Name: efficient genome editing of mice by crispr electroporation of zygotes
Uploaded: 2022-12-16T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes at JoVE.com

A.J.M.은 CRISPR-EZ의 개발로 이어진 독창적인 개념을 만들고 피규어를 제작했습니다. C.K.D.는 이 현재 원고에 대한 내부 및 출판된 프로토콜을 편집하고 조정했습니다. AJM은 NIH (R00HD096108)에 의해 지원됩니다.

이 프로토콜 전반에 걸친 모든 동물 관리 및 사용은 동물 복지법 정책인 ILAR 실험실 동물 관리 및 사용 가이드를 준수하고 안락사에 대한 AVMA 및 펜실베니아 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC) 지침 및 정책의 지침을 따랐습니다. 동물 관리 및 사용 프로토콜은이 프로젝트를 위해 펜실베니아 대학 IACUC에서 검토하고 승인했습니다. 규정 준수 및주의의 문제로이 프로토콜을 시도하기 전에 ?...

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	<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+determinants+of+improved+CRISPR+sgRNA+design.">Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design.</a> Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).</li><li>Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR/Cas9+delivery.">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> eLife. 3, 04766 (2014).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CRISPR/HDR-mediated+knock-in+for+mouse+embryonic+stem+cells+and+zygotes.">Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes.</a> Biotechniques. 59 (4), 201-208 (2015).</li><li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li><li>Fujii, W., Onuma, A., Sugiura, K., Naito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+phenotype-expressing+triple-knockout+mice+with+heritable+mutated+alleles+by+the+CRISPR/Cas9+system.">One-step generation of phenotype-expressing triple-knockout mice with heritable mutated alleles by the CRISPR/Cas9 system.</a> Journal of Reproduction and Development. 60 (4), 324-327 (2014).</li><li>Kaneko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+genome+editing+of+rodent+intact+embryos+by+electroporation.">Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation.</a> PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).</li><li>Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaicism+in+CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing.">Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing.</a> Developmental Biology. 445 (2), 156-162 (2019).</li><li>Modzelewski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+mouse+genome+engineering+by+CRISPR-EZ+technology.">Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology.</a> Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).</li><li>Gurumurthy, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+CRISPR-based+germline-genome-engineered+mice+without+ex+vivo+handling+of+zygotes+by+i-GONAD.">Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD.</a> Nature Protocols. 14 (8), 2452-2482 (2019).</li><li>Hur, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+in+mice+by+electroporation+of+Cpf1+ribonucleoproteins.">Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins.</a> Nature Biotechnology. 34 (8), 807-808 (2016).</li><li>Tr&#246;der, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+electroporation+approach+for+efficient+CRISPR/Cas9+genome+editing+in+murine+zygotes.">An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes.</a> PLoS One. 13 (5), 0196891 (2018).</li><li>Qin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR/cas9-mediated+genome+editing+in+mice+by+zygote+electroporation+of+nuclease.">Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease.</a> Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).</li><li>Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+Cas9+protein/sgRNA+into+early+pronuclear+zygotes+generates+non-mosaic+mutants+in+the+mouse.">Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse.</a> Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).</li><li>Teixeira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+mice+zygotes+with+dual+guide+RNA/Cas9+complexes+for+simple+and+efficient+cloning-free+genome+editing.">Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing.</a> Scientific Reports. 8, 474 (2018).</li><li>Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. -. F., Modzelewski, A. J., He, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+mouse+genome+editing+by+CRISPR+ribonucleoprotein+electroporation+of+zygotes.">Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+Cas9+protein+into+mouse+zygotes+through+a+series+of+electroporation+dramatically+increased+the+efficiency+of+model+creation.">Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increased the efficiency of model creation.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).</li><li>Mizuno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-embryo+gene+cassette+knockin+by+CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing+with+adeno-associated+viral+vector.">Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector.</a> iScience. 9, 286-297 (2018).</li><li>Remy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+gene-edited+rats+by+delivery+of+CRISPR/Cas9+protein+and+donor+DNA+into+intact+zygotes+using+electroporation.">Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation.</a> Scientific Reports. 7, 16554 (2017).</li><li>Tanihara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+PDX-1+mutant+porcine+blastocysts+by+introducing+CRISPR/Cas9-system+into+porcine+zygotes+via+electroporation.">Generation of PDX-1 mutant porcine blastocysts by introducing CRISPR/Cas9-system into porcine zygotes via electroporation.</a> Animal Science Journal. 90 (1), 55-61 (2019).</li><li>Zhou, X., Guo, H., Chen, K., Cheng, H., Zhou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+chromosomal+mapping+and+conserved+synteny+of+porcine+Argonaute+family+of+genes.">Identification, chromosomal mapping and conserved synteny of porcine Argonaute family of genes.</a> Genetica. 138 (7), 805-812 (2010).</li><li>Nishio, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+voltage+strength+during+electroporation+on+the+development+and+quality+of+in+vitro-produced+porcine+embryos.">Effects of voltage strength during electroporation on the development and quality of in vitro-produced porcine embryos.</a> Reproduction in Domestic Animals. 53 (2), 313-318 (2018).</li><li>Camargo, L. S. A., Owen, J. R., van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+one-step+knockout+by+electroporation+of+ribonucleoproteins+into+zona-intact+bovine+embryos.">Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos.</a> Frontiers in Genetics. 11, 570069 (2020).</li><li>Escoffre, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+(still+not)+known+of+the+mechanism+by+which+electroporation+mediates+gene+transfer+and+expression+in+cells+and+tissues.">What is (still not) known of the mechanism by which electroporation mediates gene transfer and expression in cells and tissues.</a> Molecular Biotechnology. 41 (3), 286-295 (2009).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-READI:+Efficient+generation+of+knockin+mice+by+CRISPR+RNP+electroporation+and+AAV+donor+infection.">CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection.</a> Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).</li><li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+validation+strategies+for+CRISPR-Cas9+editing.">A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing.</a> Scientific Reports. 8, 888 (2018).</li><li>Modzelewski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse-specific+retrotransposon+drives+a+conserved+Cdk2ap1+isoform+essential+for+development.">A mouse-specific retrotransposon drives a conserved Cdk2ap1 isoform essential for development.</a> Cell. 184 (22), 5541-5558 (2021).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+determinants+of+improved+CRISPR+sgRNA+design.">Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design.</a> Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).</li><li>Sanson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+libraries+for+CRISPR-Cas9+genetic+screens+with+multiple+modalities.">Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities.</a> Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).</li><li>Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+genome+editing+for+single-base+substitutions+using+optimized+ssODNs+with+Cas9-RNPs.">Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs.</a> Scientific Reports. 9, 14811 (2019).</li><li>Duselis, A. R., Vrana, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrieval+of+mouse+oocytes.">Retrieval of mouse oocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (3), e185 (2007).</li><li>Takahashi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GONAD:+Genome-editing+via+oviductal+nucleic+acids+delivery+system:+A+novel+microinjection+independent+genome+engineering+method+in+mice.">GONAD: Genome-editing via oviductal nucleic acids delivery system: A novel microinjection independent genome engineering method in mice.</a> Scientific Reports. 5, 11406 (2015).</li><li>Tu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+Cas9+degradation+reduces+mosaic+mutations+in+non-human+primate+embryos.">Promoting Cas9 degradation reduces mosaic mutations in non-human primate embryos.</a> Scientific Reports. 7, 42081 (2017).</li><li>Aida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning-free+CRISPR/Cas+system+facilitates+functional+cassette+knock-in+in+mice.">Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice.</a> Genome Biology. 16 (1), 87 (2015).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+exon-intron+architecture+variation+of+genes+in+eukaryotic+genomes.">Patterns of exon-intron architecture variation of genes in eukaryotic genomes.</a> BMC Genomics. 10, 47 (2009).</li><li>Quadros, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easi-CRISPR:+a+robust+method+for+one-step+generation+of+mice+carrying+conditional+and+insertion+alleles+using+long+ssDNA+donors+and+CRISPR+ribonucleoproteins.">Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins.</a> Genome Biology. 18, 92 (2017).</li><li>Gurumurthy, C. B., Saunders, T. L., Ohtsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+and+generating+a+mouse+model:+frequently+asked+questions.">Designing and generating a mouse model: frequently asked questions.</a> Journal of Biomedical Research. 35 (2), 76-90 (2021).</li><li>Nakajima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+in+the+knockin+mice+generated+using+the+CRISPR/+Cas+system.">Exome sequencing in the knockin mice generated using the CRISPR/ Cas system.</a> Scientific Reports. 6, 34703 (2016).</li><li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+mutations+are+rare+in+Cas9-modified+mice.">Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice.</a> Nature Methods. 12 (6), 479 (2015).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li></ol>

여기에 제시된 것은 간단하고 매우 효율적인 마우스 게놈 편집 기술입니다. 전기천공은 1-2주 내에 변형된 배아를 생성하는 데 사용할 수 있으며(그림 1)6주 이내에 편집된 마우스를 생산할 수 있습니다9. RNP 7,10,11,12,13,14,15,17,32를 제공하는 동시대에 개발된 전기천공 기반 프로토콜과 비교할 때<sup class="xre...

살아있는 마우스에서의 게놈 편집은 상당히 단순화되었으며 CRISPR 편집 1,2,3의 출현 이후 접근 가능하고 저렴해졌습니다. 초기 동물 편집 시도는 CRISPR Cas9 mRNA/sgRNA를 핵단계 배아 4,5,6에 전달하기 위해 미세 주입을 사용했습니다. 미세 주입은 매우 효과적이지만 완전히 마스터하는 데 필요한 연습량은 연수생과 학생에게 적합하지 않을 수 있으며 적당한 자금 지원을 받는 실험실에서는 감당할 수 없는 값비싼 장비가 필요합니다. 미세 주사는 일반적으로 많은 연구자에게 속도 제한적인 일정과 서비스 가격으로 형질 전환 시설의 전문 기술자가 수행합니다. 보다 접근하기 쉬운 접근법은 CRISPR Cas9 mRNA / sgRNA를 핵 단계 배아7로 전달하는 데 매우 효과적인 것으로 입증 된 전기 천공법입니다. CRISPR 게놈 편집 및 전달 전략의 추가 개선은 이미 sgRNA와 결합된 사전 조립된 RNP가모자이크주의를 감소시키는 효과적인 수단이 될 수 있음을 시사했습니다8.
이 프로토콜의 개발 및 사용의 근거는 미세 주입과 관련된 많은 한계와 장애물을 우회하는 것이 었습니다. 이름에서 알 수 있듯이 미세주입 실험 중에 테스트되지 않은 sgRNA 설계가 가치가 있는지 여부를 신속하게 결정할 수 있는 쉽고 비용 효율적인 사내 방법은 매우 편리한 1차 통과 품질 관리 단계가 될 것입니다(그림 1). 이 방법은 재조합 기반 결과를 위해 긴 기증자 DNA 서열을 도입하는 것과 같은 더 복잡한 전략에 대한 미세 주입을 대체할 수는 없지만 작은 결실 또는 삽입 및 유전자 태깅과 같은 덜 복잡한 전략에는 이상적입니다. 이 방법은 간단한 편집이 필요하거나, 착상 전 발달 기간 내에 가설을 테스트하거나, 미세 주입 전문가와 약속을 잡기 전에 배아에서 sgRNA를 테스트하는 것을 선호하는 기본적인 배아 조작 기술을 가진 연구자에게 적합합니다. 여기에서 편집 시약은 전기천공(일련의 전기 펄스)을 통해 Cas9/sgRNA RNP로 핵 단계 배아에 일시적으로 전달되어모자이크를 줄이면서 효율성을 극대화합니다8. 배아 유전형 분석 방법을 사용하면 약 1주일 만에 편집 결과를 얻을 수 있습니다.9 따라서 크게 절감된 비용으로 다양한 미세 주입 응용 분야의 필요성을 줄일 수 있습니다.
이 방법의 효과는 배아가 아직 모계와 부계 전핵을 융합하지 않았거나 S기에 진입하지 않은 전핵 배아 단계에서 최고조에 달합니다(그림 2). 과배란은 접합체의 수를 최대화하는 데 사용되지만 전핵 접합체와 수정되지 않은 난자를 모두 생성합니다. 건강한 접합체는 또한 전체 효율을 높이기 위해 전기 천공 전에 미리 선택할 수 있습니다. 다른 전기천공 프로토콜이 유사한 단계 7,10,11,12,13,14,15를 포함할 필요 없이 접합체를 효율적으로 편집함에 따라, 이 프로토콜의 선택적 단계는 조나 펠루시다(ZP)의 약간의 침식이다. ZP는 핵 단계 배아를 둘러싼 정자 결합, 선체 반응 및 수정을 돕는 당 단백질 층입니다. 우리의 경험에서, 우리는 ZP의 부드러운 산 기반 침식이 생존력에 미미한 영향으로 신뢰할 수있는 Cas9 RNP 전기 천공 전달을 제공한다는 것을 발견했습니다.
우리는 C57BL/6J 및 C57BL/6N 9,16과 같은 연구에서 일반적으로 사용되는 마우스 균주에서 전기천공을 통해 최대 100% 효율의 RNP 전달 속도를 관찰했습니다. 독립적 인 그룹은 또한 미세 주입 11,12,13,14,15,17보다 크거나 일치하는 효율을 가진 전기 천공 기반 절차를 개발했으며, 전기 천공 프로토콜은 쥐18,19, 돼지 20,21,22 및 소 23에서 잘 작동합니다. 따라서 독자는 프로토콜을 비교하여 실험 및 장비 요구 사항에 가장 적합한 조건을 찾는 것이 좋습니다. 여기에 설명 된 시스템은 일반적인 재료와 장비를 사용하므로 기본적인 배아 조작 기술 만 필요합니다. 이 기술은 다양한 편집 전략에 효과적이므로 연구 커뮤니티에서 이 방법에 광범위하게 액세스할 수 있습니다.
이상적인 소형 가이드 RNA(sgRNA)를 설계하는 것은 효율적인 편집을 위해 필수적입니다. 특히 마우스 라인 생성이 필요한 경우 마우스 배아에서 직접 표적 부위당 2-3개의 sgRNA 전략을 스크리닝하는 것이 좋습니다. 일단 설계되면 고품질 sgRNA를 생산하기 위해 체외 전사(IVT)와 같은 클로닝 없는 방법을 권장합니다3. RNP 및 sgRNA는 30-50개의 처리된 핵 단계 배아와 혼합되고 일련의 전기 펄스에 노출되어 먼저 ZP 및 세포막을 일시적으로 투과화하고, 후속 펄스는 기공을 열린 상태로 유지하고 접합체(24)를 통해 RNP를 전기영동합니다. 최적화 후, 우리는 벌크 배아(~50)에 대해 30V에서 6개의 3ms 펄스가 편집 효율성과 생존력에 최적이며 매우 효율적인 Cas9/sgRNA RNP 전달 9,16,25를 제공한다는 것을 발견했습니다. 개별 마우스 모룰라에서의 편집 이벤트는 제한 단편 길이 다형성 (RFLP), T7 엔도뉴클레아제 소화 및 관심 영역26의 Sanger 시퀀싱과 같은 CRISPR 편집에 공통적인 다양한 검증 전략을 사용하여 확인할 수 있습니다.
현재의 방법은 삽입/삭제(indels), 500-2000bp 정도의 엑손 크기 결실, 점 돌연변이 및 C- 또는 N-말단 태그(예: FLAG, HA 또는 V5)9,16,27과 같은 작은 삽입의 전달과 같은 간단한 편집 체계(그림 3)에 가장 적합합니다. 형광 태그 또는 조건부 대립 유전자의 대규모 삽입과 같은 복잡한 게놈 편집의 가능성은 여전히 불확실하며 향후 개선의 현재 초점입니다.
이 방법은 쉽게 마스터할 수 있으며1주일 만에 배양된 마우스 배아에서 sgRNA를 빠르게 테스트하는 데 사용할 수 있습니다9(그림 1). 이 연구에서는 1) sgRNA 디자인을 포함하는 6 단계 프로토콜이 제시됩니다. 2) sgRNA 합성; 3) 과배란 및 짝짓기; 4) 배아 배양, 수집 및 가공; 5) RNP 조립 및 전기 천공; 6) 배아 배양 및 유전형 분석. 사용 된 모든 재료에 대한 정보가 제공됩니다 (재료 표). 양성 대조군으로서, 티로시나제(Tyr) 유전자좌 9,16을 편집하는 시약이 보충 표 1에 포함되었다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1-cm-gap electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>cat. no. 1652089</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26-G, 1/2-inch needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>cat. no. 305111</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8211;8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>cat. no. 000664</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm Tissue culture dish</td>
			<td>Greiner Bio-One,</td>
			<td>cat. no. 627-160</td>
			<td>Embryo Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-mm Tissue culture dish</td>
			<td>Greiner Bio-One,</td>
			<td>cat. no. 628-160</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x loading dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>cat. no. R0611</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic Tyrode&#39;s (AT) solution, embryo culture grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich,</td>
			<td>cat. no. T1788</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, embryo culture grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. A3311</td>
			<td>Embryo Processing and Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein</td>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS</td>
			<td>cat. no. 1074181</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, RNase-free</td>
			<td>New England BioLabs,</td>
			<td>cat. no. M0303</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS(calcium and magnesium free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>cat. no. 14190-144</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>cat. no. R3101S</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. EDS-100G</td>
			<td>RNP Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>cat. no. V1016</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (powder) type B, laboratory grade</td>
			<td>Fisher,</td>
			<td>cat. no. G7-500</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol,&#160;molecular-biology grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>cat. no. BP229</td>
			<td>RNP Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>cat. no. M712</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, cell culture grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. H4034</td>
			<td>RNP Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HinfI (10,000 U/mL)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>cat. no. R0155S</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td>
			<td>New England BioLabs,</td>
			<td>cat. no. E2040</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorion gonadotropin, lyophilized&#160;(hCG)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. 230734</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase/M2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. MR-051-F</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids)</td>
			<td>Zenith Biotech</td>
			<td>cat. no. ZEKS-050</td>
			<td>Embryo Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE agarose, analytical grade</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>cat. no. E-3120-500</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Zenith Biotech</td>
			<td>cat. no. ZFM2-050</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. M8266</td>
			<td>RNP and Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. ES-005C</td>
			<td>Embryo Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40,substitute (NP-40)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. 74385</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water, molecular-biology grade</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>cat. no. AM9937</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>custom orders</td>
			<td>sgRNA Design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>cat. no. 31985062</td>
			<td>Embryo Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England BioLabs,</td>
			<td>cat. no. M0530</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. P9333</td>
			<td>RNP and Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG)</td>
			<td>ProspecBio</td>
			<td>cat. no. HOR-272</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, molecular-biology grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>cat. no. BP1700-100</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>cat. no. 20170-333</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free eight-well PCR strip tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>cat. no. 82006-606</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic purification beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>cat. no. 65152105050250</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. C4706</td>
			<td>RNP Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>cat. no. T1085</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 molecular-biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. P7949-500</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient genome editing of mice by crispr electroporation of zygotes

탁월한 효율성, 정확성 및 용이성을 갖춘 CRISPR/Cas9 시스템은 세포 배양 및 실험실 동물 실험에서 게놈 편집을 크게 개선했습니다. 동물 모델을 생성할 때 접합체의 전기천공은 미세 주입의 황금 표준 방법의 대안으로 더 높은 효율성, 단순성, 비용 및 처리량을 제공합니다. 전기천공은 또한 더 부드럽고 생존력이 높으며 Cas9/단일 가이드 RNA(sgRNA) 리보핵단백질(RNP)을 100% 전달 효율에 근접하는 일반적인 실험실 마우스 균주(예: C57BL/6J 및 C57BL/6N)의 접합체에 안정적으로 전달합니다. 이 기술은 삽입/결실(indels) 돌연변이, 점 돌연변이, 전체 유전자 또는 엑손의 결실, LoxP 또는 FLAG, HA 또는 V5와 같은 짧은 태그를 삽입하기 위해 100-200bp 범위의 작은 삽입을 가능하게 합니다. 지속적으로 개선되고 있는 한편, 여기에서는 시험관 내 전사, 배아 처리, RNP 조립, 전기천공 및 착상 전 배아의 유전형 분석을 통한 sgRNA 생산을 포함하는 프로토콜에서 CRISPR-EZ의 현재 상태를 제시합니다. 배아 조작 경험이 거의 없는 대학원 수준의 연구원은 이 프로토콜을 사용하여 1주일 이내에 유전자 편집 배아를 얻을 수 있습니다. 여기에서 우리는 마우스 배아와 함께 사용할 수 있는 간단하고 저렴하며 효율적인 고용량 방법을 제공합니다.

이 방법은 효율적인 Cas9/sgRNA RNP 조립을 위해 100μg 이상의 sgRNA(>6,000ng/L 농도에서 20μL)를 생성합니다. 여기에 설명된 일상적인 과배란 방법은 일반적으로 연결된 암컷당 10-20개의 생존 가능한 배아를 생성합니다. 배아 조작과 관련된 취급 오류 및 일반적인 손실로 인해 예상되는 배아의 80%는 수정되고 생존 가능하며 전기천공 후 우수한 상태를 유지합니다. 연구자들이 성공적인 실험을 수행하는 데 ...

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Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes

여기에서는 CRISPR RNP 접합체 전기천공(CRISPR-EZ)이라고 하는 유전자 변형 마우스의 효율적인 생성을 위한 간단한 기술을 설명합니다. 이 방법은 100%에 가까운 효율로 배아에 전기천공을 통해 편집 시약을 전달합니다. 이 프로토콜은 포유류 배아의 점 돌연변이, 작은 게놈 삽입 및 결실에 효과적입니다.

접합체의 CRISPR 전기천공에 의한 마우스의 효율적인 게놈 편집

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal ...

이 방법은 배아의 가이드 RNA를 확인하거나 초기 발달 질문을 테스트하거나 편집 된 마우스를 만들 수 있습니다. CRISPR Cas9의 모든 발전은 이 방법과 함께 사용될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 배우기 쉽고 마우스에 접근 할 수있는 실험실에서 사용할 수있는 시약을 사용한다는 것입니다.앞으로이 기술은 반려 동물이나 농업에 중요한 동물의 자손에서 질병이나 돌연변이를 교정하는 데 유용 할 것입니다. 이 방법은 마우스 모델을 생성하는 데 가장 적합합니다. 우리 연구실에서는 수정 및 조기 착상 전 발달, 특히 배아 효능의 유전자 조절을 둘러싼 사건을 조사하기 위해이 방법의 변형을 사용하고 있습니다.가장 어려운 부분은 유리 바늘을 사용하여 배아를 접시에서 접시로 옮기는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 내 연구실의 연구 전문가 인 Chantal Diallo입니다. 배아 수집 및 처리를 시작하려면 안락사 된 암컷 마우스를 등에 놓고 외과 적으로 열 복부에 70 % 에탄올을 뿌립니다.복강을 열고 난관을 제거하려면 수술 용 가위로 피부층을 자르고 난소를 찾으십시오. 다음으로, 난소 근위에 위치한 두 난관을 외과 적으로 제거하고 M2와 BSA 배지의 개별 50 마이크로 리터 방울에 넣습니다. 실체 현미경에서 해부 겸자를 사용하여 난관의 팽대부에 흠집을 내어 난모세포가 포함된 적운-난모세포 복합체 또는 COC를 방출한 다음 파편의 이월을 방지하기 위해 각 적운-난자를 20-30마이크로리터로 설정된 처리된 피펫으로 M2와 BSA의 단일 50마이크로리터 방울로 옮기고 결합합니다.다음으로, 접합체에서 적운 세포를 제거하려면 약간의 추가 배지로 COC를 100마이크로리터 M2와 히알루로니다아제 방울로 옮기고 배아가 훨씬 작은 적운 세포에서 눈에 띄게 분리될 때까지 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 히알루로니다아제를 희석하고 느슨한 적운 세포를 제거하려면 구강 작동식 피펫을 사용하여 접합체를 신선한 50마이크로리터 M2 플러스 BSA 방울로 옮깁니다. 다음으로, 배아의 zona pellucida를 침식하고 시약 전달을위한 추가적인 물리적 장애물을 줄이기 위해 배아를 60mm 플레이트의 예열 된 100 마이크로 리터 산 Tyrode 또는 AT 용액 방울로 옮깁니다.조나 펠루시다의 30%가 침식될 때까지 실체 현미경으로 접합체를 지속적으로 관찰한 다음 AT를 희석하기 위해 배아를 M2와 BSA의 50마이크로리터 방울 4개를 통과시킵니다. 다음으로, 실체 현미경으로 계산하여 처리 된 배아의 적절한 수를 결정하십시오. 배아를 50 마이크로리터의 환원된 혈청 배지의 두 방울에 통과시켜 BSA를 희석합니다.다음으로, 25-30개의 배아를 환원된 혈청 배지의 10마이크로리터 방울에 입 피펫팅한 다음 휴대용 피펫을 사용하여 10마이크로리터의 리보핵단백질 또는 RNP 복합체를 추가합니다. RNP 복합체에서 점성 글리세롤을 희석하고 10회 또는 혼합물이 더 이상 점도를 나타내지 않을 때까지 피펫팅하여 샘플을 균질화합니다. 다음으로, 20 마이크로리터의 배아와 RNP 혼합물을 기포를 피하면서 0.1센티미터 전기천공 큐벳에 넣은 다음, 편집 시약을 접합체로 전달하기 위해, 30볼트의 구형파 프로토콜을 사용하여 배아를 전기천공하고, 3밀리초 펄스 길이의 4 내지 6펄스, 및 100펄스 간격.다음으로, 큐벳 상단에 50마이크로리터의 M2와 BSA를 추가하여 큐벳에서 배아를 플러시하고 이 혼합물을 플레이트에 부드럽게 피펫팅합니다. 배아 배양을 위해, 20 내지 30개의 접합체를 사전 평형화된 배양 플레이트에서 KSOM 플러스 BSA의 액적 내로 옮기고 배아를 액적으로 이동시킨다. 접시를 섭씨 37도에서 5%이산화탄소, 습도 95%에서 밤새 배양합니다.다음날, 2 세포 배아 만 KSOM과 BSA 혼합물의 신선한 방울로 옮기고 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다. 죽거나 수정되지 않은 배아는 그대로 두거나 버립니다. 유전형 분석을 하기 전에 상복종 배아를 DPBS 두 방울로 세척하여 PCR 반응을 방해할 수 있는 배지 성분을 희석합니다.구강 피펫을 사용하여 개별 배아를 8웰 PCR 스트립의 한 웰로 옮기고 10마이크로리터의 용해 완충액을 추가합니다. 다음으로, 배아를 용해시키기 위해 열 순환기를 섭씨 55도까지 4 시간 동안 프로그래밍 한 다음 섭씨 95도에서 10 분 배양하여 단백질 분해 효소 K를 비활성화합니다. 본 연구에서, 비-상동성 말단 접합 및 상동성 지시 복구를 위한 올리고 디자인 및 유전형 분석 전략을 포함하여, 마우스 티로시나제 유전자좌를 양성 대조군으로 표적화하는 전략의 예가 제시된다.단일 가이드 또는 sgRNA를 전달할 때 RNP의 전달은 C57 검정색 6J 및 C57 검정 6N 마우스 균주에서 최대 100%였으며 삽입 결실 형성은 50 내지 100%에서 발생하고 작은 올리고 기반 대체물은 17%에서 63%까지 이루어졌습니다. 게놈 결실을 엔지니어링할 때 편집 효과는 3%에서 100%까지 다양합니다. 배아는 가능한 한 이상적인 조건에 가깝게 보관해야 하므로 더 빨리 프로토콜이 완료되면 더 좋습니다. 또한 히알루로니다아제와 산성 티로드에 대한 노출을 최소화하십시오. 이 방법은 편집 된 동물을 생성하거나, 이식 또는 임신 생존력을 테스트하거나, 실험을 여러 번 수행하여 농장 전 개발 중에 측정 또는 이미지 및 다양한 메트릭을 수집하는 방법을 설명합니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

차 세포 배양 연구 병아리 망막에 효율적인 유전자 전송 :<em&gt; 전 비켜</em&gt; Electroporation에 접근

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

연구

발생학

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Electroporation에 의한 배아 마우스 달팽이의 Explants의 문화 유전자 전송

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

염색질 레귤레이터 및 미국에서의 게놈 전체의 스냅 샷<em&gt; 아프리카 발톱 개구리</em칩 서열 번호&gt; 태아

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

hiPSC 신경 리니지 특정 올림피아 기자의 효율적인 생성 사용 CRISPR / Cas9 및 Cas9 더블 Nickase 시스템

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

치킨 청각 기관에 유전자 전달에 의한<em&gt; 비켜에서</em&gt; 마이크로 전기

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Threespine 큰가시 고기과에 형질 전환 및 게놈 편집에 대한 미세 주입

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR 중재 손실 함수 분석 소 뇌과 립 세포를 사용 하 여 Utero에서 Electroporation 기반 유전자 이동

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

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게놈을 편집 하 여 초파리 에서 조직 관련 이진 전사 시스템을 생성 하기 위한 효율적인 전략

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

mRNA 전기 포란을 사용하여 조류 배아에서 여러 단백질의 빠르고 효율적인 발현

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

파이어 브라트 Thermobia 국내에서 게놈 편집을위한 계란 미세 주입 및 효율적인 짝짓기

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...