voeg vervolgens 50 microliter M2 plus BSA toe aan de bovenkant van de cuvette om de embryo's uit de cuvette te spoelen en pipetteer dit mengsel voorzichtig op een bord. Breng voor het kweken van embryo's 20 tot 30 zygoten over in een druppel KSOM plus BSA in een vooraf uitgebalanceerde kweekplaat en verplaats de embryo's naar de druppel. Incubeer de plaat 's nachts bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide met 95% vochtigheid.Breng de volgende dag alleen tweecellige embryo's over in een verse druppel KSOM plus BSA-mengsel en breng de plaat terug naar de couveuse. Laat de dode of onbevruchte embryo's achter of gooi ze weg. Was vóór het genotyperen de morula blastocystembryo's met twee druppels DPBS om de mediacomponenten te verdunnen die een PCR-reactie kunnen verstoren.Breng met behulp van een mondpipet individuele embryo's over naar een putje van een 8-well PCR-strip en voeg 10 microliter lysisbuffer toe. Om vervolgens de embryo's te lyseren, programmeert u een thermische cycler tot 55 graden Celsius gedurende 4 uur en inactiveert u vervolgens het proteïnase K met een incubatie van 10 minuten bij 95 graden Celsius. In deze studie wordt een voorbeeldstrategie getoond om de tyrosinaselocus van de muis als een positieve controle te richten, inclusief oligoontwerpen en genotyperingsstrategieën voor niet-homologe eindverbinding en homologiegerichte reparatie.Bij het leveren van een enkele single-guide, of sgRNA, was de levering van RRP's tot en met 100% in de C57 zwarte 6J en C57 zwarte 6N muisstammen met insertie deletiesvorming optredend bij 50 tot 100% en kleine oligo-gebaseerde vervangingen variërend van 17 tot 63%Bij het engineeren van genomische deleties varieert de bewerkingseffectiviteit van 3% tot 100%Het embryo moet in zo dicht mogelijk bij ideale omstandigheden worden gehouden, dus hoe sneller de protocol is gedaan, hoe beter. Minimaliseer ook de blootstelling aan hyaluronidase en zure Tyrode's. Deze methode beschrijft het genereren van een bewerkt dier, het testen van implantatie of zwangerschaps levensvatbaarheid, of het meerdere keren uitvoeren van het experiment om metingen of afbeeldingen en verschillende statistieken te verzamelen tijdens de ontwikkeling vóór de plantage.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficiënte Gene Transfer in Chick netvliezen voor primaire cel Cultuurwetenschappen: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Elektroporatie Aanpak

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Cultuur van embryonale Mouse Cochlear Explantaten en Gene Transfer door elektroporatie

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genoom-brede Snapshot van chromatine regelgevers en staten in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryo&#39;s van Chip-Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

Efficiënte generatie van iPSC Neural Lineage Specifieke Knockin Reporters Met de CRISPR / Cas9 en Cas9 Double Nickase System

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer naar de kip gehoororgaan door<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-elektroporatie

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Micro-injectie voor Transgenese en Genome Bewerken in Threespine Stekelbaarzen

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-gemedieerde verlies van functie analyse in cerebellaire submodule cellen gebruiken In Utero Electroporation gebaseerde gentransfer

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Een efficiënte strategie voor het genereren van weefsel toepassingsspecifieke binaire transcriptie systemen in Drosophila door het bewerken van het genoom

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Snelle en efficiënte expressie van meervoudige eiwitten in aviaire embryo's met behulp van mRNA-Elektroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Ei micro-injectie en efficiënte paring voor genoombewerking in de Firebrat Thermobia domestica

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...