Name: a flow cytometry-based cell surface protein binding assay for assessing selectivity and specificity of an anticancer aptamer
Uploaded: 2022-09-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer at JoVE.com

يقر المؤلفون بتمويل SEED من معهد الصحة العقلية والبدنية والترجمة السريرية (IMPACT) ، وبرنامج "زمالة ألفريد ديكين لأبحاث ما بعد الدكتوراه" في جامعة ديكين ، و "منحة برنامج التدريب البحثي للحكومة الأسترالية".

ملاحظة: قبل بدء التجربة ، ارتد معدات الحماية الشخصية ، بما في ذلك معطف المختبر والقفازات والنظارات الواقية. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول المواد والكواشف والمعدات والبرامج المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. المخازن المؤقتة المطلوبة للفحص
<ol><li>قم بإ...

<ol>
	<li>Cancer. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers</a> (2022)</li><li>Liu, J. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+monoclonal+antibody+development+-+Progress,+remaining+challenges+and+future+innovations.">The history of monoclonal antibody development - Progress, remaining challenges and future innovations.</a> Annals of Medicine and Surgery. 3 (4), 113-116 (2014).</li><li>Nakhjavani, M., Shigdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+of+PD-1/PD-L1+axis+modulation+for+the+treatment+of+triple-negative+breast+cancer.">Future of PD-1/PD-L1 axis modulation for the treatment of triple-negative breast cancer.</a> Pharmacological Research. 175, 106019 (2022).</li><li>Bukari, B., Samarasinghe, R. M., Noibanchong, J., Shigdar, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+delivery+of+therapeutics+into+the+brain:+the+potential+of+aptamers+for+targeted+delivery.">Non-invasive delivery of therapeutics into the brain: the potential of aptamers for targeted delivery.</a> Biomedicines. 8 (5), 120 (2020).</li><li>Wu, X., Chen, J., Wu, M., Zhao, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers:+active+targeting+ligands+for+cancer+diagnosis+and+therapy.">Aptamers: active targeting ligands for cancer diagnosis and therapy.</a> Theranostics. 5 (4), 322 (2015).</li><li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aptamer+functionalized+nanocomposite+used+for+prostate+cancer+diagnosis+and+therapy.">The aptamer functionalized nanocomposite used for prostate cancer diagnosis and therapy.</a> Journal of Nanomaterials. 2022, (2022).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+aptamer-based+biomarker+discovery.">Advances in aptamer-based biomarker discovery.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 571 (2021).</li><li>Ashrafuzzaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers+as+both+drugs+and+drug-carriers.">Aptamers as both drugs and drug-carriers.</a> BioMed Research International. 2014, (2014).</li><li>Nakhjavani, M., Samarasinghe, R. M., Shigdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple-negative+breast+cancer+brain+metastasis:+an+update+on+druggable+targets,+current+clinical+trials,+and+future+treatment+options.">Triple-negative breast cancer brain metastasis: an update on druggable targets, current clinical trials, and future treatment options.</a> Drug Discovery Today. , (2022).</li><li>Macdonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+bifunctional+aptamer+targeting+the+transferrin+receptor+and+epithelial+cell+adhesion+molecule+(EpCAM)+for+the+treatment+of+brain+cancer+metastases.">Development of a bifunctional aptamer targeting the transferrin receptor and epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) for the treatment of brain cancer metastases.</a> ACS Chemical Neuroscience. 8 (4), 777-784 (2017).</li><li>Macdonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifunctional+aptamer-doxorubicin+conjugate+crosses+the+blood-brain+barrier+and+selectively+delivers+its+payload+to+EpCAM-positive+tumor+cells.">Bifunctional aptamer-doxorubicin conjugate crosses the blood-brain barrier and selectively delivers its payload to EpCAM-positive tumor cells.</a> Nucleic Acid Therapeutics. 30 (2), 117-128 (2020).</li><li>Shigdar, S., Agnello, L., Fedele, M., Camorani, S., Cerchia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+cancer+cells+by+cell-SELEX:+use+of+aptamers+for+discovery+of+actionable+biomarkers+and+therapeutic+applications+thereof.">Profiling cancer cells by cell-SELEX: use of aptamers for discovery of actionable biomarkers and therapeutic applications thereof.</a> Pharmaceutics. 14 (1), 28 (2021).</li><li>Rahimizadeh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell-specific+aptamers:+recent+advances+and+insight+into+the+selection+procedures.">Development of cell-specific aptamers: recent advances and insight into the selection procedures.</a> Molecules. 22 (12), 2070 (2017).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell-SELEX+technology+and+its+application+in+cancer+diagnosis+and+therapy.">Development of cell-SELEX technology and its application in cancer diagnosis and therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (12), 2079 (2016).</li><li>Shigdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+sensitive+chemical+antibodies+for+diagnosis:+detection+of+low+levels+of+EpCAM+in+breast+cancer.">The use of sensitive chemical antibodies for diagnosis: detection of low levels of EpCAM in breast cancer.</a> PLoS One. 8 (2), 57613 (2013).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+EpCAM+(CD326)+in+prostate+cancer+metastasis+and+progression.">Role of the EpCAM (CD326) in prostate cancer metastasis and progression.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 31 (3), 779-791 (2012).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+adhesion+molecule+(EpCAM)+is+associated+with+prostate+cancer+metastasis+and+chemo/radioresistance+via+the+PI3K/Akt/mTOR+signaling+pathway.">Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) is associated with prostate cancer metastasis and chemo/radioresistance via the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 45 (12), 2736-2748 (2013).</li><li>McKeague, M., Kruse, P. F., Patterson, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tissue Culture. , 395-397 (1973).</li><li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+minimum+aptamer+publication+standards+(MAPS+guidelines)+for+de+novo+aptamer+selection.">The minimum aptamer publication standards (MAPS guidelines) for de novo aptamer selection.</a> Aptamers. 6, 10-18 (2022).</li><li>Schoofs, G., Van Hout, A., D'huys, T., Schols, D., Van Loy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometry-based+assay+to+identify+compounds+that+disrupt+binding+of+fluorescently-labeled+CXC+Chemokine+ligand+12+to+CXC+Chemokine+receptor+4.">A flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled CXC Chemokine ligand 12 to CXC Chemokine receptor 4.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57271 (2018).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+an+overview.">Flow cytometry: an overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120 (1), 1-11 (2018).</li><li>Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+cell+viability+assays.">Guidelines for cell viability assays.</a> Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).</li><li>Ruscito, A., DeRosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+binding+aptamers:+Selection+strategies,+characterization,+and+applications.">Small-molecule binding aptamers: Selection strategies, characterization, and applications.</a> Frontiers in Chemistry. 4, 14 (2016).</li><li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analytical+comparison+of+strategies+used+for+small+molecule+aptamer+evaluation.">Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation.</a> Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).</li><li>Henri, J., Bayat, N., Macdonald, J., Shigdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+using+nucleic+acid+aptamers+in+cell+based+assays.">A guide to using nucleic acid aptamers in cell based assays.</a> Aptamers. 23, (2019).</li><li>Mao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+and+regularity+of+quenching+the+effect+of+bases+on+fluorophores:+the+base-quenched+probe+method.">The mechanism and regularity of quenching the effect of bases on fluorophores: the base-quenched probe method.</a> Analyst. 143 (14), 3292-3301 (2018).</li><li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+in+vitro+aptamer+selection+parameters.">Analysis of in vitro aptamer selection parameters.</a> Journal of Molecular Evolution. 81 (5), 150-161 (2015).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+negative+surface+charges+of+cancer+cells+by+multifunctional+nanoprobes.">Targeting negative surface charges of cancer cells by multifunctional nanoprobes.</a> Theranostics. 6 (11), 1887 (2016).</li><li>Shigdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+aptamers+targeting+cancer+stem+cell+marker+CD133.">RNA aptamers targeting cancer stem cell marker CD133.</a> Cancer Letters. 330 (1), 84-95 (2013).</li><li>Amraee, M., Oloomi, M., Yavari, A., Bouzari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+aptamer+identification+and+characterization+for+E.+coli+O157+detection+using+cell+based+SELEX+method.">DNA aptamer identification and characterization for E. coli O157 detection using cell based SELEX method.</a> Analytical Biochemistry. 536, 36-44 (2017).</li><li>Yu, X. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+and+characterization+of+a+novel+DNA+aptamer,+Apt-07S+specific+to+hepatocellular+carcinoma+cells.">Selection and characterization of a novel DNA aptamer, Apt-07S specific to hepatocellular carcinoma cells.</a> Drug Design, Development and Therapy. 14, 1535 (2020).</li></ol>

يتمثل التحدي الرئيسي في تطوير أبتامرز جديدة في عدم وجود مبادئ توجيهية قياسية تنطبق على خطوات مختلفة من هذه العملية. أظهر McKeague et al. مؤخرا بعض التحديات المرتبطة بها ، والتي تؤدي إلى عروض غير واضحة للبيانات في المنشورات والفشل في تكرار البحث. واقترحوا مبادئ توجيهية أساسية ضرورية للنظر فيها ف?...

لا يزال السرطان أحد الأسباب الرئيسية للوفيات في جميع أنحاء العالم1. على الرغم من التحسن الكبير في علاج السرطان في العقود الأخيرة ، لا يزال تطوير الأدوية المضادة للسرطان موضوعا مثيرا للجدل. وذلك لأن العلاج الكيميائي ، باعتباره الدعامة الأساسية لعلاج السرطان ، يصاحبه آثار جانبية خطيرة تحد من امتثال المريض للعلاج. علاوة على ذلك ، فإن مقاومة السرطان التي يسببها العلاج الكيميائي قد قيدت تطبيقه كخيار وحيد للتدخل الطبي. قدم تطبيق الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAbs) استجابة معززة لعلاجات السرطان2. كان الأساس المنطقي لاستخدام mAbs هو تحسين فعالية العلاج الكيميائي وتقليل ردود الفعل السلبية. ومع ذلك ، أصبحت إدارة mAbs أيضا تحديا. لم يكن هذا فقط بسبب التفاعلات المناعية التي يسببها mAb ولكن أيضا بسبب تكاليف الإنتاج المكلفة التي تعتمد على الحيوانات وظروف التخزين الصعبة3. أثار إدخال aptamers في 1990s4 آمالا جديدة في علاج السرطان ، حيث أن تطبيق aptamers يمكن أن يعالج التحديات المرتبطة ب mAbs.
Aptamers هي تسلسلات قصيرة من الحمض النووي يتم إنتاجها خصيصا لهدف معين. التطور المنهجي للروابط عن طريق التخصيب الأسي (SELEX) هو طريقة شائعة في إنتاج الأبتامير. في SELEX ، يتم تحضين البروتين محل الاهتمام بمكتبة من تسلسلات النوكليوتيدات العشوائية ، ومن خلال سلسلة من الدورات التكرارية ، يتم تنقية الأبتامير المحدد لهذا البروتين. لدى Aptamers انتقائية وخصوصية مستهدفة مماثلة ل mAbs ، وبالتالي فإن تطوير الأدوية في هذا المجال يظهر تطبيقات مستقبلية واعدة. يمكن تطبيق Aptamers الخاصة بالمؤشرات الحيوية للسرطان كأدوية مفردة وأدوات تشخيص السرطان5،6،7. نظرا لهيكلها بحجم النانو ، يمكن أن تعمل هذه الأبتامير أيضا كحاملات أدوية لتوصيل العوامل السامة للخلايا على وجه التحديد إلى الورم8. هذا من شأنه أن يزيد من فعالية توصيل الدواء المستهدف ويقلل من ردود الفعل السلبية المرتبطة بالعلاج الكيميائي وغير المستهدفة. علاوة على ذلك ، تتمتع هذه الأدوية النانوية باختراق كبير للأنسجة ، مما يجعلها مرشحا مرغوبا لتوصيل أدوية الأورام العميقة وعلاجها. يمكن أيضا تصميم Aptamers لاستهداف الناقلات المعبر عنها على الحاجز الدموي الدماغي (BBB) لتحسين توصيل الدواء إلى أورام المخ9. وخير مثال على مثل هذا الأبتامير هو الأبتامير ثنائي الوظيفة ، الذي يستهدف مستقبلات الترانسفيرين (TfR) 10 لتعزيز توصيل الدواء عبر BBB ، وتوصيل حمولة دواء سامة للخلايا إلى الخلايا السرطانية11.
على الرغم من كل مزايا aptamers ، فإن تطوير الأدوية في هذا المجال لم يسفر بعد عن دواء مضاد للسرطان ناجح وناجح. قد يكون أحد أسباب ذلك هو عدم وجود طرق قياسية وقابلة للتكرار يمكن اتباعها عالميا من قبل الباحثين في هذا المجال. في هذه الورقة ، يتم توضيح بروتوكول خطوة بخطوة لارتباط الأبتامير ببروتين أصلي معبر عنه على سطح الخلية. هذا البروتوكول هو خطوة أساسية في التقييم قبل السريري للأبتامير المضادة للسرطان. يتم إجراء الفحص لإظهار انتقائية وخصوصية الأبتامير المنقى الذي تم جمعه من SELEX أو تسلسل أبتامير منشور لتأكيد الانتقائية والنوعية. هذا الفحص القائم على التدفق الخلوي هو اختبار سريع وموثوق وحساس يظهر بدقة انتقائية وخصوصية الأبتامير ، حيث يتم اختبار الأبتامير ضد البروتينات الموجودة على سطح الخلية12،13،14. يتم توضيح هذه الطريقة باستخدام ربط أبتامير خاص ب EpCAM الموضح في هذه الورقة15. يلعب EpCAM ، باعتباره بروتين سكري عبر الغشاء ، أدوارا في إشارات الخلايا السرطانية ، والتقدم ، والهجرة ، وورم خبيث16,17. لإظهار انتقائية وخصوصية هذا الأبتامر ، تم استخدام الخلايا السرطانية الإيجابية والسالبة EpCAM. تم استخدام aptamer الخاص ب EpCAM الذي تم تطويره مسبقا ، TEPP (5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′) ، و aptamer للتحكم السلبي ، TENN (5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3) ، كأبتامير ملزمة وغير ملزمة ل EpCAM ، على التوالي10. تم تمييز الطرف 3 'لكل من TEPP و TENN بفلوروفور TYE665.
TEPP هو أبتامير ثنائي الوظيفة يستهدف EpCAM من طرف و TfR من جهة أخرى. وقد جعل هذا TEPP مرشحا مناسبا لتوصيل الدواء إلى أورام الدماغ EpCAM + . باستخدام نهايته الخاصة ب TfR ، يجتاز TEPP الحاجز الدموي الدماغي ، وباستخدام الطرف الخاص ب EpCAM ، يجد الورم ويسلم حمولته (على سبيل المثال ، الأدوية السامة للخلايا) إلى الورم. TENN له طول مماثل وهيكل 2D مثل TEPP ، ولكن ليس لديه تقارب ل EpCAM أو TfR ، وبالتالي فهو aptamer التحكم السلبي المناسب. باستخدام TEPP و TENN ، يظهر اختبار ارتباط الأبتامير بالبروتين المستهدف باستخدام قياس التدفق الخلوي في هذه الورقة. ينطبق هذا البروتوكول على تطوير aptamers الخاصة بالخلية. كما أنه ينطبق على المزيد من التحليلات التكميلية والتأكيدية لتسلسل الأبتامير المتاح في الأدبيات. يمكن أيضا استخدام البروتوكول من قبل أولئك الجدد في مجال أبتامير الذين يبحثون في استخدام أبتامير منشور مسبقا لأغراض البحث والتطوير (R&D). في هذه الورقة ، تمت دراسة تسلسلين أبتامير متاحين في الأدبيات.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipettes</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>606180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva V9.0</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder</td>
			<td>Sigma-AldrichTM</td>
			<td>A7906-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-line Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12100046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate- Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21300025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo, LLC 10.8.1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td>SFBS-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ACS-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Megafuge 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRM-HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A37834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen- and RNase-free ultrapure water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Cell Culture flask</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>658170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TENN</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5&#8242;-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEPP</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5&#8242;-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer RNA (tRNA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8508-5X1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow cytometry-based cell surface protein binding assay for assessing selectivity and specificity of an anticancer aptamer

يتمثل التحدي الرئيسي في تطوير أبتامير مضاد للسرطان في تحديد انتقائية وخصوصية الأبتامير المطور للبروتين المستهدف بكفاءة. نظرا لمزاياه العديدة على الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ، اكتسب تطوير aptamer شعبية هائلة بين الباحثين في مجال السرطان. التطور المنهجي للروابط عن طريق التخصيب الأسي (SELEX) هو الطريقة الأكثر شيوعا لتطوير أبتامير خاصة بالبروتينات ذات الأهمية. بعد SELEX ، يؤدي فحص الربط السريع والفعال إلى تسريع عملية تحديد الهوية ، مما يؤكد انتقائية وخصوصية aptamer. 
تشرح هذه الورقة مقايسة الربط القائمة على القياس الخلوي للتدفق خطوة بخطوة ل aptamer الخاص بجزيء الالتصاق الخلوي الظهاري (EpCAM). يتم التعبير عن البروتين السكري عبر الغشاء EpCAM بشكل مفرط في معظم السرطانات ويلعب أدوارا في بدء السرطان وتقدمه وورم خبيث. لذلك ، فهو مرشح قيم لتوصيل الدواء المستهدف إلى الأورام. لتقييم انتقائية وخصوصية الأبتامير إلى EpCAM المرتبط بالغشاء ، يلزم وجود خلايا إيجابية وسالبة EpCAM. بالإضافة إلى ذلك ، يلزم وجود أبتامير EpCAM غير ملزم بطول مماثل وبنية ثنائية الأبعاد (2D) ل aptamer المرتبط ب EpCAM. يتضمن فحص الربط مخازن مؤقتة مختلفة (المخزن المؤقت للحظر ، ومخزن الغسيل ، ومخزن الحضانة ، ومخزن FACS) وخطوات الحضانة. 
يتم تحضين الأبتامير مع خطوط الخلية. بعد خطوات الحضانة والغسيل ، سيتم تقييم الخلايا باستخدام اختبار قياس التدفق الخلوي الحساس. يظهر تحليل النتائج ارتباط الأبتامير الخاص ب EpCAM بالخلايا الإيجابية ل EpCAM وليس الخلايا السلبية ل EpCAM. في الخلايا الإيجابية ل EpCAM ، يتم تصوير هذا على أنه تحول في النطاق في ربط EpCAM aptamer إلى اليمين مقارنة بعنصر تحكم aptamer غير الملزم. في الخلايا السالبة ل EpCAM ، تتداخل النطاقات المقابلة من aptamers المرتبطة ب EpCAM وغير الملزمة. يوضح هذا انتقائية وخصوصية أبتامر EpCAM. بينما يركز هذا البروتوكول على أبتامير EpCAM ، فإن البروتوكول ينطبق على الأبتامير المنشورة الأخرى.

يتمثل أحد الجوانب المهمة لاكتشاف الأدوية الجديدة وتطويرها في ضمان انتقائية وخصوصية الدواء المرشح. هذا يعني أن الدواء المرشح يجب أن يكون قادرا على التمييز بين الخلايا المختلفة ويؤثر فقط على عدد الخلايا محل الاهتمام (الانتقائية). تتم دراسة الانتقائية باستخدام خطوط الخلايا التي تختلف من حي?...

Watch this Scientific Journal Video about A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer at JoVE.com

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

الخطوة الضرورية في تطوير أبتامير مضاد للسرطان هي اختبار ارتباطه بالهدف. نعرض مقايسة قائمة على التدفق الخلوي لدراسة هذا الارتباط ، مع التأكيد على أهمية تضمين أبتامير التحكم السلبي والخلايا السرطانية الإيجابية أو السلبية لهذا البروتين المعين.

مقايسة ربط بروتين سطح الخلية القائمة على قياس التدفق الخلوي لتقييم انتقائية وخصوصية أبتامير مضاد للسرطان

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

سيساعد هذا البروتوكول الباحثين الجدد في العمل مع aptamers ليكونوا قادرين على استخدامها في مشاريعهم وأيضا لفهم الخطوات الصغيرة الفردية المطلوبة لإكمال البروتوكول. الأبتامرز متعدد الاستخدامات للغاية ، ويوضح هذا البروتوكول مدى سهولة وبساطة اختبار التنميط المناعي. يمكن استخدام Aptamers لكل من التطبيقات التشخيصية والعلاجية.هذا البروتوكول هو الخطوات الأولى المتخذة لتأكيد خصوصيتها وحساسيتها. في حين أن هذا الفحص الخاص يوضح تلطيخ مستقبل سطح خلية واحدة ، يمكن بسهولة استخدام الأبتامير لقياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات ، مما يوفر مستوى عال من المعرفة المظهرية. تتمثل الجوانب المهمة للعمل مع الأبتامير في ضمان طيها بشكل صحيح قبل الاستخدام ، وكذلك أن ظروف المخزن المؤقت والقوة الأيونية هي نفسها عند اختيارها.بعد جمع الوسائط والتخلص منها في القارورة ، أضف ثلاثة ملليلتر من PBS وانشرها على الخلايا. بعد إضافة ملليلتر واحد من 0.25٪ من Trypsin-EDTA إلى كل قارورة ، احتضن لمدة خمس إلى 10 دقائق عند 37 درجة مئوية وتصور انفصال الخلايا تحت المجهر. بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من الوسط الكامل إلى الخلايا وماصة الخلايا لأعلى ولأسفل لعمل تعليق خلية واحدة.ماصة الخلايا في أنبوب مناسب وأجهزة طرد مركزي في 200 غرام لمدة خمس دقائق. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من الوسط الطازج وعد الخلايا باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق عن طريق تخفيف حجم معين من تعليق الخلية باستخدام التريبان الأزرق. توزيع ما يقرب من 15 ميكرولتر من الخليط بين مقياس الدم وغطاء زجاجي لحساب الخلايا.اجمع العدد المطلوب من الخلايا ، وتأكد من وجود مائة ألف خلية لكل عينة اختبار. ثم احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين للسماح بتثبيت البروتين محل الاهتمام على غشاء الخلية بعد الانفصال الأنزيمي. بعد ساعتين من الحضانة ، قم بطرد الخلايا بالطرد المركزي عند 500 غرام لمدة خمس دقائق.بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحظر. احتضان الخلايا عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة مع الخلط المتقطع. خلال هذه الحضانة التي تستغرق 30 دقيقة ، قم بإجراء طي الأبتامير عن طريق تحضير ضعف تركيزات الأبتامير كما هو موضح في المخطوطة.ثم قم بخلط واحتضان الأبتامير مع آلة التدوير الحراري وفقا لظروف الطي المطلوبة مع ضمان حماية الأبتامير من الضوء. بعد الحضانة لمدة 30 دقيقة ، قم بالطرد المركزي للخلايا كما هو موضح سابقا وإزالة المادة الطافية. ثم أضف ملليلتر واحد من محلول الغسيل والطرد المركزي للخلايا مرة أخرى.بعد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليق الخلايا في حجم مناسب من المخزن المؤقت للربط. بعد ذلك ، ماصة 50 ميكرولتر من الخلايا المعاد تعليقها في كل بئر من الجليد البارد 96 صفيحة سوداء جيدة. ثم ماصة 50 ميكرولتر من الأبتامير على حجم 50 ميكرولتر من الخلايا ، وتخلط وتحتضن في الظلام عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.بعد الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات بعناية في محلول الغسيل ومرة أخرى أجهزة الطرد المركزي عند 500 جم لمدة خمس دقائق. ثم أعد التعليق في 100 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت لتحليل التدفق الخلوي مع تكرار خطوة الغسيل مرتين. أولا ، قم بتشغيل مقياس التدفق الخلوي ثم الكمبيوتر.بعد ذلك ، افتح برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي ، وقم بتسجيل الدخول إلى البرنامج ، وتحت علامة التبويب مقياس الخلايا ، قم بتشغيل بدء تشغيل السوائل. لإنشاء تجربة جديدة، ضمن علامة التبويب تجربة، انقر فوق مجلد جديد، وقم بتسمية تجربة شرطة مائلة للمجلد بشكل مناسب. انقر فوق المجلد الجديد لتمييزه.ثم ضمن علامة التبويب التجربة مرة أخرى، انقر على تجربة جديدة وقم بتسمية التجربة بشكل مناسب. لإضافة عينة الشرطة المائلة الأولى، ضمن علامة التبويب التجربة، انقر فوق عينة جديدة وقم بتسمية العينة بشكل مناسب. لإضافة عينة أنبوب، قم بتمييز العينة وضمن علامة التبويب التجربة، انقر فوق أنبوب جديد.ثم أضف العدد المناسب من الأنابيب والاسم. لإعداد الرسوم البيانية المطلوبة، ضمن علامة تبويب ورقة عمل، افتح ورقة عمل جديدة. بمجرد ظهور نافذة ورقة العمل الجديدة ، قم بإعداد رسم بياني لطخة نقطية للتشتت الجانبي مقابل التشتت الأمامي لتحديد السكان محل الاهتمام.قم بإعداد رسم بياني للبقع النقطية لارتفاع التشتت الأمامي مقابل منطقة التشتت الأمامي لتحديد مجتمع الخلية المفردة. بعد ذلك ، قم بإعداد رسم بياني لعدد الأحداث مقابل الفلوروفور محل الاهتمام. تأكد من أن لوحة معلومات الاستحواذ للتحكم في الحصول على العينة والمفتش ومقياس الخلايا لضبط معلمات الجهد بالإضافة إلى ورقة العمل مع جميع الرسوم البيانية مفتوحة قبل بدء قياس التدفق الخلوي.أولا ، قم بتشغيل الخلايا غير المعالجة. تأكد من أن السهم الذي يشير إلى الأنبوب أخضر. إذا لم يكن هذا السهم أخضر ، فانقر فوق السهم لجعله أخضر.باستخدام ماصة ، انقل كل عينة من اللوحة السوداء 96 إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي. في لوحة معلومات الاستحواذ، اختر عددا مناسبا من الأحداث لتسجيلها، وقم بتغيير معدل التدفق إلى منخفض، وانقر فوق الحصول على البيانات. اضبط الجهد لمعلمات FSC و SCC ، مما يضمن أن عدد الخلايا مركزي داخل مخطط النقاط وأنه لا توجد خلايا تلمس أي من محوري الرسم البياني لتجنب فقدان الخلايا ذات الاهتمام.حدد البوابة الأولى من خلال تحديد واختيار السكان المعنيين في مخطط كثافة مبعثرة أمامية وجانبية مع استبعاد الحطام ، الذي يشكل السكان الذين لديهم أدنى إشارة تشتت أمامية. حدد البوابة الثانية عن طريق استبعاد مجموعات الخلايا المزدوجة ، حيث تؤثر الخلايا المزدوجة بشكل كبير على النتائج والاستنتاجات. قم بزيادة سرعة الاكتساب إلى متوسطة أو عالية لتحليل العينات بشكل أسرع ، ولكن لا تتجاوز أكثر من 200 إلى 300 حدث في الثانية.ثم انقر فوق تسجيل البيانات. بعد ضبط الجهد والبوابات وتسجيل البيانات ، أخرج العينة وانقر فوق Next Tube. أدخل العينة التالية وكرر بيانات التسجيل لجميع عينات التحكم والاختبار.بمجرد جمع جميع البيانات ، اغسل مقياس التدفق الخلوي عن طريق تشغيل ثلاثة أنابيب من المبيض بنسبة 50٪ و FACSRinse والمياه فائقة النقاء ، كل منها لمدة خمس دقائق بمعدل تدفق مرتفع. ثم من القائمة المنسدلة لمقياس الخلايا ، انقر فوق إيقاف تشغيل fluidics. قم بتصدير النتيجة كملفات fsc إلى محرك أقراص USB لنقلها.قم بتحليلها باستخدام برنامج التحليل بالضغط على الزر الجديد لإنشاء مستند جديد ونافذة للتعامل مع التحليل ، واسحب ملفات العينة إلى النافذة الجديدة. انقر نقرا مزدوجا لفتح العينة غير الملوثة. لبوابة مجتمع الخلية المفردة ، اختر مجتمع P1 وانقر نقرا مزدوجا فوق مجتمع P1 لإنشاء رسم بياني FSCH مقابل FSCA.انقر نقرا مزدوجا فوق الخلايا المفردة المسورة لإنشاء مدرج تكراري للأحداث مقابل الفلوروكروم المستخدم. في النافذة الأصلية ، حدد P1 والخلايا المفردة واسحبها إلى جميع العينات بحيث تحتوي جميع العينات الآن على نفس البوابة. بعد ذلك ، انقر فوق زر محرر التخطيط لفتح نافذة التخطيطات واسحب عينتين فوق بعضهما البعض لإنشاء مدرج تكراري متراكب.في خلايا EpCAM الإيجابية MDA-MB-231 ، يظهر تراكب الرسوم البيانية التي تمثل الخلايا المعالجة ب TEPP و TENN أن الخلايا المعالجة ب TEPP يتم إزاحتها إلى اليمين ، مقارنة بالخلايا المعالجة ب TENN مما يدل على أن ارتباط أبتامير TEPP يحدث للبروتين محل الاهتمام. في التحكم السلبي ، لا تعكس خلايا HEK 293T المتراكبة على الرسوم البيانية ل TEPP و TENN أي تحول يشير إلى أنه في خلايا التعبير عن EpCAM TEPP هو أبتامير EpCAM المرتبط بمستقبلاته. علاوة على ذلك ، لم يلاحظ أي ارتباط في الخلايا السلبية EpCAM ، مما يؤكد انتقائية وخصوصية الأبتامير المطور.تأكد من حماية الأبتامير من الضوء ، وخلط الأبتامير والخلايا على اللوحة ، وضبط الفولتية الصحيحة على مقياس التدفق الخلوي. هذا يعتمد بشكل كبير على التطبيقات المستقبلية ل aptamers. على سبيل المثال ، نحن نركز على توصيل الدواء.لذا فإن الخطوة التالية بالنسبة لنا هي تقييم ما إذا كانت الأبتامير داخلية باستخدام المجهر الفلوري. أظهر هذا البروتوكول مدى سهولة استبدال الأبتامير بالأجسام المضادة وحيدة النسيلة ومتعددة النسيلة في مقايسات التنميط المناعي.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization

وهناك طريقة لعزل الخلايا المستهدفة عبر زجاج Functionalization السطحية

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual ...

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

فلوري مثلي نموذج الفأر من سرطان البنكرياس

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

المضادة للسرطان فعالية من العلاج الضوئي مع النانوية المستهدفة السرطان والرئة

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

تدفق المخدرات على أساس الخلوي فحص النظام لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تعزز التمايز الخلوي للخلايا الجذعية جليوبلاستوما

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

هلام ثنائي الأبعاد التفريد مقترنة بأساليب الطيف الكتلي لتحليل البروتين الأنسجة البشرية الورم الحميد الغدة النخامية

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

إيمونوفينوتيبينج من أورثوتوبيك هوموجرافت (سينجينيك) من الفيلق الابتدائي موريني البنكرياس الأقنية غدية بالتدفق الخلوي

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

والرمات التدفق الخلوي مع الخلية الفلورسنت المتوازية لخلية واحدة فقط مما يشير إلى تحليل واكتشاف العلامات البيولوجية

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

الكشف عن الوقت الحقيقي في المختبر ورم الخلايا المبرمج الناجمة عن CD8+ تي الخلايا لدراسة وظائف المناعة القمعية من التسلل إلى ورم الخلايا النقوي

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

سير عمل بسيطة هجرة/غزو تصوير خلية يعيش الآلي باستخدام

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

تقييم صلاحية الخلية والموت في الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...