Name: efficient genome editing of mice by crispr electroporation of zygotes
Uploaded: 2022-12-16T13:20:00
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A.J.M.は、CRISPR-EZの開発につながる独自のコンセプトを作成し、フィギュアを作成しました。C.K.D.は、この現在の原稿のために内部および公開されたプロトコルを編集および適応させました。A.J.M. は NIH (R00HD096108) によってサポートされています。

このプロトコル全体のすべての動物の世話と使用は、動物福祉法の方針である実験動物の世話と使用のためのILARガイドに準拠し、安楽死のためのAVMAとペンシルベニア大学施設動物管理使用委員会(IACUC)のガイドラインと方針に従いました。動物の世話と使用のプロトコルは、このプロジェクトのためにペンシルベニア大学IACUCによってレビューされ、承認されました。コンプライアンスと注?...

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ここでは、簡単で高効率なマウスゲノム編集技術を紹介します。エレクトロポレーションは、1〜2週間で改変胚を生成するために使用でき(図1)、6週間以内に編集されたマウスを作製することができる9。RNP 7、10、11、12、13、14、15、<sup cla...

生きたマウスでのゲノム編集は、CRISPR編集の出現以来、かなり簡素化され、アクセスしやすく、より手頃な価格になりました1,2,3。最初の動物編集の試みでは、マイクロインジェクションを使用してCRISPR Cas9 mRNA/sgRNAを核期胚に送達しました4,5,6。マイクロインジェクションは非常に効果的ですが、それを完全に習得するために必要な練習の量は、研修生や学生には適切ではない可能性があり、適度な資金のあるラボでは購入できない高価な機器も必要です。マイクロインジェクションは通常、トランスジェニック施設の専門技術者によって行われ、多くの研究者にとってレート制限のあるスケジュールとサービス価格があります。よりアクセスしやすいアプローチはエレクトロポレーションのアプローチであり、これはCRISPR Cas9 mRNA/sgRNAの前核段階の胚への送達に非常に効果的であることが実証されています7。CRISPRゲノム編集および送達戦略のさらなる改善は、すでにsgRNAと結合している事前に組み立てられたRNPがモザイク現象を低減する効果的な手段である可能性があることを示唆しました8。
このプロトコルの開発と使用の背後にある理論的根拠は、マイクロインジェクションに関連する制限と障害の多くを回避することでした。名前が示すように、マイクロインジェクション実験中にテストされていないsgRNAデザインを使用する価値があるかどうかを迅速に判断できる、簡単で社内の費用対効果の高い方法は、非常に便利なファーストパス品質管理ステップです(図1)。この方法は、組換えベースの結果のために長いドナーDNA配列を導入するなど、より複雑な戦略ではマイクロインジェクションに取って代わることはできませんが、小さな欠失や挿入、遺伝子のタグ付けなどのそれほど複雑でない戦略には理想的です。この方法は、基本的な胚操作スキルを持つ研究者で、単純な編集ニーズを持っている、着床前の開発の時間枠内で仮説をテストしたい、またはマイクロインジェクションの専門家との予約をスケジュールする前に胚でsgRNAをテストしたい研究者に適しています。ここでは、編集試薬は、エレクトロポレーション(一連の電気パルス )を介して Cas9 / sgRNPとして核段階の胚に一過性に送達され、モザイク現象を減らしながら効率を最大化します8。胚ジェノタイピング法を使用すると、編集結果は約1週間9で利用可能になるため、大幅に削減されたコストでさまざまなマイクロインジェクションアプリケーションの必要性が減少します。
この方法の有効性は、胚がまだ母方と父方の前核を融合していない、またはS期に入っていない前核胚段階でピークに達します(図2)。過排卵は接合子の数を最大化するために使用されますが、前核接合子と未受精卵の両方を生成します。健康な接合子は、エレクトロポレーションの前に事前に選択して、全体的な効率を高めることもできます。他のエレクトロポレーションプロトコルは、同様のステップ7、10、11、12、13、14、15を含む必要なしに接合子を効率的に編集しているので、このプロトコルのオプションのステップは、透明帯(ZP)のわずかな侵食である。ZPは、精子の結合、先体反応、および前核段階の胚を取り巻く受精を助ける糖タンパク質層です。私たちの経験では、ZPの穏やかな酸ベースの侵食は、生存率にわずかな影響しか及ぼさずに、信頼性の高いCas9 RNPエレクトロポレーション送達を提供することがわかりました。
C57BL/6JやC57BL/6N 9,16などの研究で一般的に使用されているマウス系統において、エレクトロポレーションによる最大100%の効率のRNP送達率が観察されています。独立したグループはまた、マイクロインジェクション11、12、13、14、15、17よりも高い、またはそれと一致する効率のエレクトロポレーションベースの手順を開発し、エレクトロポレーションプロトコルはラット18、19、ブタ20、21、22、およびウシ23で良好に機能しています。したがって、読者はプロトコルを比較して、実験および機器のニーズに最適な条件を見つけることをお勧めします。ここで説明するシステムは、一般的な材料と機器を使用しており、基本的な胚操作スキルのみを必要とします。この手法は、さまざまな編集戦略に効果的であり、研究コミュニティがこの方法を広く利用できるようにします。
理想的な低分子ガイドRNA(sgRNA)を設計することは、効率的な編集に不可欠です。特にマウス系統の作製が必要な場合は、マウス胚の標的部位ごとに2〜3個のsgRNA戦略を直接スクリーニングすることをお勧めします。設計後は、高品質のsgRNAを作製するためのin vitro転写(IVT)などのクローニングフリーの方法が推奨されます3。RNPおよびsgRNAは、30〜50個の処理された前核期胚と混合され、一連の電気パルスにさらされて最初にZPおよび細胞膜を一時的に透過し、その後のパルスで孔を開いたままにし、接合子24を通してRNPを電気泳動します。最適化の結果、バルク胚(~50)に対して30 Vで6つの3 msパルスが編集効果と生存率に最適であり、非常に効率的なCas9/sgRNA RNP送達を提供することがわかりました9,16,25。個々のマウス桑実胚における編集イベントは、制限断片長多型(RFLP)、T7エンドヌクレアーゼ消化、および関心領域のサンガーシーケンシングなど、CRISPR編集に一般的なさまざまな検証戦略を使用して確認できます26。
現在の方法は、挿入/欠失(インデル)、500〜2000 bp程度のエクソンサイズの欠失、およびC末端またはN末端タグ(FLAG、HA、V5など)などの点突然変異や小さな挿入の送達などの単純な編集スキーム(図3)に最も適しています9,16,27。蛍光タグや条件付き対立遺伝子の大規模な挿入のような複雑なゲノム編集の可能性は依然として不確実であり、今後の改善の現在の焦点です。
この方法は容易に習得でき、培養マウス胚のsgRNAを1週間で迅速に試験するために使用できます9(図1)。この研究で提示されているのは、1)sgRNAデザインを含む6段階のプロトコルです。2)sgRNA合成;3)過剰排卵および交尾;4)胚の培養、収集、および処理。5)RNPアセンブリとエレクトロポレーション。6)胚培養とジェノタイピング。使用されているすべての材料に関する情報が提供されています(材料表)。陽性対照として、チロシナーゼ(Tyr)遺伝子座9,16を編集する試薬が付表1に含まれている。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1-cm-gap electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>cat. no. 1652089</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26-G, 1/2-inch needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>cat. no. 305111</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8211;8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>cat. no. 000664</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm Tissue culture dish</td>
			<td>Greiner Bio-One,</td>
			<td>cat. no. 627-160</td>
			<td>Embryo Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-mm Tissue culture dish</td>
			<td>Greiner Bio-One,</td>
			<td>cat. no. 628-160</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x loading dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>cat. no. R0611</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic Tyrode&#39;s (AT) solution, embryo culture grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich,</td>
			<td>cat. no. T1788</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, embryo culture grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. A3311</td>
			<td>Embryo Processing and Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein</td>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS</td>
			<td>cat. no. 1074181</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, RNase-free</td>
			<td>New England BioLabs,</td>
			<td>cat. no. M0303</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS(calcium and magnesium free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>cat. no. 14190-144</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>cat. no. R3101S</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. EDS-100G</td>
			<td>RNP Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>cat. no. V1016</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (powder) type B, laboratory grade</td>
			<td>Fisher,</td>
			<td>cat. no. G7-500</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol,&#160;molecular-biology grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>cat. no. BP229</td>
			<td>RNP Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>cat. no. M712</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, cell culture grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. H4034</td>
			<td>RNP Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HinfI (10,000 U/mL)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>cat. no. R0155S</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td>
			<td>New England BioLabs,</td>
			<td>cat. no. E2040</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorion gonadotropin, lyophilized&#160;(hCG)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. 230734</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase/M2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. MR-051-F</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids)</td>
			<td>Zenith Biotech</td>
			<td>cat. no. ZEKS-050</td>
			<td>Embryo Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE agarose, analytical grade</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>cat. no. E-3120-500</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Zenith Biotech</td>
			<td>cat. no. ZFM2-050</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. M8266</td>
			<td>RNP and Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. ES-005C</td>
			<td>Embryo Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40,substitute (NP-40)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. 74385</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water, molecular-biology grade</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>cat. no. AM9937</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>custom orders</td>
			<td>sgRNA Design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>cat. no. 31985062</td>
			<td>Embryo Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England BioLabs,</td>
			<td>cat. no. M0530</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. P9333</td>
			<td>RNP and Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG)</td>
			<td>ProspecBio</td>
			<td>cat. no. HOR-272</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, molecular-biology grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>cat. no. BP1700-100</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>cat. no. 20170-333</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free eight-well PCR strip tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>cat. no. 82006-606</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic purification beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>cat. no. 65152105050250</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. C4706</td>
			<td>RNP Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>cat. no. T1085</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 molecular-biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. P7949-500</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient genome editing of mice by crispr electroporation of zygotes

卓越した効率、精度、および容易さを備えたCRISPR/Cas9システムは、細胞培養および実験動物実験におけるゲノム編集を大幅に改善しました。動物モデルを生成する場合、接合子のエレクトロポレーションは、マイクロインジェクションのゴールドスタンダード法の代替として、より高い効率、シンプルさ、コスト、およびスループットを提供します。エレクトロポレーションはまた、より穏やかで生存率が高く、Cas9 /シングルガイドRNA(sgRNA)リボ核タンパク質(RNP)を一般的な実験用マウス系統(C57BL / 6JおよびC57BL / 6Nなど)の接合子に確実に送達し、100%の送達効率に近づきます。この手法により、挿入/欠失(インデル)変異、点突然変異、遺伝子またはエクソン全体の欠失、およびLoxPまたはFLAG、HA、V5などの短いタグを挿入するための100〜200 bpの範囲の小さな挿入が可能になります。ここでは、絶えず改善されていますが、in vitro 転写、胚処理、RNPアセンブリ、エレクトロポレーション、着床前胚のジェノタイピングによるsgRNA産生を含むプロトコルでCRISPR-EZの現状を示します。胚の操作経験が最小限の大学院レベルの研究者は、このプロトコルを使用して1週間未満で遺伝子編集された胚を取得できます。ここでは、マウス胚に使用できる、簡単で低コスト、効率的、大容量の方法を提供します。

この方法では、効率的なCas9/sgRNPアセンブリのために、100 μgを超えるsgRNA(>6,000 ng/L濃度で20 μL)が生成されます。ここで説明するルーチンの過剰排卵法は、通常、プラグされた女性あたり10〜20個の生存可能な胚を生成します。胚操作に関連する取り扱いエラーと典型的な損失により、予想される胚の80%は受精し、生存可能で、エレクトロポレーション後に優れた状態にあります。研究者が実験?...

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Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes

ここでは、CRISPR RNP接合子のエレクトロポレーション(CRISPR-EZ)と呼ばれる遺伝子改変マウスの効率的な生成を目的とした簡単な手法について説明します。この方法は、編集試薬をエレクトロポレーションにより胚に100%に近い効率で送達する。このプロトコルは、哺乳類胚における点突然変異、小さなゲノム挿入、および欠失に効果的です。

接合子のCRISPRエレクトロポレーションによるマウスの効率的なゲノム編集

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal ...

この方法は、胚のガイドRNAをチェックしたり、初期の発生の質問をテストしたり、編集されたマウスを作成したりすることができます。CRISPR Cas9の進歩は、この方法で使用できます。この方法の主な利点は、習得が容易であり、マウスにアクセスできるラボで利用可能な試薬を使用することです。将来的には、この技術は、コンパニオンアニマルまたは農業上重要な動物の子孫の病気または突然変異を修正するのに役立つでしょう。この方法は、マウス モデルの生成に最適です。私たちの研究室では、この方法のバリエーションを使用して、受精と着床前早期発生を取り巻くイベント、特に胚の効力における遺伝子制御を調査しています。最も困難な部分は、ガラス針を使用して胚をプレートからプレートに移動することです。この手順を実演するのは、私の研究室の研究スペシャリストであるシャンタル・ディアロです。胚の収集と処理を開始するには、安楽死させた雌マウスを背中に置き、腹部に70%エタノールをスプレーして外科的に開きます。腹腔を開いて卵管を除去するには、外科用ハサミで皮膚層を切断し、卵巣を見つけます。次に、卵巣の近位に位置する両方の卵管を外科的に除去し、それらをM2とBSA培地の個々の50マイクロリットルの液滴に入れます。実体顕微鏡下で、解剖鉗子を使用して卵管の膨大部に傷を付け、卵母細胞を含む積雲-卵母細胞複合体(COC)を放出し、破片のキャリーオーバーを避けるために、各卵母細胞を移し、20〜30マイクロリットルに設定されたハンドルピペットでM2とBSAの単一の50マイクロリットルの液滴に混ぜ合わせます。次に、接合子から卵雲細胞を除去するには、少量の余分な培地を含むCOCを100マイクロリットルのM2とヒアルロニダーゼの液滴に移し、胚がはるかに小さな卵雲細胞から目に見えて分離されるまでピペッティングで穏やかに混合します。ヒアルロニダーゼを希釈し、緩んだ積雲細胞を取り除くには、口内ピペットを使用して接合子を新しい50マイクロリットルのM2プラスBSA液滴に移動します。次に、胚の透明帯を侵食し、試薬送達のための追加の物理的障害を減らすために、胚を60ミリメートルプレート上の酸チロードまたはAT溶液の予熱した100マイクロリットルの液滴に移します。透明帯の30%が侵食されるまで実体顕微鏡下で接合子を連続的に観察し、次にATを希釈するために、M2とBSAの4つの50マイクロリットルの液滴に胚を通過させます。次に、実体顕微鏡でカウントすることにより、処理された胚の適切な数を決定します。胚を50マイクロリットルの還元血清培地の2滴に通すことによってBSAを希釈する。次に、マウスピペット25〜30個の胚を10マイクロリットルの還元血清培地の液滴に入れ、次にハンドヘルドピペットを使用して10マイクロリットルのリボ核タンパク質またはRNP複合体を追加します。RNP複合体から粘性グリセロールを希釈し、10回または混合物が粘度を示さなくなるまでピペッティングによってサンプルを均質化します。次に、20マイクロリットルの胚とRNPの混合物を気泡を避けながら0.1センチメートルのエレクトロポレーションキュベットにピペットで入れ、次に編集試薬を接合子に送達し、30ボルトの方形波プロトコル、3ミリ秒のパルス長で4〜6パルス、100パルス間隔を使用して胚をエレクトロポレーションします。次に、50マイクロリットルのM2とBSAをキュベットの上部に加えて、キュベットから胚を洗い流し、この混合物をプレートに静かにピペットで取り出します。胚培養の場合は、20〜30個の接合子を、事前に平衡化した培養プレート内のKSOMとBSAの液滴に移し、胚を液滴に移動します。プレートを摂氏37度で5%の二酸化炭素、湿度95%で一晩インキュベートします。翌日、2細胞胚のみをKSOMとBSA混合物の新鮮な液滴に移し、プレートをインキュベーターに戻します。死んだまたは受精していない胚を残すか捨てる。ジェノタイピングの前に、桑実胚盤胞胚を2滴のDPBSで洗浄し、PCR反応を妨げる可能性のある培地成分を希釈します。マウスピペットを使用して、個々の胚を8ウェルPCRストリップの1ウェルに移し、10マイクロリットルの溶解バッファーを追加します。次に、胚を溶解するために、サーマルサイクラーを摂氏55度に4時間プログラムし、次に摂氏95度で10分間インキュベートしてプロテイナーゼKを不活性化します。本研究では、非相同末端結合および相同性指向性修復のためのオリゴデザインおよびジェノタイピング戦略を含む、ポジティブコントロールとしてマウスチロシナーゼ遺伝子座を標的とする戦略の例を示す。単一のシングルガイド(sgRNA)を送達する場合、RNPの送達は、C57ブラック6JおよびC57ブラック6Nマウス系統で最大100%であり、挿入欠失形成は50〜100%で発生し、小さなオリゴベースの置換は17〜63%の範囲であった。 ゲノム欠失を工学する場合、編集効果は3%から100%まで変化します胚は、可能な限り理想的な条件に近づけて、より迅速にプロトコルは完了しています。また、ヒアルロニダーゼと酸タイロードへの曝露を最小限に抑えます。この方法は、編集された動物を生成すること、着床または妊娠生存率をテストすること、または実験を複数回実行して、プランテーション前の開発中に測定値または画像および様々な測定基準を収集することを記述する。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

初代細胞培養研究のためのひよこ網膜における効率的な遺伝子導入：<em&gt;元オボ</em&gt;エレクトロポレーションアプローチ

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

エレクトロポレーションによりマウス胎児蝸牛外植の文化と遺伝子導入

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

クロマチンレギュレータと米国でのゲノムワイドスナップショット<em&gt;アフリカツメガエル</emChIPの-配列によって&gt;胚

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

hiPSC神経系統を効率的に生成するCRISPRを使用して特定のノック記者/ Cas9とCas9ダブルニッカーゼシステム

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

チキン聴覚器官への遺伝子導入によって、<em&gt;卵内</em&gt;マイクロエレクト​​ロポレーション

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Threespineトゲウオにおける遺伝子導入およびゲノム編集のためのマイクロインジェクション

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR を介した損失関数における小脳顆粒細胞のエレクトロポレーション法による遺伝子導入の子宮内を使用して

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

ショウジョウバエのゲノム編集による組織固有のバイナリ転写システムを生成するための効率的な戦略

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

mRNAエレクトロポレーションを用いて鳥類胚における複数のタンパク質の迅速かつ効率的な発現

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

ファクトブラトサーモビア家電におけるゲノム編集のための卵マイクロインジェクションと効率的な交配

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...