Name: efficient genome editing of mice by crispr electroporation of zygotes
Uploaded: 2022-12-16T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes at JoVE.com

A.J.M. skapte det opprinnelige konseptet som førte til utviklingen av CRISPR-EZ og produserte figurene. C.K.D. samlet og tilpasset de interne og publiserte protokollene for dette aktuelle manuskriptet. A.J.M. støttes av NIH (R00HD096108).

All dyrepleie og bruk i hele denne protokollen fulgte retningslinjene for dyrevelferdsloven, ILAR Guide for Care and Use of Laboratory Animals og fulgte retningslinjene fra AVMA for eutanasi og University of Pennsylvania Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) retningslinjer og retningslinjer. Dyrepleie- og bruksprotokollen ble gjennomgått og godkjent av University of Pennsylvania IACUC for dette prosjektet. Som et spørsmål om overholdelse og forsiktighet, vennligst søk alle nødvendige autorisasjoner fø...

<ol>
	<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+determinants+of+improved+CRISPR+sgRNA+design.">Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design.</a> Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).</li><li>Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR/Cas9+delivery.">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> eLife. 3, 04766 (2014).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CRISPR/HDR-mediated+knock-in+for+mouse+embryonic+stem+cells+and+zygotes.">Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes.</a> Biotechniques. 59 (4), 201-208 (2015).</li><li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li><li>Fujii, W., Onuma, A., Sugiura, K., Naito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+phenotype-expressing+triple-knockout+mice+with+heritable+mutated+alleles+by+the+CRISPR/Cas9+system.">One-step generation of phenotype-expressing triple-knockout mice with heritable mutated alleles by the CRISPR/Cas9 system.</a> Journal of Reproduction and Development. 60 (4), 324-327 (2014).</li><li>Kaneko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+genome+editing+of+rodent+intact+embryos+by+electroporation.">Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation.</a> PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).</li><li>Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaicism+in+CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing.">Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing.</a> Developmental Biology. 445 (2), 156-162 (2019).</li><li>Modzelewski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+mouse+genome+engineering+by+CRISPR-EZ+technology.">Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology.</a> Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).</li><li>Gurumurthy, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+CRISPR-based+germline-genome-engineered+mice+without+ex+vivo+handling+of+zygotes+by+i-GONAD.">Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD.</a> Nature Protocols. 14 (8), 2452-2482 (2019).</li><li>Hur, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+in+mice+by+electroporation+of+Cpf1+ribonucleoproteins.">Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins.</a> Nature Biotechnology. 34 (8), 807-808 (2016).</li><li>Tr&#246;der, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+electroporation+approach+for+efficient+CRISPR/Cas9+genome+editing+in+murine+zygotes.">An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes.</a> PLoS One. 13 (5), 0196891 (2018).</li><li>Qin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR/cas9-mediated+genome+editing+in+mice+by+zygote+electroporation+of+nuclease.">Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease.</a> Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).</li><li>Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+Cas9+protein/sgRNA+into+early+pronuclear+zygotes+generates+non-mosaic+mutants+in+the+mouse.">Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse.</a> Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).</li><li>Teixeira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+mice+zygotes+with+dual+guide+RNA/Cas9+complexes+for+simple+and+efficient+cloning-free+genome+editing.">Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing.</a> Scientific Reports. 8, 474 (2018).</li><li>Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. -. F., Modzelewski, A. J., He, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+mouse+genome+editing+by+CRISPR+ribonucleoprotein+electroporation+of+zygotes.">Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+Cas9+protein+into+mouse+zygotes+through+a+series+of+electroporation+dramatically+increased+the+efficiency+of+model+creation.">Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increased the efficiency of model creation.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).</li><li>Mizuno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-embryo+gene+cassette+knockin+by+CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing+with+adeno-associated+viral+vector.">Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector.</a> iScience. 9, 286-297 (2018).</li><li>Remy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+gene-edited+rats+by+delivery+of+CRISPR/Cas9+protein+and+donor+DNA+into+intact+zygotes+using+electroporation.">Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation.</a> Scientific Reports. 7, 16554 (2017).</li><li>Tanihara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+PDX-1+mutant+porcine+blastocysts+by+introducing+CRISPR/Cas9-system+into+porcine+zygotes+via+electroporation.">Generation of PDX-1 mutant porcine blastocysts by introducing CRISPR/Cas9-system into porcine zygotes via electroporation.</a> Animal Science Journal. 90 (1), 55-61 (2019).</li><li>Zhou, X., Guo, H., Chen, K., Cheng, H., Zhou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+chromosomal+mapping+and+conserved+synteny+of+porcine+Argonaute+family+of+genes.">Identification, chromosomal mapping and conserved synteny of porcine Argonaute family of genes.</a> Genetica. 138 (7), 805-812 (2010).</li><li>Nishio, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+voltage+strength+during+electroporation+on+the+development+and+quality+of+in+vitro-produced+porcine+embryos.">Effects of voltage strength during electroporation on the development and quality of in vitro-produced porcine embryos.</a> Reproduction in Domestic Animals. 53 (2), 313-318 (2018).</li><li>Camargo, L. S. A., Owen, J. R., van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+one-step+knockout+by+electroporation+of+ribonucleoproteins+into+zona-intact+bovine+embryos.">Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos.</a> Frontiers in Genetics. 11, 570069 (2020).</li><li>Escoffre, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+(still+not)+known+of+the+mechanism+by+which+electroporation+mediates+gene+transfer+and+expression+in+cells+and+tissues.">What is (still not) known of the mechanism by which electroporation mediates gene transfer and expression in cells and tissues.</a> Molecular Biotechnology. 41 (3), 286-295 (2009).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-READI:+Efficient+generation+of+knockin+mice+by+CRISPR+RNP+electroporation+and+AAV+donor+infection.">CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection.</a> Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).</li><li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+validation+strategies+for+CRISPR-Cas9+editing.">A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing.</a> Scientific Reports. 8, 888 (2018).</li><li>Modzelewski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse-specific+retrotransposon+drives+a+conserved+Cdk2ap1+isoform+essential+for+development.">A mouse-specific retrotransposon drives a conserved Cdk2ap1 isoform essential for development.</a> Cell. 184 (22), 5541-5558 (2021).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+determinants+of+improved+CRISPR+sgRNA+design.">Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design.</a> Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).</li><li>Sanson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+libraries+for+CRISPR-Cas9+genetic+screens+with+multiple+modalities.">Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities.</a> Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).</li><li>Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+genome+editing+for+single-base+substitutions+using+optimized+ssODNs+with+Cas9-RNPs.">Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs.</a> Scientific Reports. 9, 14811 (2019).</li><li>Duselis, A. R., Vrana, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrieval+of+mouse+oocytes.">Retrieval of mouse oocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (3), e185 (2007).</li><li>Takahashi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GONAD:+Genome-editing+via+oviductal+nucleic+acids+delivery+system:+A+novel+microinjection+independent+genome+engineering+method+in+mice.">GONAD: Genome-editing via oviductal nucleic acids delivery system: A novel microinjection independent genome engineering method in mice.</a> Scientific Reports. 5, 11406 (2015).</li><li>Tu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+Cas9+degradation+reduces+mosaic+mutations+in+non-human+primate+embryos.">Promoting Cas9 degradation reduces mosaic mutations in non-human primate embryos.</a> Scientific Reports. 7, 42081 (2017).</li><li>Aida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning-free+CRISPR/Cas+system+facilitates+functional+cassette+knock-in+in+mice.">Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice.</a> Genome Biology. 16 (1), 87 (2015).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+exon-intron+architecture+variation+of+genes+in+eukaryotic+genomes.">Patterns of exon-intron architecture variation of genes in eukaryotic genomes.</a> BMC Genomics. 10, 47 (2009).</li><li>Quadros, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easi-CRISPR:+a+robust+method+for+one-step+generation+of+mice+carrying+conditional+and+insertion+alleles+using+long+ssDNA+donors+and+CRISPR+ribonucleoproteins.">Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins.</a> Genome Biology. 18, 92 (2017).</li><li>Gurumurthy, C. B., Saunders, T. L., Ohtsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+and+generating+a+mouse+model:+frequently+asked+questions.">Designing and generating a mouse model: frequently asked questions.</a> Journal of Biomedical Research. 35 (2), 76-90 (2021).</li><li>Nakajima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+in+the+knockin+mice+generated+using+the+CRISPR/+Cas+system.">Exome sequencing in the knockin mice generated using the CRISPR/ Cas system.</a> Scientific Reports. 6, 34703 (2016).</li><li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+mutations+are+rare+in+Cas9-modified+mice.">Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice.</a> Nature Methods. 12 (6), 479 (2015).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li></ol>

Presentert her er en enkel og svært effektiv musegenomredigeringsteknologi. Elektroporering kan brukes til å generere modifiserte embryoer i løpet av 1-2 uker (figur 1) og kan produsere redigerte mus innen 6 uker9. Sammenlignet med samtidig utviklede elektroporasjonsbaserte protokoller som leverer RNP 7,10,11,12,13,14,15,17,32, er metoden som beskrevet her konseptuelt lik og gir effektivitet i samme område</sup...

Genomredigering i levende mus har blitt betydelig forenklet og har blitt tilgjengelig og rimeligere siden fremveksten av CRISPR-redigering 1,2,3. Innledende dyreredigeringsforsøk brukte mikroinjeksjon for å levere CRISPR Cas9 mRNA / sgRNA til embryoer i pronukleære stadier 4,5,6. Mens mikroinjeksjon er ganske effektiv, kan mengden praksis som kreves for å mestre det, ikke være hensiktsmessig for praktikanter og studenter, og krever også dyrt utstyr som et beskjedent finansiert laboratorium ikke har råd til. Mikroinjeksjon utføres normalt av ekspertteknikere ved transgene anlegg med tidsplaner og servicepriser som er hastighetsbegrensende for mange forskere. En mer tilgjengelig tilnærming er elektroporering, som har vist seg å være ganske effektiv for levering av CRISPR Cas9 mRNA / sgRNA til pronukleære embryoer7. Ytterligere forbedringer i CRISPR-genomredigerings- og leveringsstrategier antydet at forhåndsmonterte RNP-er som allerede er engasjert med sgRNA, kan være et effektivt middel for å redusere mosaikk8.
Begrunnelsen for utviklingen og bruken av denne protokollen var å omgå mange av begrensningene og hindringene forbundet med mikroinjeksjon. Som navnet antyder, vil en enkel, intern og kostnadseffektiv metode som raskt kan avgjøre om uprøvde sgRNA-design vil være verdt å bruke under et mikroinjeksjonseksperiment, være et veldig praktisk kvalitetskontrolltrinn i første pass (figur 1). Selv om denne metoden ikke kan erstatte mikroinjeksjon for mer komplekse strategier, som å introdusere lange donor-DNA-sekvenser for rekombinasjonsbaserte resultater, er den ideell for mindre komplekse strategier som små delesjoner eller innsettinger og merking av gener. Denne metoden er egnet for forskere med grunnleggende embryomanipulasjonsferdigheter som har enkle redigeringsbehov, ønsker å teste hypotesen sin innen tidsrammen for preimplantasjonsutvikling, eller foretrekker å teste sgRNA i embryoer før de planlegger en avtale med en mikroinjeksjonsspesialist. Her blir redigeringsreagenser forbigående levert inn i embryoer i pronukleære stadier som Cas9 / sgRNA RNP via elektroporering (en serie elektriske pulser) for å maksimere effektiviteten samtidig som mosaikken reduseres8. Ved hjelp av en embryogenotypingsmetode er redigeringsresultater tilgjengelige etter ca. 1 uke9, og reduserer dermed behovet for ulike mikroinjeksjonsapplikasjoner til en betydelig redusert kostnad.
Denne metodens effektivitet topper seg på det pronukleære embryostadiet, når embryoet ennå ikke har smeltet sammen mors og fars pronuclei eller gått inn i S-fase (figur 2). Superovulasjon brukes til å maksimere antall zygoter, men produserer både pronukleære zygoter og ubefruktede egg. Sunn zygoter kan også forhåndsvelges før elektroporering for å øke den totale effektiviteten. Siden andre elektroporasjonsprotokoller effektivt har redigert zygoter uten å måtte inkludere et lignende trinn 7,10,11,12,13,14,15, er et valgfritt trinn i denne protokollen den svake erosjonen av zona pellucida (ZP). ZP er et glykoproteinlag som hjelper spermatozoabinding, akrosomrespons og befruktning rundt embryoer i pronukleære stadier. Etter vår erfaring fant vi ut at en mild syrebasert erosjon av ZP gir pålitelig Cas9 RNP-elektroporasjonslevering med bare en marginal innvirkning på levedyktigheten.
Vi har observert RNP-leveringshastigheter på opptil 100% effektivitet via elektroporering i musestammer som ofte brukes i forskning som C57BL / 6J og C57BL / 6N 9,16. Uavhengige grupper har også utviklet elektroporasjonsbaserte prosedyrer med effektivitet større enn eller matchende mikroinjeksjon 11,12,13,14,15,17, med elektroporasjonsprotokoller som fungerer godt hos rotte18,19, gris 20,21,22 og ku 23 , så vi foreslår at leserne sammenligner protokollene for å finne forholdene som best passer deres eksperimentelle og utstyrsbehov. Systemet beskrevet her bruker vanlige materialer og utstyr, og krever bare grunnleggende embryomanipulasjonsferdigheter. Denne teknikken er effektiv for en rekke redigeringsstrategier, noe som gjør denne metoden bredt tilgjengelig for forskersamfunnet.
Å designe ideelle små guide-RNA (sgRNA) er avgjørende for effektiv redigering. Vi anbefaler screening to til tre sgRNA-strategier per målsted direkte i museembryoer, spesielt hvis muselinjegenerering er ønsket. Når de er designet, anbefales kloningsfrie metoder som in vitro-transkripsjon (IVT) for å produsere sgRNA av høy kvalitet3. RNPene og sgRNAene blandes med 30-50 behandlede pronukleære embryoer og utsettes for en serie elektriske pulser for først midlertidig å permeabilisere ZP og cellemembranen, med påfølgende pulser for å holde porene åpne og elektroforese RNPene gjennom zygote24. Etter optimalisering fant vi ut at seks 3 ms pulser ved 30 V for bulkembryoer (~ 50) var optimale for redigeringseffektivitet og levedyktighet, og ga svært effektiv Cas9 / sgRNA RNP-levering 9,16,25. Redigering av hendelser i individuelle musemorula kan bekreftes ved hjelp av en rekke valideringsstrategier som er vanlige for CRISPR-redigering, for eksempel restriksjonsfragmentlengdepolymorfisme (RFLP), T7 endonukleasefordøyelse og Sanger-sekvensering av interesseområdet26.
Den nåværende metoden er mest hensiktsmessig for enkle redigeringsskjemaer (figur 3), for eksempel innsetting / slettinger (indels), eksonstore slettinger i størrelsesorden 500-2000 bp, og levering av punktmutasjoner og små innsettinger som C- eller N-terminalkoder (f.eks. FLAG, HA eller V5) 9,16,27. Potensialet for kompleks genomredigering, som store innsettinger av fluorescerende koder eller betingede alleler, er fortsatt usikkert og er det nåværende fokuset for kommende forbedringer.
Denne metoden er lett å mestre og kan brukes til raskt å teste sgRNA i dyrkede museembryoer i 1 uke9 (figur 1). Presentert i dette arbeidet er en seks-trinns protokoll, som inkluderer 1) sgRNA-design; 2) sgRNA-syntese; 3) superovulasjon og parring; 4) embryokultur, innsamling og behandling; 5) RNP-montering og elektroporering; 6) embryokultur og genotyping. Informasjon om alle materialene som brukes er gitt (Materialfortegnelse). Som en positiv kontroll er reagenser for å redigere tyrosinase (Tyr) locus 9,16 inkludert i tilleggstabell 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1-cm-gap electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>cat. no. 1652089</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26-G, 1/2-inch needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>cat. no. 305111</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8211;8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>cat. no. 000664</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm Tissue culture dish</td>
			<td>Greiner Bio-One,</td>
			<td>cat. no. 627-160</td>
			<td>Embryo Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-mm Tissue culture dish</td>
			<td>Greiner Bio-One,</td>
			<td>cat. no. 628-160</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x loading dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>cat. no. R0611</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic Tyrode&#39;s (AT) solution, embryo culture grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich,</td>
			<td>cat. no. T1788</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, embryo culture grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. A3311</td>
			<td>Embryo Processing and Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein</td>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS</td>
			<td>cat. no. 1074181</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, RNase-free</td>
			<td>New England BioLabs,</td>
			<td>cat. no. M0303</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS(calcium and magnesium free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>cat. no. 14190-144</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>cat. no. R3101S</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. EDS-100G</td>
			<td>RNP Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>cat. no. V1016</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (powder) type B, laboratory grade</td>
			<td>Fisher,</td>
			<td>cat. no. G7-500</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol,&#160;molecular-biology grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>cat. no. BP229</td>
			<td>RNP Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>cat. no. M712</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, cell culture grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. H4034</td>
			<td>RNP Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HinfI (10,000 U/mL)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>cat. no. R0155S</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td>
			<td>New England BioLabs,</td>
			<td>cat. no. E2040</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorion gonadotropin, lyophilized&#160;(hCG)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. 230734</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase/M2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. MR-051-F</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids)</td>
			<td>Zenith Biotech</td>
			<td>cat. no. ZEKS-050</td>
			<td>Embryo Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE agarose, analytical grade</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>cat. no. E-3120-500</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Zenith Biotech</td>
			<td>cat. no. ZFM2-050</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. M8266</td>
			<td>RNP and Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. ES-005C</td>
			<td>Embryo Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40,substitute (NP-40)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. 74385</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water, molecular-biology grade</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>cat. no. AM9937</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>custom orders</td>
			<td>sgRNA Design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>cat. no. 31985062</td>
			<td>Embryo Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England BioLabs,</td>
			<td>cat. no. M0530</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. P9333</td>
			<td>RNP and Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG)</td>
			<td>ProspecBio</td>
			<td>cat. no. HOR-272</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, molecular-biology grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>cat. no. BP1700-100</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>cat. no. 20170-333</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free eight-well PCR strip tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>cat. no. 82006-606</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic purification beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>cat. no. 65152105050250</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. C4706</td>
			<td>RNP Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>cat. no. T1085</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 molecular-biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. P7949-500</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient genome editing of mice by crispr electroporation of zygotes

Med eksepsjonell effektivitet, nøyaktighet og letthet har CRISPR / Cas9-systemet betydelig forbedret genomredigering i cellekultur og laboratorieforsøk. Ved generering av dyremodeller gir elektroporering av zygoter høyere effektivitet, enkelhet, kostnad og gjennomstrømning som et alternativ til gullstandardmetoden for mikroinjeksjon. Elektroporering er også mildere, med høyere levedyktighet, og leverer pålitelig Cas9 / single-guide RNA (sgRNA) ribonukleoproteiner (RNP) inn i zygotene til vanlige laboratoriemusestammer (f.eks. C57BL / 6J og C57BL / 6N) som nærmer seg 100% leveringseffektivitet. Denne teknikken muliggjør innsetting / sletting (indels) mutasjoner, punktmutasjoner, sletting av hele gener eller eksoner, og små innsettinger i området 100-200 bp for å sette inn LoxP eller korte koder som FLAG, HA eller V5. Mens vi stadig forbedres, presenterer vi her den nåværende tilstanden til CRISPR-EZ i en protokoll som inkluderer sgRNA-produksjon gjennom in vitro-transkripsjon, embryobehandling, RNP-montering, elektroporering og genotyping av preimplantasjonsembryoer. En forsker på høyere nivå med minimal erfaring med å manipulere embryoer kan få genetisk redigerte embryoer på mindre enn 1 uke ved hjelp av denne protokollen. Her tilbyr vi en enkel, billig, effektiv, høykapasitetsmetode som kan brukes med museembryoer.

Denne metoden genererer mer enn 100 μg sgRNA (20 μL ved >6,000 ng / L-konsentrasjon) for effektiv Cas9 / sgRNA RNP-montering. Den rutinemessige superovulasjonsmetoden beskrevet her produserer vanligvis 10-20 levedyktige embryoer per plugget kvinne. På grunn av håndteringsfeil og typiske tap forbundet med embryomanipulasjon, er en forventet 80% av embryoene befruktet, levedyktig og i utmerket stand etter elektroporering. For å hjelpe forskere med å utføre et vellykket eksperiment, har vi gitt et eksempel på strate...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes at JoVE.com

Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes

Her beskriver vi en enkel teknikk beregnet på effektiv generering av genmodifiserte mus kalt CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Denne metoden leverer redigeringsreagenser ved elektroporering til embryoer med en effektivitet som nærmer seg 100%. Denne protokollen er effektiv for punktmutasjoner, små genomiske innsettinger og delesjoner i pattedyrembryoer.

Effektiv genomredigering av mus ved CRISPR-elektroporering av zygoter

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal ...

Denne metoden kan sjekke RNA i embryoer, teste tidlige utviklingsspørsmål eller lage redigerte mus. Eventuelle fremskritt i CRISPR Cas9 kan brukes med denne metoden. Den største fordelen med denne metoden er at den er lett å lære og bruker reagenser som er tilgjengelige for laboratorier som har tilgang til mus.I fremtiden vil denne teknikken være nyttig for å korrigere en sykdom eller mutasjon i avkom av et selskapsdyr eller landbruksviktig dyr. Denne metoden er best egnet for å generere musemodeller. I vårt laboratorium har vi brukt variasjoner av denne metoden for å undersøke hendelsene rundt befruktning og tidlig preimplantasjonsutvikling, spesielt genregulering i embryopotens.Den mest utfordrende delen er å bruke glassnålen til å flytte embryoer fra plate til plate. Demonstrere denne prosedyren vil være Chantal Diallo, en forskningsspesialist i laboratoriet mitt. For å starte embryoinnsamling og behandling, plasser den avlivede kvinnelige musen på ryggen og spray 70% etanol på magen som skal åpnes kirurgisk.For å åpne bukhulen og fjerne oviduktene, kutt hudlaget med kirurgisk saks og finn eggstokkene. Deretter fjerner du kirurgisk begge oviduktene, plassert proksimalt for eggstokkene, og legg dem i individuelle 50 mikroliter dråper M2 pluss BSA-medium. Under et stereomikroskop, bruk disseksjonstangen til å nick ampulla av ovidukten for å frigjøre cumulus-oocyttkompleksene, eller COC, som inneholder oocytter, for å unngå overføring av rusk, overfør og kombiner hver cumulus-oocyt til en enkelt 50-mikroliters dråpe M2 pluss BSA med en håndtert pipette satt til 20 til 30 mikroliter.Deretter, for å fjerne cumulusceller fra zygotene, overfør COCs med litt ekstra media til en dråpe på 100 mikroliter M2 pluss hyaluronidase og bland forsiktig ved pipettering til embryoene er synlig skilt fra de mye mindre cumuluscellene. For å fortynne hyaluronidase og fjerne løse cumulusceller, bruk en munnoperert pipette for å flytte zygotene til en frisk 50-mikroliter M2 pluss BSA-dråpe. Deretter, for å erodere zona pellucida av embryoet og redusere ytterligere fysiske hindringer for reagenslevering, overfør embryoene til en forvarmet 100 mikroliter dråpe syre Tyrode, eller AT-løsning, på en 60 millimeter plate.Observer zygotene kontinuerlig under et stereomikroskop til 30% av zona pellucida er erodert, for deretter å fortynne AT, pass embryoene gjennom fire 50-mikroliters dråper M2 pluss BSA. Deretter bestemmer du et passende antall embryoer som har blitt behandlet ved å telle dem under stereomikroskopet. Fortynn BSA ved å føre embryoene gjennom to dråper på 50 mikroliter redusert serummedium.Deretter munnpipett 25 til 30 embryoer inn i en 10-mikroliters dråpe redusert serummedia, bruk deretter en håndholdt pipette for å legge til 10 mikroliter av ribonukleoproteinet eller RNP-komplekset. Fortynn den viskøse glyserol fra RNP-komplekset og homogeniser prøven ved å pipettere 10 ganger eller til blandingen ikke lenger viser viskositet. Deretter pipetter 20 mikroliter embryo og RNP-blanding til en 0,1 centimeter elektroporasjonskuvette mens du unngår bobler, for deretter å levere redigeringsreagensene i zygoten, elektroporere embryoene ved hjelp av en firkantbølgeprotokoll på 30 volt, 4 til 6 pulser med 3 millisekunder pulslengde og 100 pulsintervaller.Deretter tilsettes 50 mikroliter M2 pluss BSA i toppen av kyvetten for å skylle embryoene fra kyvetten og forsiktig pipette ut denne blandingen på en plate. For embryodyrking, overfør 20 til 30 zygoter til en dråpe KSOM pluss BSA i en pre-likevektskulturplate og flytt embryoene til dråpen. Inkuber platen over natten ved 37 grader Celsius i 5% karbondioksid med 95% fuktighet.Neste dag, overfør bare to-celle embryoer til en fersk dråpe KSOM pluss BSA-blanding og returner platen til inkubatoren. Forlat eller kast de døde eller ubefruktede embryoene. Før genotyping, vask morula blastocystembryoene med to dråper DPBS for å fortynne mediekomponentene som kan forstyrre en PCR-reaksjon.Bruk en munnpipette, overfør individuelle embryoer til en brønn med en 8-brønns PCR-stripe og tilsett 10 mikroliter lysisbuffer. Deretter, for å lyse embryoene, programmer en termisk syklist til 55 grader Celsius i 4 timer, og inaktiver deretter proteinasen K med en 10-minutters inkubasjon ved 95 grader Celsius. I denne studien vises en eksempelstrategi for å målrette musetyrosinase-lokuset som en positiv kontroll, inkludert oligodesign og genotypingsstrategier for ikke-homolog sluttsammenføyning og homologirettet reparasjon.Ved levering av en enkelt guide, eller sgRNA, var leveransen av RNP opp til og med 100% i C57 svart 6J og C57 svart 6N musestammer med innsetting delesjoner dannelse forekommer ved 50 til 100% og små oligobaserte erstatninger fra 17 til 63%Ved engineering genomiske delesjoner, varierer redigeringseffektiviteten fra 3% til 100%Embryoet skal holdes i så nær ideelle forhold som mulig, slik at jo raskere Protokollen er ferdig, jo bedre. Også minimere eksponering for hyaluronidase og syre Tyrode's. Denne metoden beskriver å generere et redigert dyr, teste implantasjon eller svangerskapslevedyktighet, eller utføre eksperimentet flere ganger for å samle målinger eller bilder og ulike beregninger under pre-plantasjeutvikling.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Effektiv Gene Transfer i Chick netthinne for primære cellekulturstudier: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Culture of Embryonale Mus Cochlea eksplanter og Gene Transfer ved Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genome-wide Snapshot av Chromatin regulatorer og statene i<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryoer av Chip-Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer inn i Chicken hørbar Organ av<em&gt; I Ovo</em&gt; Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Mikroinjeksjon for transgenesis og Genome redigering i Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediert tap av funksjon analyse i lillehjernen Granule celler ved hjelp av In Utero Electroporation-baserte genoverføring

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

En effektiv strategi for å generere vev-spesifikke binære transkripsjon systemer i Drosophila av genomet redigering

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Rask og effektiv uttrykk for flere proteiner i avian embryo bruke mRNA electroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Eggmikroinjeksjon og effektiv parring for genomredigering i Firebrat Thermobia domestica

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...