Name: efficient genome editing of mice by crispr electroporation of zygotes
Uploaded: 2022-12-16T13:20:00
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A.J.M. creó el concepto original que condujo al desarrollo de CRISPR-EZ y produjo las figuras. C.K.D. compiló y adaptó los protocolos internos y publicados para este manuscrito actual. A.J.M. es compatible con NIH (R00HD096108).

Todo el cuidado y uso de animales a lo largo de este protocolo se adhirió a las políticas de la Ley de Bienestar Animal, la Guía ILAR para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y siguió las pautas de la AVMA para la eutanasia y las pautas y políticas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pensilvania (IACUC). El protocolo de cuidado y uso de animales fue revisado y aprobado por la Universidad de Pensilvania IACUC para este proyecto. Como cuestión de cumplimiento y precauci...

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	<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+determinants+of+improved+CRISPR+sgRNA+design.">Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design.</a> Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).</li><li>Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. 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J., He, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+mouse+genome+editing+by+CRISPR+ribonucleoprotein+electroporation+of+zygotes.">Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+Cas9+protein+into+mouse+zygotes+through+a+series+of+electroporation+dramatically+increased+the+efficiency+of+model+creation.">Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increased the efficiency of model creation.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).</li><li>Mizuno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-embryo+gene+cassette+knockin+by+CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing+with+adeno-associated+viral+vector.">Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector.</a> iScience. 9, 286-297 (2018).</li><li>Remy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+gene-edited+rats+by+delivery+of+CRISPR/Cas9+protein+and+donor+DNA+into+intact+zygotes+using+electroporation.">Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation.</a> Scientific Reports. 7, 16554 (2017).</li><li>Tanihara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+PDX-1+mutant+porcine+blastocysts+by+introducing+CRISPR/Cas9-system+into+porcine+zygotes+via+electroporation.">Generation of PDX-1 mutant porcine blastocysts by introducing CRISPR/Cas9-system into porcine zygotes via electroporation.</a> Animal Science Journal. 90 (1), 55-61 (2019).</li><li>Zhou, X., Guo, H., Chen, K., Cheng, H., Zhou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+chromosomal+mapping+and+conserved+synteny+of+porcine+Argonaute+family+of+genes.">Identification, chromosomal mapping and conserved synteny of porcine Argonaute family of genes.</a> Genetica. 138 (7), 805-812 (2010).</li><li>Nishio, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+voltage+strength+during+electroporation+on+the+development+and+quality+of+in+vitro-produced+porcine+embryos.">Effects of voltage strength during electroporation on the development and quality of in vitro-produced porcine embryos.</a> Reproduction in Domestic Animals. 53 (2), 313-318 (2018).</li><li>Camargo, L. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrieval+of+mouse+oocytes.">Retrieval of mouse oocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (3), e185 (2007).</li><li>Takahashi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GONAD:+Genome-editing+via+oviductal+nucleic+acids+delivery+system:+A+novel+microinjection+independent+genome+engineering+method+in+mice.">GONAD: Genome-editing via oviductal nucleic acids delivery system: A novel microinjection independent genome engineering method in mice.</a> Scientific Reports. 5, 11406 (2015).</li><li>Tu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+Cas9+degradation+reduces+mosaic+mutations+in+non-human+primate+embryos.">Promoting Cas9 degradation reduces mosaic mutations in non-human primate embryos.</a> Scientific Reports. 7, 42081 (2017).</li><li>Aida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning-free+CRISPR/Cas+system+facilitates+functional+cassette+knock-in+in+mice.">Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice.</a> Genome Biology. 16 (1), 87 (2015).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+exon-intron+architecture+variation+of+genes+in+eukaryotic+genomes.">Patterns of exon-intron architecture variation of genes in eukaryotic genomes.</a> BMC Genomics. 10, 47 (2009).</li><li>Quadros, R. 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Aquí se presenta una tecnología de edición del genoma del ratón sencilla y altamente eficiente. La electroporación se puede utilizar para generar embriones modificados en 1-2 semanas (Figura 1) y puede producir ratones editados dentro de las 6 semanas9. En comparación con los protocolos basados en electroporación desarrollados contemporáneamente que entregan RNP 7,10,11,12,13,14,15,17,32, el método descrito aquí es conceptualmente similar y ofrece eficiencia...

La edición del genoma en ratones vivos se ha simplificado considerablemente y se ha vuelto accesible y más asequible desde la aparición de la edición CRISPR 1,2,3. Los intentos iniciales de edición en animales utilizaron microinyección para administrar ARNm/sgRNA de CRISPR Cas9 en embriones en estadio pronuclear 4,5,6. Si bien la microinyección es bastante efectiva, la cantidad de práctica requerida para dominarla completamente podría no ser apropiada para aprendices y estudiantes y también requiere equipos costosos que un laboratorio modestamente financiado no puede pagar. La microinyección normalmente es realizada por técnicos expertos en instalaciones transgénicas con horarios y precios de servicio que limitan la velocidad para muchos investigadores. Un enfoque más accesible es el de la electroporación, que ha demostrado ser bastante eficaz para la entrega de ARNm/sgRNA de CRISPR Cas9 en embriones en estadio pronuclear7. Otras mejoras en las estrategias de edición y entrega del genoma CRISPR sugirieron que las RNP preensambladas que ya están comprometidas con sgRNAs pueden ser un medio eficaz para reducir el mosaicismo8.
La razón detrás del desarrollo y uso de este protocolo fue evitar muchas de las limitaciones y obstáculos asociados con la microinyección. Como su nombre lo indica, un método fácil, interno y rentable que pudiera determinar rápidamente si valdría la pena usar diseños de sgRNA no probados durante un experimento de microinyección sería un paso de control de calidad de primer paso muy conveniente (Figura 1). Si bien este método no puede reemplazar la microinyección para estrategias más complejas, como la introducción de secuencias largas de ADN del donante para resultados basados en la recombinación, es ideal para estrategias menos complejas como pequeñas deleciones o inserciones y etiquetado de genes. Este método es apropiado para investigadores con habilidades básicas de manipulación de embriones que tienen necesidades de edición simples, les gustaría probar su hipótesis dentro del marco de tiempo del desarrollo preimplantacional, o prefieren probar sgRNAs en embriones antes de programar una cita con un especialista en microinyección. Aquí, los reactivos de edición se administran transitoriamente en embriones en etapa pronuclear como RNP Cas9 / sgRNA a través de electroporación (una serie de pulsos eléctricos) para maximizar la eficiencia y disminuir el mosaicismo8. Utilizando un método de genotipado de embriones, los resultados de edición están disponibles en aproximadamente 1 semana9, lo que reduce la necesidad de varias aplicaciones de microinyección a un costo significativamente reducido.
La efectividad de este método alcanza su punto máximo en la etapa embrionaria pronuclear, cuando el embrión aún no ha fusionado los pronúcleos materno y paterno o no ha entrado en fase S (Figura 2). La superovulación se utiliza para maximizar el número de cigotos, pero produce cigotos pronucleares y óvulos no fertilizados. Los cigotos sanos también se pueden preseleccionar antes de la electroporación para aumentar la eficiencia general. Como otros protocolos de electroporación han editado eficientemente cigotos sin necesidad de incluir un paso similar 7,10,11,12,13,14,15, un paso opcional de este protocolo es la ligera erosión de la zona pelúcida (ZP). La ZP es una capa de glicoproteína que ayuda a la unión de los espermatozoides, la respuesta acrosómica y la fertilización que rodea a los embriones en etapa pronuclear. En nuestra experiencia, encontramos que una suave erosión a base de ácido de la ZP proporciona una entrega confiable de electroporación Cas9 RNP con solo un impacto marginal en la viabilidad.
Hemos observado tasas de entrega de RNP de hasta 100% de eficiencia a través de electroporación en cepas de ratón que se utilizan comúnmente en investigaciones como C57BL / 6J y C57BL / 6N 9,16. Grupos independientes también han desarrollado procedimientos basados en electroporación con eficiencias mayores o equivalentes a la microinyección 11,12,13,14,15,17, con protocolos de electroporación que funcionan bien en rata18,19, cerdo 20,21,22 y vaca 23 , por lo que sugerimos que los lectores comparen los protocolos para encontrar las condiciones que mejor se adapten a sus necesidades experimentales y de equipo. El sistema descrito aquí utiliza materiales y equipos comunes, que requieren solo habilidades básicas de manipulación de embriones. Esta técnica es efectiva para una variedad de estrategias de edición, lo que hace que este método sea ampliamente accesible para la comunidad de investigación.
El diseño de ARN guía pequeños ideales (sgRNAs) es esencial para una edición eficiente. Recomendamos cribar de dos a tres estrategias de sgRNA por sitio objetivo directamente en embriones de ratón, especialmente si se desea la generación de línea de ratón. Una vez diseñados, se recomiendan métodos libres de clonación como la transcripción in vitro (IVT) para producir sgRNAs de alta calidad3. Los RNPs y sgRNAs se mezclan con 30-50 embriones procesados en estadio pronuclear y se exponen a una serie de pulsos eléctricos para permeabilizar primero temporalmente la ZP y la membrana celular, con pulsos posteriores para mantener los poros abiertos y electrophorese los RNPs a través del cigoto24. Después de la optimización, encontramos que seis pulsos de 3 ms a 30 V para embriones a granel (~ 50) fueron óptimos para la efectividad y viabilidad de la edición, proporcionando una entrega de Cas9 / sgRNA RNP altamente eficiente 9,16,25. Los eventos de edición en mórulas individuales de ratón pueden confirmarse utilizando una variedad de estrategias de validación comunes para la edición CRISPR, como el polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP), la digestión de endonucleasas T7 y la secuenciación de Sanger de la región de interés26.
El método actual es más apropiado para esquemas de edición simples (Figura 3), como inserciones/deleciones (indeles), deleciones de tamaño de exón del orden de 500-2000 pb, y la entrega de mutaciones puntuales e inserciones pequeñas como etiquetas C- o N-Terminal (por ejemplo, FLAG, HA o V5)9,16,27. El potencial para la edición compleja del genoma, como grandes inserciones de etiquetas fluorescentes o alelos condicionales, sigue siendo incierto y es el foco actual de las próximas mejoras.
Este método se domina fácilmente y se puede utilizar para probar rápidamente sgRNAs en embriones de ratón cultivados en 1 semana9 (Figura 1). En este trabajo se presenta un protocolo de seis pasos, que incluye 1) diseño de sgRNA; 2) síntesis de sgRNA; 3) superovulación y apareamiento; 4) cultivo, recolección y procesamiento de embriones; 5) montaje y electroporación de RNP; 6) cultivo embrionario y genotipado. Se proporciona información sobre todos los materiales utilizados (Tabla de materiales). Como control positivo, los reactivos para editar el locus 9,16 de la tirosinasa (Tyr) se han incluido en la Tabla suplementaria 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1-cm-gap electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>cat. no. 1652089</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26-G, 1/2-inch needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>cat. no. 305111</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8211;8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice</td>
			<td>JAX</td>
			<td>cat. no. 000664</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm Tissue culture dish</td>
			<td>Greiner Bio-One,</td>
			<td>cat. no. 627-160</td>
			<td>Embryo Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-mm Tissue culture dish</td>
			<td>Greiner Bio-One,</td>
			<td>cat. no. 628-160</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x loading dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>cat. no. R0611</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acidic Tyrode&#39;s (AT) solution, embryo culture grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich,</td>
			<td>cat. no. T1788</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, embryo culture grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. A3311</td>
			<td>Embryo Processing and Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein</td>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS</td>
			<td>cat. no. 1074181</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, RNase-free</td>
			<td>New England BioLabs,</td>
			<td>cat. no. M0303</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS(calcium and magnesium free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>cat. no. 14190-144</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>cat. no. R3101S</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. EDS-100G</td>
			<td>RNP Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>cat. no. V1016</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (powder) type B, laboratory grade</td>
			<td>Fisher,</td>
			<td>cat. no. G7-500</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol,&#160;molecular-biology grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>cat. no. BP229</td>
			<td>RNP Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>cat. no. M712</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, cell culture grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. H4034</td>
			<td>RNP Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HinfI (10,000 U/mL)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>cat. no. R0155S</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td>
			<td>New England BioLabs,</td>
			<td>cat. no. E2040</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorion gonadotropin, lyophilized&#160;(hCG)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. 230734</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase/M2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. MR-051-F</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids)</td>
			<td>Zenith Biotech</td>
			<td>cat. no. ZEKS-050</td>
			<td>Embryo Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE agarose, analytical grade</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>cat. no. E-3120-500</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Zenith Biotech</td>
			<td>cat. no. ZFM2-050</td>
			<td>Embryo Processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. M8266</td>
			<td>RNP and Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>cat. no. ES-005C</td>
			<td>Embryo Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40,substitute (NP-40)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. 74385</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water, molecular-biology grade</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>cat. no. AM9937</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>custom orders</td>
			<td>sgRNA Design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>cat. no. 31985062</td>
			<td>Embryo Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England BioLabs,</td>
			<td>cat. no. M0530</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. P9333</td>
			<td>RNP and Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG)</td>
			<td>ProspecBio</td>
			<td>cat. no. HOR-272</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, molecular-biology grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>cat. no. BP1700-100</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>cat. no. 20170-333</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free eight-well PCR strip tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>cat. no. 82006-606</td>
			<td>sgRNA Synthesis and Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic purification beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>cat. no. 65152105050250</td>
			<td>sgRNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. C4706</td>
			<td>RNP Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>cat. no. T1085</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 molecular-biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>cat. no. P7949-500</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient genome editing of mice by crispr electroporation of zygotes

Con una eficiencia, precisión y facilidad excepcionales, el sistema CRISPR / Cas9 ha mejorado significativamente la edición del genoma en cultivos celulares y experimentos con animales de laboratorio. Al generar modelos animales, la electroporación de cigotos ofrece una mayor eficiencia, simplicidad, costo y rendimiento como alternativa al método estándar de microinyección. La electroporación también es más suave, con mayor viabilidad, y suministra de manera confiable ribonucleoproteínas (RNP) Cas9 / ARN de guía única (sgRNA) en los cigotos de cepas comunes de ratones de laboratorio (por ejemplo, C57BL / 6J y C57BL / 6N) que se acerca al 100% de eficiencia de entrega. Esta técnica permite mutaciones de inserción/deleción (indeles), mutaciones puntuales, la deleción de genes enteros o exones, e inserciones pequeñas en el rango de 100-200 pb para insertar LoxP o etiquetas cortas como FLAG, HA o V5. Aunque se mejora constantemente, aquí presentamos el estado actual de CRISPR-EZ en un protocolo que incluye la producción de sgRNA a través de la transcripción in vitro , el procesamiento de embriones, el ensamblaje de RNP, la electroporación y el genotipado de embriones preimplantacionales. Un investigador de posgrado con experiencia mínima en la manipulación de embriones puede obtener embriones genéticamente editados en menos de 1 semana utilizando este protocolo. Aquí, ofrecemos un método sencillo, de bajo costo, eficiente y de alta capacidad que podría usarse con embriones de ratón.

Este método genera más de 100 μg de sgRNA (20 μL a >concentración de 6,000 ng / L) para un ensamblaje eficiente de Cas9 / sgRNA RNP. El método de superovulación de rutina descrito aquí produce típicamente 10-20 embriones viables por hembra tapada. Debido a los errores de manejo y las pérdidas típicas asociadas con la manipulación embrionaria, se espera que el 80% de los embriones sean fertilizados, viables y en excelentes condiciones después de la electroporación. Para ayudar a los investigadores a ejecutar...

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Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes

Aquí, describimos una técnica simple destinada a la generación eficiente de ratones genéticamente modificados llamada CRISPR RNP Electroporación de Cigotos (CRISPR-EZ). Este método proporciona reactivos de edición por electroporación en embriones con una eficiencia cercana al 100%. Este protocolo es efectivo para mutaciones puntuales, pequeñas inserciones genómicas y deleciones en embriones de mamíferos.

Edición eficiente del genoma de ratones mediante electroporación CRISPR de cigotos

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal ...

Este método podría verificar los ARN guía en embriones, probar preguntas tempranas del desarrollo o crear ratones editados. Cualquier avance en CRISPR Cas9 podría usarse con este método. La principal ventaja de este método es que es fácil de aprender y utiliza reactivos que están disponibles para los laboratorios que tienen acceso a ratones.En el futuro, esta técnica sería útil para corregir una enfermedad o mutación en la descendencia de un animal de compañía o animal importante para la agricultura. Este método es el más adecuado para generar modelos de ratón. En nuestro laboratorio, hemos estado utilizando variaciones de este método para investigar los eventos que rodean la fertilización y el desarrollo temprano de la preimplantación, específicamente, la regulación génica en la potencia embrionaria.La parte más desafiante es usar la aguja de vidrio para mover embriones de una placa a otra. Demostrando este procedimiento estará Chantal Diallo, especialista en investigación en mi laboratorio. Para comenzar la recolección y el procesamiento de embriones, coloque el ratón hembra sacrificado en su espalda y rocíe etanol al 70% en el abdomen para abrirlo quirúrgicamente.Para abrir la cavidad abdominal y eliminar los oviductos, corte la capa de piel con tijeras quirúrgicas y localice los ovarios. A continuación, extirpe quirúrgicamente ambos oviductos, ubicados proximales a los ovarios, y colóquelos en gotas individuales de 50 microlitros de M2 más medio BSA. Bajo un microscopio estéreo, use pinzas de disección para cortar la ampolla del oviducto para liberar los complejos cúmulo-ovocitos, o AOC, que contienen ovocitos, luego, para evitar el arrastre de desechos, transfiera y combine cada cúmulo-ovocito a una sola gota de 50 microlitros de M2 más BSA con una pipeta con mango ajustada a 20 a 30 microlitros.A continuación, para eliminar las células cúmulos de los cigotos, transfiera los AOC con un poco de medio adicional a una gota de M2 de 100 microlitros más hialuronidasa y mezcle suavemente con pipeteo hasta que los embriones estén visiblemente separados de las células cúmulos mucho más pequeñas. Para diluir la hialuronidasa y eliminar las células sueltas del cúmulo, use una pipeta operada por la boca para mover los cigotos a una gota fresca M2 de 50 microlitros más BSA. Luego, para erosionar la zona pelúcida del embrión y reducir los obstáculos físicos adicionales para la administración de reactivos, transfiera los embriones a una gota precalentada de 100 microlitros de Tyrode, o solución AT, en una placa de 60 milímetros.Observe continuamente los cigotos bajo un microscopio estereoscópico hasta que se erosione el 30% de la zona pelúcida, luego para diluir el AT, pase los embriones a través de cuatro gotitas de 50 microlitros de M2 más BSA. A continuación, determine un número apropiado de embriones que se han procesado contándolos bajo el microscopio estéreo. Diluir la BSA pasando los embriones a través de dos gotitas de 50 microlitros de medios séricos reducidos.A continuación, pipetear en la boca de 25 a 30 embriones en una gota de 10 microlitros de medios séricos reducidos, luego use una pipeta de mano para agregar 10 microlitros de la ribonucleoproteína o complejo RNP. Diluir el glicerol viscoso del complejo RNP y homogeneizar la muestra pipeteando 10 veces o hasta que la mezcla ya no muestre viscosidad. A continuación, pipetear 20 microlitros de embrión y mezcla de RNP en una cubeta de electroporación de 0,1 centímetros evitando burbujas, luego para administrar los reactivos de edición en el cigoto, electropolar los embriones utilizando un protocolo de onda cuadrada de 30 voltios, 4 a 6 pulsos con una longitud de pulso de 3 milisegundos y 100 intervalos de pulso.A continuación, agregue 50 microlitros de M2 más BSA en la parte superior de la cubeta para enjuagar los embriones de la cubeta y pipetear suavemente esta mezcla en un plato. Para el cultivo de embriones, transfiera de 20 a 30 cigotos a una gota de KSOM más BSA en una placa de cultivo preequilibrada y mueva los embriones a la gota. Incubar la placa durante la noche a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5% con 95% de humedad.Al día siguiente, transfiera solo embriones de dos células a una gota fresca de mezcla de KSOM más BSA y devuelva la placa a la incubadora. Dejar o desechar los embriones muertos o no fecundados. Antes del genotipado, lave los embriones de blastocisto de mórula con dos gotas de DPBS para diluir los componentes del medio que podrían interferir con una reacción de PCR.Usando una pipeta bucal, transfiera embriones individuales a un pocillo de una tira de PCR de 8 pocillos y agregue 10 microlitros de tampón de lisis. A continuación, para lisar los embriones, programe un termociclador a 55 grados centígrados durante 4 horas, luego inactive la proteinasa K con una incubación de 10 minutos a 95 grados centígrados. En este estudio, se muestra una estrategia de ejemplo para apuntar al locus de la tirosinasa del ratón como un control positivo, incluidos los diseños oligo y las estrategias de genotipado para la unión de extremos no homólogos y la reparación dirigida por homología.Al administrar una sola guía, o sgRNA, la administración de RNP fue de hasta e incluyendo el 100% en las cepas de ratón C57 negro 6J y C57 negro 6N con formación de deleciones de inserción que ocurren al 50 a 100% y pequeños reemplazos basados en oligo que van del 17 al 63%. El protocolo está hecho, mejor. Además, minimice la exposición a la hialuronidasa y al ácido Tyrode. Este método describe la generación de un animal editado, la prueba de implantación o la viabilidad gestacional, o la realización del experimento varias veces para recopilar mediciones o imágenes y varias métricas durante el desarrollo previo a la plantación.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Transferencia génica eficaz en polluelo retinas para estudios de cultivo celular primario: Un<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Enfoque electroporación

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Cultura de embriones de ratón explantes cocleares y Gene Transfer por electroporación

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Instantánea de todo el genoma de los Reguladores de la cromatina y los Estados en<em&gt; Xenopus</em&gt; Los embriones por chip-Sec

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

Generación eficiente de hiPSC Neuronales Lineage Reporteros Knockin concreto utilizando la CRISPR / Cas9 y Cas9 Doble Sistema Nickase

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

La transferencia de genes en el pollo auditiva de órgano de<em&gt; En Ovo</em&gt; Micro-electroporación

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

La microinyección de transgénesis y Genoma edición en tres espinas espinosos

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Mediada por CRISPR pérdida de función análisis en gránulo cerebeloso células usando en el útero electroporación basado en la transferencia de genes

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Una estrategia eficiente para la generación de sistemas de transcripción binario tejidos específicos en Drosophila genoma editando

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Expresión rápida y eficiente de múltiples proteínas en embriones aviares utilizando la electroporación de ARNm

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Microinyección de óvulos y apareamiento eficiente para la edición del genoma en la thermobia doméstica de firebrat

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...