Name: efficient genome editing of mice by crispr electroporation of zygotes
Uploaded: 2022-12-16T13:20:00
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A.J.M. criou o conceito original que levou ao desenvolvimento da CRISPR-EZ e produziu as figuras. C.K.D. compilou e adaptou os protocolos internos e publicados para este manuscrito atual. A.J.M. é suportado pelo NIH (R00HD096108).

Todos os cuidados e uso de animais ao longo deste protocolo aderiram às políticas da Lei de Bem-Estar Animal do Guia ILAR para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e seguiram as diretrizes e políticas da AVMA para eutanásia e do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Pensilvânia (IACUC). O protocolo de cuidado e uso de animais foi revisado e aprovado pela IACUC da Universidade da Pensilvânia para este projeto. Por uma questão de conformidade e cautela, por favor, procure todas as...

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	<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+determinants+of+improved+CRISPR+sgRNA+design.">Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design.</a> Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).</li><li>Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. 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Y. -. F., Modzelewski, A. J., He, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+mouse+genome+editing+by+CRISPR+ribonucleoprotein+electroporation+of+zygotes.">Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+Cas9+protein+into+mouse+zygotes+through+a+series+of+electroporation+dramatically+increased+the+efficiency+of+model+creation.">Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increased the efficiency of model creation.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).</li><li>Mizuno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-embryo+gene+cassette+knockin+by+CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing+with+adeno-associated+viral+vector.">Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector.</a> iScience. 9, 286-297 (2018).</li><li>Remy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+gene-edited+rats+by+delivery+of+CRISPR/Cas9+protein+and+donor+DNA+into+intact+zygotes+using+electroporation.">Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation.</a> Scientific Reports. 7, 16554 (2017).</li><li>Tanihara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+PDX-1+mutant+porcine+blastocysts+by+introducing+CRISPR/Cas9-system+into+porcine+zygotes+via+electroporation.">Generation of PDX-1 mutant porcine blastocysts by introducing CRISPR/Cas9-system into porcine zygotes via electroporation.</a> Animal Science Journal. 90 (1), 55-61 (2019).</li><li>Zhou, X., Guo, H., Chen, K., Cheng, H., Zhou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+chromosomal+mapping+and+conserved+synteny+of+porcine+Argonaute+family+of+genes.">Identification, chromosomal mapping and conserved synteny of porcine Argonaute family of genes.</a> Genetica. 138 (7), 805-812 (2010).</li><li>Nishio, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+voltage+strength+during+electroporation+on+the+development+and+quality+of+in+vitro-produced+porcine+embryos.">Effects of voltage strength during electroporation on the development and quality of in vitro-produced porcine embryos.</a> Reproduction in Domestic Animals. 53 (2), 313-318 (2018).</li><li>Camargo, L. S. A., Owen, J. R., van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+one-step+knockout+by+electroporation+of+ribonucleoproteins+into+zona-intact+bovine+embryos.">Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos.</a> Frontiers in Genetics. 11, 570069 (2020).</li><li>Escoffre, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+(still+not)+known+of+the+mechanism+by+which+electroporation+mediates+gene+transfer+and+expression+in+cells+and+tissues.">What is (still not) known of the mechanism by which electroporation mediates gene transfer and expression in cells and tissues.</a> Molecular Biotechnology. 41 (3), 286-295 (2009).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-READI:+Efficient+generation+of+knockin+mice+by+CRISPR+RNP+electroporation+and+AAV+donor+infection.">CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection.</a> Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).</li><li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse-specific+retrotransposon+drives+a+conserved+Cdk2ap1+isoform+essential+for+development.">A mouse-specific retrotransposon drives a conserved Cdk2ap1 isoform essential for development.</a> Cell. 184 (22), 5541-5558 (2021).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+determinants+of+improved+CRISPR+sgRNA+design.">Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design.</a> Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).</li><li>Sanson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+libraries+for+CRISPR-Cas9+genetic+screens+with+multiple+modalities.">Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities.</a> Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).</li><li>Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+genome+editing+for+single-base+substitutions+using+optimized+ssODNs+with+Cas9-RNPs.">Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs.</a> Scientific Reports. 9, 14811 (2019).</li><li>Duselis, A. R., Vrana, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrieval+of+mouse+oocytes.">Retrieval of mouse oocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (3), e185 (2007).</li><li>Takahashi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GONAD:+Genome-editing+via+oviductal+nucleic+acids+delivery+system:+A+novel+microinjection+independent+genome+engineering+method+in+mice.">GONAD: Genome-editing via oviductal nucleic acids delivery system: A novel microinjection independent genome engineering method in mice.</a> Scientific Reports. 5, 11406 (2015).</li><li>Tu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+Cas9+degradation+reduces+mosaic+mutations+in+non-human+primate+embryos.">Promoting Cas9 degradation reduces mosaic mutations in non-human primate embryos.</a> Scientific Reports. 7, 42081 (2017).</li><li>Aida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning-free+CRISPR/Cas+system+facilitates+functional+cassette+knock-in+in+mice.">Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice.</a> Genome Biology. 16 (1), 87 (2015).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+exon-intron+architecture+variation+of+genes+in+eukaryotic+genomes.">Patterns of exon-intron architecture variation of genes in eukaryotic genomes.</a> BMC Genomics. 10, 47 (2009).</li><li>Quadros, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easi-CRISPR:+a+robust+method+for+one-step+generation+of+mice+carrying+conditional+and+insertion+alleles+using+long+ssDNA+donors+and+CRISPR+ribonucleoproteins.">Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins.</a> Genome Biology. 18, 92 (2017).</li><li>Gurumurthy, C. B., Saunders, T. L., Ohtsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+and+generating+a+mouse+model:+frequently+asked+questions.">Designing and generating a mouse model: frequently asked questions.</a> Journal of Biomedical Research. 35 (2), 76-90 (2021).</li><li>Nakajima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+in+the+knockin+mice+generated+using+the+CRISPR/+Cas+system.">Exome sequencing in the knockin mice generated using the CRISPR/ Cas system.</a> Scientific Reports. 6, 34703 (2016).</li><li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+mutations+are+rare+in+Cas9-modified+mice.">Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice.</a> Nature Methods. 12 (6), 479 (2015).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li></ol>

Apresentamos aqui uma tecnologia de edição de genoma de camundongo direta e altamente eficiente. A eletroporação pode ser usada para gerar embriões modificados em 1-2 semanas (Figura 1) e pode produzir camundongos editados dentro de 6 semanas9. Em comparação com protocolos baseados em eletroporação desenvolvidos contemporaneamente que fornecem RNPs 7,10,11,12,13,14,15,17,32, o método descrito aqui é conceitualmente semelhante e ofere...

A edição do genoma em camundongos vivos foi consideravelmente simplificada e tornou-se acessível e mais acessível desde o surgimento da edição CRISPR 1,2,3. Tentativas iniciais de edição animal utilizaram microinjeção para entregar mRNA/sgRNA CRISPR Cas9 em embriões em estágio pronuclear 4,5,6. Embora a microinjeção seja bastante eficaz, a quantidade de prática necessária para dominá-la totalmente pode não ser apropriada para estagiários e estudantes e também requer equipamentos caros que um laboratório modestamente financiado não pode pagar. A microinjeção é normalmente realizada por técnicos especializados em instalações transgênicas com horários e preços de serviços que limitam a taxa para muitos pesquisadores. Uma abordagem mais acessível é a da eletroporação, que tem se mostrado bastante eficaz para a entrega de mRNA/sgRNA CRISPR Cas9 em embriões em estágio pronuclear7. Outras melhorias nas estratégias de edição e entrega do genoma CRISPR sugeriram que RNPs pré-montados já envolvidos com sgRNAs podem ser um meio eficaz para reduzir o mosaicismo8.
A lógica por trás do desenvolvimento e uso deste protocolo foi ignorar muitas das limitações e obstáculos associados à microinjeção. Como o nome indica, um método fácil, interno e econômico que pudesse determinar rapidamente se os projetos de sgRNA não testados valeriam a pena usar durante um experimento de microinjeção seria uma etapa de controle de qualidade de primeira passagem muito conveniente (Figura 1). Embora esse método não possa substituir a microinjeção por estratégias mais complexas, como a introdução de longas sequências de DNA de doadores para resultados baseados em recombinação, é ideal para estratégias menos complexas, como pequenas deleções ou inserções e genes de marcação. Este método é apropriado para pesquisadores com habilidades básicas de manipulação de embriões que têm necessidades simples de edição, gostariam de testar sua hipótese dentro do período de tempo de desenvolvimento pré-implantacional ou preferem testar sgRNAs em embriões antes de agendar uma consulta com um especialista em microinjeção. Aqui, os reagentes de edição são entregues transitoriamente em embriões de estágio pronuclear como RNPs Cas9/sgRNA via eletroporação (uma série de pulsos elétricos) para maximizar a eficiência enquanto diminui o mosaicismo8. Usando um método de genotipagem embrionária, os resultados da edição estão disponíveis em aproximadamente 1 semana9, reduzindo assim a necessidade de várias aplicações de microinjeção a um custo significativamente reduzido.
A eficácia desse método atinge o pico no estágio embrionário pró-nuclear, quando o embrião ainda não fundiu os pronúcleos materno e paterno ou entrou na fase S (Figura 2). A superovulação é usada para maximizar o número de zigotos, mas produz zigotos pró-nucleares e óvulos não fertilizados. Zigotos saudáveis também podem ser pré-selecionados antes da eletroporação para aumentar a eficiência geral. Como outros protocolos de eletroporação têm editado zigotos de forma eficiente sem a necessidade de incluir uma etapa semelhante7,10,11,12,13,14,15, uma etapa opcional deste protocolo é a ligeira erosão da zona pelúcida (ZP). A ZP é uma camada de glicoproteína que auxilia a ligação dos espermatozoides, a resposta do acrossoma e a fertilização em torno de embriões em estágio pró-nuclear. Em nossa experiência, descobrimos que uma erosão suave à base de ácido do ZP fornece entrega confiável de eletroporação de RNP Cas9 com apenas um impacto marginal na viabilidade.
Observamos taxas de entrega de RNP de até 100% de eficiência via eletroporação em cepas de camundongos que são comumente utilizadas em pesquisas como C57BL/6J e C57BL/6N 9,16. Grupos independentes também desenvolveram procedimentos baseados em eletroporação com eficiências maiores ou correspondentes à microinjeção 11,12,13,14,15,17, com protocolos de eletroporação funcionando bem em ratos 18,19, suínos 20,21,22 e vacas 23 , por isso, sugerimos que os leitores comparem os protocolos para encontrar as condições que melhor se adequam às suas necessidades experimentais e de equipamento. O sistema descrito aqui usa materiais e equipamentos comuns, exigindo apenas habilidades básicas de manipulação de embriões. Esta técnica é eficaz para uma série de estratégias de edição, tornando este método amplamente acessível à comunidade de pesquisa.
Projetar RNAs de guia pequeno ideais (sgRNAs) é essencial para uma edição eficiente. Recomendamos o rastreamento de duas a três estratégias de sgRNA por local-alvo diretamente em embriões de camundongos, especialmente se a geração de linhagem de camundongo for desejada. Uma vez projetados, métodos livres de clonagem, como a transcrição in vitro (IVT) para produzir sgRNAs de alta qualidade, são recomendados3. Os RNPs e sgRNAs são misturados com 30-50 embriões processados em estágio pronuclear e expostos a uma série de pulsos elétricos para primeiro permeabilizar temporariamente o ZP e a membrana celular, com pulsos subsequentes para manter os poros abertos e eletroforese os RNPs através do zigoto24. Após otimização, descobrimos que seis pulsos de 3 ms a 30 V para embriões a granel (~50) foram ótimos para a eficácia e viabilidade da edição, proporcionando uma entrega de RNP Cas9/sgRNA altamente eficiente 9,16,25. Eventos de edição em morula de camundongo individual podem ser confirmados usando uma variedade de estratégias de validação comuns para edição CRISPR, como polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), digestão de endonuclease T7 e sequenciamento de Sanger da região de interesse26.
O método atual é mais apropriado para esquemas de edição simples (Figura 3), como inserção/exclusão (indels), exclusões de tamanho exonário na ordem de 500-2000 pb e a entrega de mutações pontuais e pequenas inserções, como tags C- ou N-Terminal (por exemplo, FLAG, HA ou V5)9,16,27. O potencial para a edição complexa do genoma, como grandes inserções de tags fluorescentes ou alelos condicionais, permanece incerto e é o foco atual das próximas melhorias.
Este método é facilmente dominado e pode ser usado para testar rapidamente sgRNAs em embriões de camundongos cultivados em 1 semana9 (Figura 1). Apresentado neste trabalho é um protocolo de seis etapas, que inclui 1) desenho de sgRNA; 2) síntese de sgRNA; 3) superovulação e acasalamento; 4) cultura, coleta e processamento de embriões; 5) Montagem e eletroporação da RNP; 6) cultura embrionária e genotipagem. Informações sobre todos os materiais utilizados são fornecidas (Tabela de Materiais). Como controle positivo, os reagentes para edição do locus tirosinase (Tyr) 9,16 foram incluídos na Tabela Suplementar 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1-cm-gap electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>cat. no. 1652089</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26-G, 1/2-inch needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>cat. no. 305111</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8211;8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>cat. no. 000664</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm Tissue culture dish</td>
			<td>Greiner Bio-One,</td>
			<td>cat. no. 627-160</td>
			<td>Embryo Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-mm Tissue culture dish</td>
			<td>Greiner Bio-One,</td>
			<td>cat. no. 628-160</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x loading dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>cat. no. R0611</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic Tyrode&#39;s (AT) solution, embryo culture grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich,</td>
			<td>cat. no. T1788</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, embryo culture grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. A3311</td>
			<td>Embryo Processing and Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein</td>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS</td>
			<td>cat. no. 1074181</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, RNase-free</td>
			<td>New England BioLabs,</td>
			<td>cat. no. M0303</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS(calcium and magnesium free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>cat. no. 14190-144</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>cat. no. R3101S</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. EDS-100G</td>
			<td>RNP Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>cat. no. V1016</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (powder) type B, laboratory grade</td>
			<td>Fisher,</td>
			<td>cat. no. G7-500</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol,&#160;molecular-biology grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>cat. no. BP229</td>
			<td>RNP Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>cat. no. M712</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, cell culture grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. H4034</td>
			<td>RNP Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HinfI (10,000 U/mL)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>cat. no. R0155S</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td>
			<td>New England BioLabs,</td>
			<td>cat. no. E2040</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorion gonadotropin, lyophilized&#160;(hCG)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. 230734</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase/M2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. MR-051-F</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids)</td>
			<td>Zenith Biotech</td>
			<td>cat. no. ZEKS-050</td>
			<td>Embryo Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE agarose, analytical grade</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>cat. no. E-3120-500</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Zenith Biotech</td>
			<td>cat. no. ZFM2-050</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. M8266</td>
			<td>RNP and Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. ES-005C</td>
			<td>Embryo Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40,substitute (NP-40)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. 74385</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water, molecular-biology grade</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>cat. no. AM9937</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>custom orders</td>
			<td>sgRNA Design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>cat. no. 31985062</td>
			<td>Embryo Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England BioLabs,</td>
			<td>cat. no. M0530</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. P9333</td>
			<td>RNP and Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG)</td>
			<td>ProspecBio</td>
			<td>cat. no. HOR-272</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, molecular-biology grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>cat. no. BP1700-100</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>cat. no. 20170-333</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free eight-well PCR strip tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>cat. no. 82006-606</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic purification beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>cat. no. 65152105050250</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. C4706</td>
			<td>RNP Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>cat. no. T1085</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 molecular-biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. P7949-500</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient genome editing of mice by crispr electroporation of zygotes

Com eficiência, precisão e facilidade excepcionais, o sistema CRISPR/Cas9 melhorou significativamente a edição do genoma em experimentos de cultura de células e animais de laboratório. Ao gerar modelos animais, a eletroporação de zigotos oferece maior eficiência, simplicidade, custo e rendimento como uma alternativa ao método padrão-ouro de microinjeção. A eletroporação também é mais suave, com maior viabilidade, e fornece de forma confiável as ribonucleoproteínas (RNPs) Cas9/RNA de guia única (sgRNA) nos zigotos de linhagens comuns de camundongos de laboratório (por exemplo, C57BL/6J e C57BL/6N) que se aproximam de 100% de eficiência de entrega. Esta técnica permite a inserção/deleção (indels) mutações, mutações pontuais, a deleção de genes inteiros ou éxons, e pequenas inserções na faixa de 100-200 pb para inserir LoxP ou tags curtas como FLAG, HA ou V5. Embora constantemente aprimorados, aqui apresentamos o estado atual do CRISPR-EZ em um protocolo que inclui a produção de sgRNA através da transcrição in vitro, processamento embrionário , montagem de RNP, eletroporação e genotipagem de embriões pré-implantação. Um pesquisador de nível de pós-graduação com experiência mínima na manipulação de embriões pode obter embriões geneticamente editados em menos de 1 semana usando este protocolo. Aqui, oferecemos um método simples, de baixo custo, eficiente e de alta capacidade que pode ser usado com embriões de camundongos.

Este método gera mais de 100 μg de sgRNA (20 μL a >concentração de 6.000 ng/L) para uma montagem eficiente do RNP Cas9/sgRNA. O método de superovulação de rotina descrito aqui normalmente produz 10-20 embriões viáveis por fêmea entupida. Devido a erros de manuseio e perdas típicas associadas à manipulação embrionária, espera-se que 80% dos embriões sejam fertilizados, viáveis e em excelente condição após a eletroporação. Para ajudar os pesquisadores a executar um experimento bem-sucedido, fornecemo...

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Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes

Aqui, descrevemos uma técnica simples destinada à geração eficiente de camundongos geneticamente modificados chamada CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Este método fornece reagentes de edição por eletroporação em embriões a uma eficiência próxima de 100%. Este protocolo é eficaz para mutações pontuais, pequenas inserções genômicas e deleções em embriões de mamíferos.

Edição Eficiente do Genoma de Camundongos por Eletroporação CRISPR de Zigotos

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal ...

Este método poderia verificar RNAs de guia em embriões, testar questões de desenvolvimento precoce ou criar camundongos editados. Quaisquer avanços no CRISPR Cas9 poderiam ser usados com este método. A principal vantagem deste método é que é fácil de aprender e usa reagentes que estão disponíveis para laboratórios que têm acesso a camundongos.No futuro, esta técnica seria útil para corrigir uma doença ou mutação na prole de um animal de companhia ou animal importante para a agricultura. Esse método é mais adequado para gerar modelos de mouse. Em nosso laboratório, temos usado variações desse método para investigar os eventos que envolvem a fertilização e o desenvolvimento precoce da pré-implantação, especificamente, a regulação gênica na potência embrionária.A parte mais desafiadora é usar a agulha de vidro para mover embriões de placa para placa. Demonstrando este procedimento será Chantal Diallo, uma especialista em pesquisa no meu laboratório. Para iniciar a coleta e o processamento do embrião, coloque a rata eutanasiada de costas e borrife etanol a 70% no abdômen para ser aberto cirurgicamente.Para abrir a cavidade abdominal e remover os ovidutos, corte a camada da pele com uma tesoura cirúrgica e localize os ovários. Em seguida, remova cirurgicamente ambos os ovidutos, localizados proximais aos ovários, e coloque-os em gotículas individuais de 50 microlitros de M2 mais BSA médio. Sob um microscópio estéreo, use pinças de dissecção para cortar a ampola do oviduto para liberar os complexos cumulus-ovócitos, ou COCs, contendo oócitos, em seguida, para evitar o transporte de detritos, transfira e combine cada cumulus-ovócito para uma única gota de 50 microlitros de M2 mais BSA com uma pipeta manipulada ajustada para 20 a 30 microlitros.Em seguida, para remover as células cumulus dos zigotos, transfira COCs com um pouco de meio extra para uma gota de 100 microlitros M2 mais hialuronidase e misture suavemente por pipetagem até que os embriões estejam visivelmente separados das células cumulus muito menores. Para diluir a hialuronidase e eliminar as células cumulus soltas, use uma pipeta operada pela boca para mover os zigotos para uma gota fresca de 50 microlitros M2 mais BSA. Em seguida, para corroer a zona pelúcida do embrião e reduzir os obstáculos físicos adicionais para a entrega de reagentes, transfira os embriões para uma gota pré-aquecida de 100 microlitros de Tyrode, ou solução AT, em uma placa de 60 milímetros.Observe continuamente os zigotos sob um microscópio estéreo até que 30% da zona pelúcida seja erodida e, em seguida, para diluir o AT, passe os embriões através de quatro gotículas de 50 microlitros de M2 mais BSA. Em seguida, determine um número apropriado de embriões que foram processados, contando-os sob o microscópio estéreo. Diluir a BSA passando os embriões através de duas gotículas de 50 microlitros de meio sérico reduzido.Em seguida, pipete bucal de 25 a 30 embriões em uma gota de 10 microlitros de meio sérico reduzido e, em seguida, use uma pipeta portátil para adicionar 10 microlitros do complexo ribonucleoproteína ou RNP. Diluir o glicerol viscoso do complexo RNP e homogeneizar a amostra pipetando 10 vezes ou até que a mistura não apresente mais viscosidade. Em seguida, pipete 20 microlitros de embrião e mistura de RNP em uma cubeta de eletroporação de 0,1 centímetro, evitando bolhas, em seguida, para entregar os reagentes de edição no zigoto, eletroporate os embriões usando um protocolo de onda quadrada de 30 volts, 4 a 6 pulsos com 3 milissegundos de comprimento de pulso e intervalos de pulso de 100.Em seguida, adicione 50 microlitros de M2 mais BSA no topo da cubeta para lavar os embriões da cubeta e pipetar suavemente essa mistura para um prato. Para a cultura de embriões, transfira 20 a 30 zigotos para uma gota de KSOM mais BSA em uma placa de cultura pré-equilibrada e mova os embriões para a gotícula. Incubar a placa durante a noite a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono com 95% de umidade.No dia seguinte, transfira apenas embriões de duas células para uma nova gota de mistura de KSOM mais BSA e devolva a placa à incubadora. Deixe ou descarte os embriões mortos ou não fertilizados. Antes da genotipagem, lave os embriões de blastocisto de mórula com duas gotas de DPBS para diluir os componentes do meio que possam interferir com uma reação de PCR.Usando uma pipeta bucal, transfira embriões individuais para um poço de uma tira de PCR de 8 poços e adicione 10 microlitros de tampão de lise. Em seguida, para lisar os embriões, programe um termociclador a 55 graus Celsius por 4 horas, depois inative a proteinase K com uma incubação de 10 minutos a 95 graus Celsius. Neste estudo, um exemplo de estratégia para atingir o locus tirosinase de camundongo como um controle positivo, incluindo desenhos de oligo e estratégias de genotipagem para junção final não homóloga e reparo direcionado por homologia são mostrados.Ao entregar um único guia, ou sgRNA, a entrega de RNPs foi de até e incluindo 100% nas linhagens de camundongos C57 preto 6J e C57 preto 6N com formação de deleções de inserção ocorrendo em 50 a 100% e pequenas substituições oligo-baseadas variando de 17 a 63%Ao projetar deleções genômicas, a eficácia da edição varia de 3% a 100%O embrião deve ser mantido o mais próximo possível das condições ideais, de modo que quanto mais rápido o protocolo é feito, melhor. Além disso, minimizar a exposição à hialuronidase e Tyrode's ácidos. Este método descreve a geração de um animal editado, o teste de implantação ou viabilidade gestacional, ou a realização do experimento várias vezes para coletar medições ou imagens e várias métricas durante o desenvolvimento pré-plantação.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Transferência de Gene eficiente em retinas pintainho para célula primária Estudos de Cultura: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Eletroporação Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Biologia do Desenvolvimento

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Cultura da embrionárias mouse cocleares explantes e Gene Transferência de Eletroporação

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Snapshot Genome-wide de Reguladores da cromatina e Estados em<em&gt; Xenopus</em&gt; Os embriões por Chip-Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

Geração eficiente de hiPSC Neurais Lineage Repórteres Knockin específica usando o CRISPR / Cas9 e Cas9 Duplo Nickase Sistema

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

A transferência de genes para o frango auditivo órgão por<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-eletroporação

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Microinjeção para Transgénese e Genoma Edição na Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Mediada por CRISPR perda de função de análise no grânulo cerebelar células usando no Utero Electroporation Gene transferência baseada

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Uma estratégia eficiente para gerar sistemas de transcrição binário de tecido-específica em Drosophila editando genoma

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Expressão rápida e eficiente de múltiplas proteínas em embriões aviários usando o mRNA Electroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Microinjeção de Ovos e Acasalamento Eficiente para Edição de Genoma na Thermobia domestica firebrat

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...