Name: efficient genome editing of mice by crispr electroporation of zygotes
Uploaded: 2022-12-16T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes at JoVE.com

איי.ג'.אם יצר את הקונספט המקורי שהוביל לפיתוח CRISPR-EZ והפיק את הדמויות. סי.קיי.די ליקט והתאים את הפרוטוקולים הפנימיים והמפורסמים לכתב היד הנוכחי. A.J.M. נתמך על ידי NIH (R00HD096108).

כל הטיפול והשימוש בבעלי חיים לאורך פרוטוקול זה דבקו במדיניות חוק רווחת בעלי החיים, במדריך ILAR לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ועקבו אחר הנחיות AVMA להמתת חסד וההנחיות והמדיניות של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת פנסילבניה (IACUC). פרוטוקול הטיפול והשימוש בבעלי חיים נבדק ואושר ?...

<ol>
	<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+determinants+of+improved+CRISPR+sgRNA+design.">Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design.</a> Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).</li><li>Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR/Cas9+delivery.">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> eLife. 3, 04766 (2014).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CRISPR/HDR-mediated+knock-in+for+mouse+embryonic+stem+cells+and+zygotes.">Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes.</a> Biotechniques. 59 (4), 201-208 (2015).</li><li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li><li>Fujii, W., Onuma, A., Sugiura, K., Naito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+phenotype-expressing+triple-knockout+mice+with+heritable+mutated+alleles+by+the+CRISPR/Cas9+system.">One-step generation of phenotype-expressing triple-knockout mice with heritable mutated alleles by the CRISPR/Cas9 system.</a> Journal of Reproduction and Development. 60 (4), 324-327 (2014).</li><li>Kaneko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+genome+editing+of+rodent+intact+embryos+by+electroporation.">Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation.</a> PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).</li><li>Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaicism+in+CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing.">Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing.</a> Developmental Biology. 445 (2), 156-162 (2019).</li><li>Modzelewski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+mouse+genome+engineering+by+CRISPR-EZ+technology.">Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology.</a> Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).</li><li>Gurumurthy, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+CRISPR-based+germline-genome-engineered+mice+without+ex+vivo+handling+of+zygotes+by+i-GONAD.">Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD.</a> Nature Protocols. 14 (8), 2452-2482 (2019).</li><li>Hur, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+in+mice+by+electroporation+of+Cpf1+ribonucleoproteins.">Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins.</a> Nature Biotechnology. 34 (8), 807-808 (2016).</li><li>Tr&#246;der, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+electroporation+approach+for+efficient+CRISPR/Cas9+genome+editing+in+murine+zygotes.">An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes.</a> PLoS One. 13 (5), 0196891 (2018).</li><li>Qin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR/cas9-mediated+genome+editing+in+mice+by+zygote+electroporation+of+nuclease.">Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease.</a> Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).</li><li>Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+Cas9+protein/sgRNA+into+early+pronuclear+zygotes+generates+non-mosaic+mutants+in+the+mouse.">Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse.</a> Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).</li><li>Teixeira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+mice+zygotes+with+dual+guide+RNA/Cas9+complexes+for+simple+and+efficient+cloning-free+genome+editing.">Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing.</a> Scientific Reports. 8, 474 (2018).</li><li>Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. -. F., Modzelewski, A. J., He, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+mouse+genome+editing+by+CRISPR+ribonucleoprotein+electroporation+of+zygotes.">Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+Cas9+protein+into+mouse+zygotes+through+a+series+of+electroporation+dramatically+increased+the+efficiency+of+model+creation.">Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increased the efficiency of model creation.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).</li><li>Mizuno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-embryo+gene+cassette+knockin+by+CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing+with+adeno-associated+viral+vector.">Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector.</a> iScience. 9, 286-297 (2018).</li><li>Remy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+gene-edited+rats+by+delivery+of+CRISPR/Cas9+protein+and+donor+DNA+into+intact+zygotes+using+electroporation.">Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation.</a> Scientific Reports. 7, 16554 (2017).</li><li>Tanihara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+PDX-1+mutant+porcine+blastocysts+by+introducing+CRISPR/Cas9-system+into+porcine+zygotes+via+electroporation.">Generation of PDX-1 mutant porcine blastocysts by introducing CRISPR/Cas9-system into porcine zygotes via electroporation.</a> Animal Science Journal. 90 (1), 55-61 (2019).</li><li>Zhou, X., Guo, H., Chen, K., Cheng, H., Zhou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+chromosomal+mapping+and+conserved+synteny+of+porcine+Argonaute+family+of+genes.">Identification, chromosomal mapping and conserved synteny of porcine Argonaute family of genes.</a> Genetica. 138 (7), 805-812 (2010).</li><li>Nishio, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+voltage+strength+during+electroporation+on+the+development+and+quality+of+in+vitro-produced+porcine+embryos.">Effects of voltage strength during electroporation on the development and quality of in vitro-produced porcine embryos.</a> Reproduction in Domestic Animals. 53 (2), 313-318 (2018).</li><li>Camargo, L. S. A., Owen, J. R., van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+one-step+knockout+by+electroporation+of+ribonucleoproteins+into+zona-intact+bovine+embryos.">Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos.</a> Frontiers in Genetics. 11, 570069 (2020).</li><li>Escoffre, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+(still+not)+known+of+the+mechanism+by+which+electroporation+mediates+gene+transfer+and+expression+in+cells+and+tissues.">What is (still not) known of the mechanism by which electroporation mediates gene transfer and expression in cells and tissues.</a> Molecular Biotechnology. 41 (3), 286-295 (2009).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-READI:+Efficient+generation+of+knockin+mice+by+CRISPR+RNP+electroporation+and+AAV+donor+infection.">CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection.</a> Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).</li><li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+validation+strategies+for+CRISPR-Cas9+editing.">A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing.</a> Scientific Reports. 8, 888 (2018).</li><li>Modzelewski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse-specific+retrotransposon+drives+a+conserved+Cdk2ap1+isoform+essential+for+development.">A mouse-specific retrotransposon drives a conserved Cdk2ap1 isoform essential for development.</a> Cell. 184 (22), 5541-5558 (2021).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+determinants+of+improved+CRISPR+sgRNA+design.">Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design.</a> Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).</li><li>Sanson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+libraries+for+CRISPR-Cas9+genetic+screens+with+multiple+modalities.">Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities.</a> Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).</li><li>Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+genome+editing+for+single-base+substitutions+using+optimized+ssODNs+with+Cas9-RNPs.">Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs.</a> Scientific Reports. 9, 14811 (2019).</li><li>Duselis, A. R., Vrana, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrieval+of+mouse+oocytes.">Retrieval of mouse oocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (3), e185 (2007).</li><li>Takahashi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GONAD:+Genome-editing+via+oviductal+nucleic+acids+delivery+system:+A+novel+microinjection+independent+genome+engineering+method+in+mice.">GONAD: Genome-editing via oviductal nucleic acids delivery system: A novel microinjection independent genome engineering method in mice.</a> Scientific Reports. 5, 11406 (2015).</li><li>Tu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+Cas9+degradation+reduces+mosaic+mutations+in+non-human+primate+embryos.">Promoting Cas9 degradation reduces mosaic mutations in non-human primate embryos.</a> Scientific Reports. 7, 42081 (2017).</li><li>Aida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning-free+CRISPR/Cas+system+facilitates+functional+cassette+knock-in+in+mice.">Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice.</a> Genome Biology. 16 (1), 87 (2015).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+exon-intron+architecture+variation+of+genes+in+eukaryotic+genomes.">Patterns of exon-intron architecture variation of genes in eukaryotic genomes.</a> BMC Genomics. 10, 47 (2009).</li><li>Quadros, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easi-CRISPR:+a+robust+method+for+one-step+generation+of+mice+carrying+conditional+and+insertion+alleles+using+long+ssDNA+donors+and+CRISPR+ribonucleoproteins.">Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins.</a> Genome Biology. 18, 92 (2017).</li><li>Gurumurthy, C. B., Saunders, T. L., Ohtsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+and+generating+a+mouse+model:+frequently+asked+questions.">Designing and generating a mouse model: frequently asked questions.</a> Journal of Biomedical Research. 35 (2), 76-90 (2021).</li><li>Nakajima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+in+the+knockin+mice+generated+using+the+CRISPR/+Cas+system.">Exome sequencing in the knockin mice generated using the CRISPR/ Cas system.</a> Scientific Reports. 6, 34703 (2016).</li><li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+mutations+are+rare+in+Cas9-modified+mice.">Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice.</a> Nature Methods. 12 (6), 479 (2015).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li></ol>

מוצגת כאן טכנולוגיה פשוטה ויעילה ביותר לעריכת גנום עכבר. אלקטרופורציה יכולה לשמש ליצירת עוברים שעברו שינוי תוך שבוע-שבועיים (איור 1) ויכולה לייצר עכברים ערוכים תוך 6 שבועות9. בהשוואה לפרוטוקולים מבוססי אלקטרופורציה שפותחו במקביל ומספקים RNPs 7,10,11,12,13,14,15,17,...

עריכת גנום בעכברים חיים פשטה במידה ניכרת והפכה לנגישה וזולה יותר מאז הופעתה של עריכת CRISPR 1,2,3. ניסיונות עריכה ראשוניים של בעלי חיים השתמשו במיקרו-הזרקה כדי להעביר CRISPR Cas9 mRNA/sgRNA לעובריםבשלב הגרעיני 4,5,6. בעוד מיקרו-הזרקה יעילה למדי, כמות התרגול הנדרשת כדי לשלוט בה באופן מלא עשויה שלא להתאים למתאמנים ולסטודנטים וגם דורשת ציוד יקר שמעבדה במימון צנוע אינה יכולה להרשות לעצמה. מיקרו-הזרקה מבוצעת בדרך כלל על ידי טכנאים מומחים במתקנים טרנסגניים עם לוחות זמנים ומחירי שירות המגבילים את התעריף עבור חוקרים רבים. גישה נגישה יותר היא זו של אלקטרופורציה, אשר הוכחה כיעילה למדי להעברת CRISPR Cas9 mRNA/sgRNA לעוברים בשלב גרעיני7. שיפורים נוספים באסטרטגיות העריכה והמסירה של גנום CRISPR הצביעו על כך ש-RNPs שהורכבו מראש וכבר עוסקים ב-sgRNA עשויים להיות אמצעי יעיל להפחתת פסיפס8.
הרציונל מאחורי הפיתוח והשימוש בפרוטוקול זה היה לעקוף רבות מהמגבלות והמכשולים הקשורים למיקרו-הזרקה. כפי שהשם מרמז, שיטה קלה, פנימית וחסכונית שיכולה לקבוע במהירות אם תכנוני sgRNA שלא נבדקו יהיו כדאיים לשימוש במהלך ניסוי מיקרו-הזרקה תהיה שלב בקרת איכות מעבר ראשון נוח מאוד (איור 1). בעוד ששיטה זו אינה יכולה להחליף מיקרו-הזרקה לאסטרטגיות מורכבות יותר, כמו החדרת רצפי דנ"א ארוכים של תורמים לתוצאות מבוססות רקומבינציה, היא אידיאלית לאסטרטגיות פחות מורכבות כמו מחיקות קטנות או החדרות ותיוג גנים. שיטה זו מתאימה לחוקרים בעלי מיומנויות בסיסיות של מניפולציה בעוברים שיש להם צרכי עריכה פשוטים, המעוניינים לבחון את ההשערה שלהם במסגרת הזמן של התפתחות טרום השרשה, או מעדיפים לבדוק sgRNA בעוברים לפני קביעת פגישה עם מומחה מיקרו-הזרקה. כאן, ריאגנטים עורכים מועברים באופן זמני לעוברים בשלב הגרעיני כמו Cas9/sgRNA RNPs באמצעות אלקטרופורציה (סדרה של פולסים חשמליים) כדי למקסם את היעילות תוך הפחתת פסיפס8. בשיטת גנוטיפ עוברי, תוצאות העריכה זמינות תוך כשבוע9, ובכך מפחיתות את הצורך ביישומי מיקרו-הזרקה שונים בעלות מופחתת משמעותית.
יעילותה של שיטה זו מגיעה לשיאה בשלב העובר הפרו-גרעיני, כאשר העובר עדיין לא התיך את גרעיני האם והאב או נכנס לשלב S (איור 2). סופרביולציה משמשת למקסום מספר הזיגוטה אך מייצרת גם זיגוטות פרו-גרעיניות וגם ביציות לא מופרות. ניתן גם לבחור מראש זיגוטים בריאים לפני אלקטרופורציה כדי להגביר את היעילות הכוללת. מכיוון שפרוטוקולי אלקטרופורציה אחרים ערכו זיגוטות ביעילות ללא צורך לכלול שלב דומה 7,10,11,12,13,14,15, שלב אופציונלי בפרוטוקול זה הוא שחיקה קלה של הזונה פלוצ'ידה (ZP). ZP היא שכבת גליקופרוטאין המסייעת לקשירת זרעונים, תגובת אקרוזום והפריה סביב עוברים בשלב הגרעיני. מניסיוננו, מצאנו כי שחיקה עדינה על בסיס חומצה של ZP מספקת אספקת אלקטרופורציה Cas9 RNP אמינה עם השפעה שולית בלבד על הכדאיות.
ראינו קצבי העברת RNP של עד 100% יעילות באמצעות אלקטרופורציה בזני עכברים המשמשים בדרך כלל במחקר כמו C57BL/6J ו- C57BL/6N 9,16. קבוצות עצמאיות פיתחו גם נהלים מבוססי אלקטרופורציה עם יעילות גדולה או תואמת מיקרו-הזרקה 11,12,13,14,15,17, עם פרוטוקולי אלקטרופורציה המתפקדים היטב בחולדות18,19, חזיר 20,21,22 ופרה 23 לכן אנו מציעים לקוראים להשוות את הפרוטוקולים כדי למצוא את התנאים המתאימים ביותר לצרכי הניסוי והציוד שלהם., המערכת המתוארת כאן משתמשת בחומרים ובציוד נפוצים, הדורשים רק מיומנויות בסיסיות של מניפולציה עוברית. טכניקה זו יעילה למגוון אסטרטגיות עריכה, מה שהופך שיטה זו לנגישה באופן נרחב לקהילת המחקר.
תכנון רנ"א מדריך קטן אידיאלי (sgRNAs) חיוני לעריכה יעילה. אנו ממליצים לסנן שתיים עד שלוש אסטרטגיות sgRNA לכל אתר מטרה ישירות בעוברי עכברים, במיוחד אם רוצים ליצור קו עכבר. לאחר התכנון, שיטות ללא שיבוט כמו שעתוק חוץ גופי (IVT) לייצור sgRNA באיכות גבוהה מומלצות3. ה-RNPs וה-sgRNA מעורבבים עם 30-50 עוברים מעובדים בשלב הגרעיני ונחשפים לסדרה של פולסים חשמליים כדי לחדור תחילה באופן זמני את ה-ZP ואת קרום התא, עם פולסים עוקבים כדי לשמור על הנקבוביות פתוחות ואלקטרופורזה של ה-RNPs דרך הזיגוטה24. לאחר אופטימיזציה, מצאנו כי שישה פולסים של 3 מילישניות ב- 30 V עבור עוברים בתפזורת (~ 50) היו אופטימליים ליעילות עריכה וכדאיות, וסיפקו משלוח יעיל ביותר של Cas9/sgRNA RNP 9,16,25. ניתן לאשר עריכת אירועים במורולה של עכבר בודד באמצעות מגוון אסטרטגיות אימות נפוצות לעריכת קריספר, כגון פולימורפיזם אורך מקטע הגבלה (RFLP), עיכול אנדונוקלאז T7 וריצוף סנגר של אזור העניין26.
השיטה הנוכחית מתאימה ביותר לסכמות עריכה פשוטות (איור 3), כגון הכנסה/מחיקות (indels), מחיקות בגודל אקסון בסדר גודל של 500-2000 bp, והעברת מוטציות נקודתיות ותוספות קטנות כגון תגי C- או N-Terminal (לדוגמה, FLAG, HA או V5)9,16,27. הפוטנציאל לעריכת גנום מורכבת, כמו החדרות גדולות של תגים פלואורסצנטיים או אללים מותנים, נותר לא ברור והוא המוקד הנוכחי של שיפורים עתידיים.
קל לשלוט בשיטה הזו, וניתן להשתמש בה כדי לבדוק במהירות sgRNA בעוברי עכברים בתרבית בשבוע9 (איור 1). בעבודה זו מוצג פרוטוקול בן שישה שלבים, הכולל 1) תכנון sgRNA; 2) סינתזת sgRNA; 3) ביוץ יתר והזדווגות; 4) תרבית עוברים, איסוף ועיבוד; 5) הרכבת RNP והתחשמלות; 6) תרבית עוברים וגנוטיפ. מידע על כל החומרים בהם נעשה שימוש מסופק (טבלת חומרים). כבקרה חיובית, ריאגנטים לעריכת מוקד הטירוזינאז (Tyr) 9,16 נכללו בטבלה המשלימה 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1-cm-gap electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>cat. no. 1652089</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26-G, 1/2-inch needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>cat. no. 305111</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8211;8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>cat. no. 000664</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm Tissue culture dish</td>
			<td>Greiner Bio-One,</td>
			<td>cat. no. 627-160</td>
			<td>Embryo Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-mm Tissue culture dish</td>
			<td>Greiner Bio-One,</td>
			<td>cat. no. 628-160</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x loading dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>cat. no. R0611</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic Tyrode&#39;s (AT) solution, embryo culture grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich,</td>
			<td>cat. no. T1788</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, embryo culture grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. A3311</td>
			<td>Embryo Processing and Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein</td>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS</td>
			<td>cat. no. 1074181</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, RNase-free</td>
			<td>New England BioLabs,</td>
			<td>cat. no. M0303</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS(calcium and magnesium free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>cat. no. 14190-144</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>cat. no. R3101S</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. EDS-100G</td>
			<td>RNP Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>cat. no. V1016</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (powder) type B, laboratory grade</td>
			<td>Fisher,</td>
			<td>cat. no. G7-500</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol,&#160;molecular-biology grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>cat. no. BP229</td>
			<td>RNP Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>cat. no. M712</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, cell culture grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. H4034</td>
			<td>RNP Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HinfI (10,000 U/mL)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>cat. no. R0155S</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td>
			<td>New England BioLabs,</td>
			<td>cat. no. E2040</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorion gonadotropin, lyophilized&#160;(hCG)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. 230734</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase/M2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. MR-051-F</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids)</td>
			<td>Zenith Biotech</td>
			<td>cat. no. ZEKS-050</td>
			<td>Embryo Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE agarose, analytical grade</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>cat. no. E-3120-500</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Zenith Biotech</td>
			<td>cat. no. ZFM2-050</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. M8266</td>
			<td>RNP and Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. ES-005C</td>
			<td>Embryo Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40,substitute (NP-40)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. 74385</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water, molecular-biology grade</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>cat. no. AM9937</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>custom orders</td>
			<td>sgRNA Design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>cat. no. 31985062</td>
			<td>Embryo Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England BioLabs,</td>
			<td>cat. no. M0530</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. P9333</td>
			<td>RNP and Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG)</td>
			<td>ProspecBio</td>
			<td>cat. no. HOR-272</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, molecular-biology grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>cat. no. BP1700-100</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>cat. no. 20170-333</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free eight-well PCR strip tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>cat. no. 82006-606</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic purification beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>cat. no. 65152105050250</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. C4706</td>
			<td>RNP Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>cat. no. T1085</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 molecular-biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. P7949-500</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient genome editing of mice by crispr electroporation of zygotes

עם יעילות, דיוק וקלות יוצאי דופן, מערכת CRISPR/Cas9 שיפרה באופן משמעותי את עריכת הגנום בתרביות תאים ובניסויים בחיות מעבדה. בעת יצירת מודלים של בעלי חיים, אלקטרופורציה של זיגוטות מציעה יעילות גבוהה יותר, פשטות, עלות ותפוקה, כחלופה לשיטת תקן הזהב של מיקרו-הזרקה. אלקטרופורציה היא גם עדינה יותר, עם כדאיות גבוהה יותר, ומספקת באופן אמין Cas9/Single guide RNA (sgRNA) ribonucleoproteins (RNPs) לתוך הזיגוטה של זני עכברי מעבדה נפוצים (למשל, C57BL/6J ו-C57BL/6N) שמתקרבים ל-100% יעילות מסירה. טכניקה זו מאפשרת החדרה/מחיקה (indels) מוטציות, מוטציות נקודתיות, מחיקה של גנים שלמים או אקסונים, והחדרות קטנות בטווח של 100-200 bp כדי להכניס LoxP או תגים קצרים כמו FLAG, HA או V5. תוך שיפור מתמיד, כאן אנו מציגים את המצב הנוכחי של CRISPR-EZ בפרוטוקול הכולל ייצור sgRNA באמצעות שעתוק חוץ גופי , עיבוד עוברים, הרכבת RNP, אלקטרופורציה וגנוטיפ של עוברים טרום השרשה. חוקר ברמת בוגר עם ניסיון מינימלי במניפולציה של עוברים יכול להשיג עוברים ערוכים גנטית תוך פחות משבוע באמצעות פרוטוקול זה. כאן, אנו מציעים שיטה פשוטה, זולה, יעילה ובעלת קיבולת גבוהה שניתן להשתמש בה עם עוברי עכבר.

שיטה זו מייצרת יותר מ -100 מיקרוגרם של sgRNA (20 μL בריכוז >6,000 ng/L) להרכבה יעילה של Cas9/sgRNA RNP. שיטת הסופרביוץ השגרתית המתוארת כאן מייצרת בדרך כלל 10-20 עוברים בני קיימא לכל נקבה מחוברת. בשל טעויות טיפול והפסדים אופייניים הקשורים למניפולציה של עוברים, צפוי כי 80% מהעוברים מופרים, ברי קיימא ובמצב מצוין לא?...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes at JoVE.com

Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes

במאמר זה אנו מתארים טכניקה פשוטה המיועדת לייצור יעיל של עכברים מהונדסים גנטית הנקראת CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). שיטה זו מספקת ריאגנטים לעריכה על ידי אלקטרופורציה לעוברים ביעילות המתקרבת ל-100%. פרוטוקול זה יעיל עבור מוטציות נקודתיות, החדרות גנומיות קטנות ומחיקות בעוברי יונקים.

עריכה גנומית יעילה של עכברים על ידי CRISPR אלקטרופורציה של זיגוטים

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal ...

שיטה זו יכולה לבדוק רנ"א מנחה בעוברים, לבחון שאלות התפתחותיות מוקדמות או ליצור עכברים ערוכים. כל התקדמות ב- CRISPR Cas9 יכולה לשמש בשיטה זו. היתרון העיקרי בשיטה זו הוא שהיא קלה ללמידה ומשתמשת בריאגנטים הזמינים למעבדות שיש להן גישה לעכברים.בעתיד, טכניקה זו תהיה שימושית לתיקון מחלה או מוטציה בצאצאים של חיית מחמד או חיה חשובה לחקלאות. שיטה זו מתאימה ביותר ליצירת מודלים עכבר. במעבדה שלנו, השתמשנו בווריאציות של שיטה זו כדי לחקור את האירועים סביב הפריה והתפתחות מוקדמת לפני השרשה, במיוחד בקרת גנים בעוצמת העובר.החלק המאתגר ביותר הוא השימוש במחט הזכוכית כדי להעביר עוברים מצלחת לצלחת. מי שתדגים את ההליך הזה תהיה שנטל דיאלו, מומחית מחקר במעבדה שלי. כדי להתחיל באיסוף ועיבוד העוברים, הניחו את נקבת העכבר המורדמת על גבה ורססו 70% אתנול על הבטן לפתיחה כירורגית.כדי לפתוח את חלל הבטן ולהסיר את האובידוקטים, חתכו את שכבת העור במספריים כירורגיים ואתרו את השחלות. לאחר מכן, להסיר בניתוח את שני oviducts, הממוקם פרוקסימלי השחלות, ומניחים אותם לתוך טיפות בודדות 50 מיקרוליטר של M2 בתוספת BSA בינוני. תחת מיקרוסקופ סטריאו, השתמשו במלקחיים לדיסקציה כדי לנקב את האמפולה של האובידוקט כדי לשחרר את קומפלקסי קומולוס-ביציות, או COC, המכילים ביציות, ולאחר מכן כדי למנוע נשיאה של פסולת, העבירו ושלבו כל קומולוס-ביצית לטיפה אחת של 50 מיקרוליטר של M2 בתוספת BSA עם פיפטה מטופלת המוגדרת ל-20 עד 30 מיקרוליטר.לאחר מכן, כדי להסיר תאי קומולוס מהזיגוטות, העבירו COC עם מעט מדיה נוספת לטיפה של 100 מיקרוליטר M2 בתוספת היאלורונידאז וערבבו בעדינות על ידי פיפטינג עד שהעוברים מופרדים באופן נראה לעין מתאי הקומולוס הקטנים בהרבה. כדי לדלל היאלורונידאז ולפנות תאי קומולוס רופפים, השתמשו בפיפט המופעל על ידי הפה כדי להעביר את הזיגוטה לטיפת M2 טרייה של 50 מיקרוליטר בתוספת BSA. לאחר מכן, כדי לשחוק את zona pellucida של העובר ולהפחית מכשולים פיזיים נוספים למסירה מגיבה, להעביר את העוברים לטיפה 100 מיקרוליטר שחוממה מראש של חומצה Tyrode, או תמיסת AT, על צלחת 60 מ"מ.התבונן ברציפות בזיגוטה תחת מיקרוסקופ סטריאו עד ש-30% מהזונה פלוצ'ידה נשחקת, ואז כדי לדלל את ה-AT, העבר את העוברים דרך ארבע טיפות של 50 מיקרוליטר של M2 בתוספת BSA. לאחר מכן, לקבוע מספר מתאים של עוברים שעובדו על ידי ספירתם תחת מיקרוסקופ סטריאו. לדלל BSA על ידי העברת העוברים דרך שתי טיפות של 50 מיקרוליטר של מדיה מופחתת בסרום.לאחר מכן, פיפטה בפה 25 עד 30 עוברים לתוך טיפה של 10 מיקרוליטר של מדיה מופחתת בסרום, ולאחר מכן להשתמש פיפטה כף יד כדי להוסיף 10 מיקרוליטר של ריבונוקלאו פרוטאין או קומפלקס RNP. לדלל את גליצרול צמיג מן קומפלקס RNP הומוגניזציה הדגימה על ידי pipetting 10 פעמים או עד תערובת כבר לא מראה צמיגות. לאחר מכן, פיפטה 20 מיקרוליטר של תערובת עובר ו- RNP לתוך קובטת אלקטרופורציה של 0.1 ס"מ תוך הימנעות מבועות, ולאחר מכן כדי להעביר את ריאגנטי העריכה לתוך הזיגוטה אלקטרופורציה את העוברים באמצעות פרוטוקול גל מרובע של 30 וולט, 4 עד 6 פולסים עם אורך פולס 3 אלפיות השנייה, ו 100 מרווחי פעימות.לאחר מכן, הוסיפו 50 מיקרוליטר של M2 בתוספת BSA לחלק העליון של הקובט כדי לשטוף את העוברים מהקובטה ופיפט בעדינות את התערובת הזו לצלחת. לתרבית עוברים, העבירו 20 עד 30 זיגוטות לטיפה של KSOM בתוספת BSA בצלחת תרבית מאוזנת מראש והעבירו את העוברים לטיפה. דוגרים על הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו-חמצני עם 95% לחות.למחרת, העבירו רק עוברים דו-תאיים לטיפה טרייה של תערובת KSOM בתוספת BSA והחזירו את הצלחת לאינקובטור. להשאיר או להשליך את העוברים המתים או הלא מופרים. לפני הג'נוטיפ, שטפו את עוברי המורולה בלסטוציסט בשתי טיפות של DPBS כדי לדלל את רכיבי המדיה שעלולים להפריע לתגובת PCR.באמצעות פיפטה הפה, להעביר עוברים בודדים לבאר אחת של רצועת PCR 8 באר ולהוסיף 10 מיקרוליטר של חיץ ליזיס. לאחר מכן, כדי לשכב את העוברים, תכנת מחזור תרמי ל 55 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות, ואז להשבית את פרוטאינאז K עם דגירה של 10 דקות ב 95 מעלות צלזיוס. במחקר זה מוצגת אסטרטגיה לדוגמה למיקוד מוקד הטירוזינאז בעכבר כבקרה חיובית, כולל עיצובי אוליגו ואסטרטגיות גנוטיפ לחיבור קצה לא הומולוגי ותיקון מכוון הומולוגיה.בעת מסירת מדריך יחיד יחיד, או sgRNA, אספקת RNPs הייתה עד וכולל 100% בזני עכברי C57 שחורים 6J ו- C57 שחורים 6N עם היווצרות מחיקות החדרה המתרחשות ב- 50% עד 100% ותחליפים קטנים מבוססי אוליגו הנעים בין 17% ל- 63% בעת הנדסת מחיקות גנומיות, יעילות העריכה משתנה בין 3% ל -100%העובר צריך להישמר בתנאים אידיאליים ככל האפשר, כך שככל ש הפרוטוקול נעשה, יותר טוב. כמו כן, צמצמו את החשיפה להיאלורונידאז ולחומצה טירוד. שיטה זו מתארת יצירת בעל חיים ערוך, בדיקת יכולת השתלה או כדאיות הריונית, או ביצוע הניסוי מספר פעמים כדי לאסוף מדידות או תמונות ומדדים שונים במהלך הפיתוח שלפני הנטיעה.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

העברה יעילה ג&#39;ין בצ&#39;יק הרשתיות לסלולריים יסודי לימודי תרבות:<em&gt; אקס-אוב</em&gt; גישת Electroporation

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג&#39;ין העברה על ידי Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Snapshot הגנום של רגולטורי הכרומטין והברית ב<em&gt; Xenopus</em&gt; עוברים על ידי שבב Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

דור יעיל של כתבים במכות ספציפיים Lineage hiPSC עצבי באמצעות CRISPR / Cas9 ומערכת Nickase זוגי Cas9

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

העברת גנים לתוך האיברים השמיעתיים עוף ידי<em&gt; ב אובו</em&gt; מיקרו electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Microinjection עבור עריכת Transgenesis ו הגנום ב הקוצנים Threespine

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

בתיווך CRISPR אובדן ניתוח פונקציה גרגר אסטרוציטומה תאים באמצעות בתוך הרחם מבוסס-אלקטרופורציה את ההעברה של ג'ין

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

אסטרטגיית יעיל ליצירת מערכות רקמות ספציפיות שעתוק בינאריים ב דרוזופילה על-ידי עריכת הגנום

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים מרובים בעוברי העופות באמצעות mRNA אלקטרופורציה

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

מיקרו-ג'יג'יטציה של ביצים והזדווגות יעילה לעריכת גנום בבית הכבאות תרמוביה

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...