Name: a flow cytometry-based cell surface protein binding assay for assessing selectivity and specificity of an anticancer aptamer
Uploaded: 2022-09-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer at JoVE.com

Les auteurs reconnaissent le financement SEED de l’Institute for Mental and Physical Health and Clinical Translation (IMPACT), le programme « Alfred Deakin Postdoctoral Research Fellowship » de l’Université Deakin et la « Australian Government Research Training Program Scholarship ».

REMARQUE : Avant de commencer l’expérience, portez un équipement de protection individuelle, y compris une blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de protection. Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur les matériaux, les réactifs, l’équipement et les logiciels utilisés dans ce protocole.
1. Tampons requis pour le test
<ol><li>Préparez les tampons requis pour cette expérience - le tampon SELEX requis pour le pliage d...

<ol>
	<li>Cancer. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers</a> (2022)</li><li>Liu, J. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+monoclonal+antibody+development+-+Progress,+remaining+challenges+and+future+innovations.">The history of monoclonal antibody development - Progress, remaining challenges and future innovations.</a> Annals of Medicine and Surgery. 3 (4), 113-116 (2014).</li><li>Nakhjavani, M., Shigdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+of+PD-1/PD-L1+axis+modulation+for+the+treatment+of+triple-negative+breast+cancer.">Future of PD-1/PD-L1 axis modulation for the treatment of triple-negative breast cancer.</a> Pharmacological Research. 175, 106019 (2022).</li><li>Bukari, B., Samarasinghe, R. M., Noibanchong, J., Shigdar, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+delivery+of+therapeutics+into+the+brain:+the+potential+of+aptamers+for+targeted+delivery.">Non-invasive delivery of therapeutics into the brain: the potential of aptamers for targeted delivery.</a> Biomedicines. 8 (5), 120 (2020).</li><li>Wu, X., Chen, J., Wu, M., Zhao, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers:+active+targeting+ligands+for+cancer+diagnosis+and+therapy.">Aptamers: active targeting ligands for cancer diagnosis and therapy.</a> Theranostics. 5 (4), 322 (2015).</li><li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aptamer+functionalized+nanocomposite+used+for+prostate+cancer+diagnosis+and+therapy.">The aptamer functionalized nanocomposite used for prostate cancer diagnosis and therapy.</a> Journal of Nanomaterials. 2022, (2022).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+aptamer-based+biomarker+discovery.">Advances in aptamer-based biomarker discovery.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 571 (2021).</li><li>Ashrafuzzaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers+as+both+drugs+and+drug-carriers.">Aptamers as both drugs and drug-carriers.</a> BioMed Research International. 2014, (2014).</li><li>Nakhjavani, M., Samarasinghe, R. M., Shigdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple-negative+breast+cancer+brain+metastasis:+an+update+on+druggable+targets,+current+clinical+trials,+and+future+treatment+options.">Triple-negative breast cancer brain metastasis: an update on druggable targets, current clinical trials, and future treatment options.</a> Drug Discovery Today. , (2022).</li><li>Macdonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+bifunctional+aptamer+targeting+the+transferrin+receptor+and+epithelial+cell+adhesion+molecule+(EpCAM)+for+the+treatment+of+brain+cancer+metastases.">Development of a bifunctional aptamer targeting the transferrin receptor and epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) for the treatment of brain cancer metastases.</a> ACS Chemical Neuroscience. 8 (4), 777-784 (2017).</li><li>Macdonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifunctional+aptamer-doxorubicin+conjugate+crosses+the+blood-brain+barrier+and+selectively+delivers+its+payload+to+EpCAM-positive+tumor+cells.">Bifunctional aptamer-doxorubicin conjugate crosses the blood-brain barrier and selectively delivers its payload to EpCAM-positive tumor cells.</a> Nucleic Acid Therapeutics. 30 (2), 117-128 (2020).</li><li>Shigdar, S., Agnello, L., Fedele, M., Camorani, S., Cerchia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+cancer+cells+by+cell-SELEX:+use+of+aptamers+for+discovery+of+actionable+biomarkers+and+therapeutic+applications+thereof.">Profiling cancer cells by cell-SELEX: use of aptamers for discovery of actionable biomarkers and therapeutic applications thereof.</a> Pharmaceutics. 14 (1), 28 (2021).</li><li>Rahimizadeh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell-specific+aptamers:+recent+advances+and+insight+into+the+selection+procedures.">Development of cell-specific aptamers: recent advances and insight into the selection procedures.</a> Molecules. 22 (12), 2070 (2017).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell-SELEX+technology+and+its+application+in+cancer+diagnosis+and+therapy.">Development of cell-SELEX technology and its application in cancer diagnosis and therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (12), 2079 (2016).</li><li>Shigdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+sensitive+chemical+antibodies+for+diagnosis:+detection+of+low+levels+of+EpCAM+in+breast+cancer.">The use of sensitive chemical antibodies for diagnosis: detection of low levels of EpCAM in breast cancer.</a> PLoS One. 8 (2), 57613 (2013).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+EpCAM+(CD326)+in+prostate+cancer+metastasis+and+progression.">Role of the EpCAM (CD326) in prostate cancer metastasis and progression.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 31 (3), 779-791 (2012).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+adhesion+molecule+(EpCAM)+is+associated+with+prostate+cancer+metastasis+and+chemo/radioresistance+via+the+PI3K/Akt/mTOR+signaling+pathway.">Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) is associated with prostate cancer metastasis and chemo/radioresistance via the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 45 (12), 2736-2748 (2013).</li><li>McKeague, M., Kruse, P. F., Patterson, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tissue Culture. , 395-397 (1973).</li><li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+minimum+aptamer+publication+standards+(MAPS+guidelines)+for+de+novo+aptamer+selection.">The minimum aptamer publication standards (MAPS guidelines) for de novo aptamer selection.</a> Aptamers. 6, 10-18 (2022).</li><li>Schoofs, G., Van Hout, A., D'huys, T., Schols, D., Van Loy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometry-based+assay+to+identify+compounds+that+disrupt+binding+of+fluorescently-labeled+CXC+Chemokine+ligand+12+to+CXC+Chemokine+receptor+4.">A flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled CXC Chemokine ligand 12 to CXC Chemokine receptor 4.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57271 (2018).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+an+overview.">Flow cytometry: an overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120 (1), 1-11 (2018).</li><li>Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+cell+viability+assays.">Guidelines for cell viability assays.</a> Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).</li><li>Ruscito, A., DeRosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+binding+aptamers:+Selection+strategies,+characterization,+and+applications.">Small-molecule binding aptamers: Selection strategies, characterization, and applications.</a> Frontiers in Chemistry. 4, 14 (2016).</li><li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analytical+comparison+of+strategies+used+for+small+molecule+aptamer+evaluation.">Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation.</a> Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).</li><li>Henri, J., Bayat, N., Macdonald, J., Shigdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+using+nucleic+acid+aptamers+in+cell+based+assays.">A guide to using nucleic acid aptamers in cell based assays.</a> Aptamers. 23, (2019).</li><li>Mao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+and+regularity+of+quenching+the+effect+of+bases+on+fluorophores:+the+base-quenched+probe+method.">The mechanism and regularity of quenching the effect of bases on fluorophores: the base-quenched probe method.</a> Analyst. 143 (14), 3292-3301 (2018).</li><li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+in+vitro+aptamer+selection+parameters.">Analysis of in vitro aptamer selection parameters.</a> Journal of Molecular Evolution. 81 (5), 150-161 (2015).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+negative+surface+charges+of+cancer+cells+by+multifunctional+nanoprobes.">Targeting negative surface charges of cancer cells by multifunctional nanoprobes.</a> Theranostics. 6 (11), 1887 (2016).</li><li>Shigdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+aptamers+targeting+cancer+stem+cell+marker+CD133.">RNA aptamers targeting cancer stem cell marker CD133.</a> Cancer Letters. 330 (1), 84-95 (2013).</li><li>Amraee, M., Oloomi, M., Yavari, A., Bouzari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+aptamer+identification+and+characterization+for+E.+coli+O157+detection+using+cell+based+SELEX+method.">DNA aptamer identification and characterization for E. coli O157 detection using cell based SELEX method.</a> Analytical Biochemistry. 536, 36-44 (2017).</li><li>Yu, X. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+and+characterization+of+a+novel+DNA+aptamer,+Apt-07S+specific+to+hepatocellular+carcinoma+cells.">Selection and characterization of a novel DNA aptamer, Apt-07S specific to hepatocellular carcinoma cells.</a> Drug Design, Development and Therapy. 14, 1535 (2020).</li></ol>

Le principal défi avec le développement de nouveaux aptamères est l’absence de lignes directrices standard qui s’appliquent aux différentes étapes de ce processus. McKeague et coll. ont récemment démontré certains des défis connexes, qui mènent à des présentations peu claires des données dans les publications et à l’échec de la reproduction de la recherche. Ils ont proposé des lignes directrices fondamentales nécessaires à la caractérisation des aptamères19. Un test de li...

Le cancer reste l’une des principales causes de mortalité dans le monde1. Malgré l’amélioration significative du traitement du cancer au cours des dernières décennies, le développement de médicaments anticancéreux est toujours un sujet très débattu. En effet, la chimiothérapie, en tant que pilier du traitement du cancer, s’accompagne d’effets secondaires graves qui limitent l’observance du traitement par le patient. De plus, la résistance du cancer induite par la chimiothérapie au traitement a limité son application en tant que seul choix d’intervention médicale. L’application d’anticorps monoclonaux (mAbs) a introduit une réponse accrue aux traitements contre le cancer2. La raison d’être de l’utilisation des AcM était d’améliorer l’efficacité des agents chimiothérapeutiques et de minimiser leurs effets indésirables. Cependant, l’administration des AcM est également devenue un défi. Cela n’était pas seulement dû aux réactions immunologiques induites par AcM, mais aussi aux coûts de production élevés et dépendants des animaux et aux conditions de stockagedifficiles 3. L’introduction des aptamères dans les années 19904 a suscité de nouveaux espoirs dans le traitement du cancer, car l’application des aptamères pourrait relever les défis associés aux mAbs.
Les aptamères sont de courtes séquences d’acides nucléiques qui sont spécifiquement produites pour une certaine cible. L’évolution systématique des ligands par enrichissement exponentiel (SELEX) est une méthode courante dans la production d’aptamères. Dans SELEX, la protéine d’intérêt est incubée avec une bibliothèque de séquences nucléotidiques aléatoires, et à travers une série de cycles itératifs, l’aptamère spécifique à cette protéine est purifié. Les aptamères ont une sélectivité et une spécificité de cible similaires à celles des mAb, et par conséquent, le développement de médicaments dans ce domaine montre des applications futures prometteuses. Les aptamères spécifiques aux biomarqueurs du cancer pourraient être appliqués comme médicaments uniques et outils de diagnostic du cancer 5,6,7. En raison de leur structure nanométrique, ces aptamères pourraient également agir comme porteurs de médicaments pour délivrer des agents cytotoxiques spécifiquement à la tumeur8. Cela augmenterait l’efficacité de l’administration ciblée de médicaments et diminuerait les effets indésirables non ciblés associés à la chimiothérapie. De plus, ces nanomédicaments ont une pénétration tissulaire élevée, ce qui en fait un candidat souhaitable pour l’administration et le traitement de médicaments contre les tumeurs profondes. Les aptamères peuvent également être conçus pour cibler les transporteurs exprimés sur la barrière hémato-encéphalique (BHE) afin d’améliorer l’administration de médicaments aux tumeurs cérébrales9. Un bon exemple d’un tel aptamère sont les aptamères bifonctionnels, ciblant le récepteur de la transferrine (TfR)10 pour améliorer l’administration de médicaments à travers la BHE, et délivrant une charge utile de médicament cytotoxique aux cellules tumorales11.
Malgré tous les avantages des aptamères, le développement de médicaments dans ce domaine n’a pas encore produit de médicament anticancéreux commercialisé et efficace. L’une des raisons pourrait être le manque de méthodes standard et reproductibles qui pourraient être suivies à l’échelle mondiale par les chercheurs dans le domaine. Dans cet article, un protocole étape par étape d’un aptamère se liant à une protéine native exprimée à la surface de la cellule est démontré. Ce protocole est une étape préalable à l’évaluation préclinique des aptamères anticancéreux. Le test est effectué pour montrer la sélectivité et la spécificité de l’aptamère purifié recueilli à partir de SELEX ou d’une séquence d’aptamères publiée pour confirmer la sélectivité et la spécificité. Ce test basé sur la cytométrie en flux est un test rapide, fiable et sensible qui montre avec précision la sélectivité et la spécificité de l’aptamère, où l’aptamère est testé contre les protéines à la surface de la cellule12,13,14. Cette méthode est démontrée à l’aide de la liaison d’un aptamère spécifique à l’EpCAM illustrée dans cet article15. EpCAM, en tant que glycoprotéine transmembranaire, joue un rôle dans la signalisation, la progression, la migration et les métastases des cellules tumorales16,17. Pour montrer la sélectivité et la spécificité de cet aptamère, des cellules cancéreuses EpCAM positives et négatives ont été utilisées. L’aptamère spécifique à l’EpCAM développé précédemment, TEPP (5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′), et un aptamère témoin négatif, TENN (5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3), ont été utilisés comme aptamères de liaison et non liant EpCAM, respectivement10. L’extrémité 3' du TEPP et du TENN a été marquée avec un fluorophore TYE665.
TEPP est un aptamère bifonctionnel qui cible EpCAM d’une extrémité et TfR de l’autre. Cela a fait de TEPP un candidat approprié pour l’administration de médicaments aux tumeurs cérébrales EpCAM+ . À l’aide de son extrémité spécifique au TfR, le TEPP traverse la barrière hémato-encéphalique et, à l’aide de l’extrémité spécifique à l’EpCAM, trouve la tumeur et délivre sa cargaison (par exemple, les médicaments cytotoxiques) à la tumeur. TENN a une longueur et une structure 2D similaires à celles du TEPP, mais il n’a pas d’affinité pour l’EpCAM ou le TfR, et est donc un aptamère de contrôle négatif approprié. À l’aide de TEPP et de TENN, le test de la liaison d’un aptamère à la protéine cible à l’aide de la cytométrie en flux est présenté dans cet article. Ce protocole s’applique au développement d’aptamères spécifiques aux cellules. Elle est également applicable à d’autres analyses complémentaires et de confirmation des séquences d’aptamères disponibles dans la littérature. Le protocole peut également être utilisé par les nouveaux arrivants dans le domaine des aptamères qui envisagent d’utiliser un aptamère déjà publié à des fins de recherche et développement (R & D). Dans cet article, deux séquences d’aptamères disponibles dans la littérature sont étudiées.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipettes</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>606180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva V9.0</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder</td>
			<td>Sigma-AldrichTM</td>
			<td>A7906-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-line Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12100046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate- Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21300025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo, LLC 10.8.1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td>SFBS-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ACS-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Megafuge 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRM-HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A37834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen- and RNase-free ultrapure water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Cell Culture flask</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>658170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TENN</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5&#8242;-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEPP</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5&#8242;-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer RNA (tRNA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8508-5X1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow cytometry-based cell surface protein binding assay for assessing selectivity and specificity of an anticancer aptamer

Un défi clé dans le développement d’un aptamère anticancéreux est de déterminer efficacement la sélectivité et la spécificité de l’aptamère développé par rapport à la protéine cible. En raison de ses nombreux avantages par rapport aux anticorps monoclonaux, le développement d’aptamères a acquis une énorme popularité parmi les chercheurs sur le cancer. L’évolution systématique des ligands par enrichissement exponentiel (SELEX) est la méthode la plus courante de développement d’aptamères spécifiques aux protéines d’intérêt. Suite à SELEX, un test de liaison rapide et efficace accélère le processus d’identification, confirmant la sélectivité et la spécificité de l’aptamère. 
Cet article explique un test de liaison étape par étape basé sur la cytométrie en flux d’un aptamère spécifique de la molécule d’adhésion cellulaire épithéliale (EpCAM). La glycoprotéine transmembranaire EpCAM est surexprimée dans la plupart des carcinomes et joue un rôle dans l’initiation, la progression et les métastases du cancer. Par conséquent, c’est un candidat précieux pour l’administration ciblée de médicaments aux tumeurs. Pour évaluer la sélectivité et la spécificité de l’aptamère à l’EpCAM lié à la membrane, des cellules EpCAM positives et négatives sont nécessaires. En outre, un aptamère EpCAM non contraignant avec une longueur et une structure 2 dimensions (2D) similaires à l’aptamère de liaison EpCAM est requis. Le test de liaison comprend différents tampons (tampon de blocage, tampon de lavage, tampon d’incubation et tampon FACS) et étapes d’incubation. 
L’aptamère est incubé avec les lignées cellulaires. Après les étapes d’incubation et de lavage, les cellules seront évaluées à l’aide d’un test de cytométrie en flux sensible. L’analyse des résultats montre la liaison de l’aptamère spécifique à EpCAM aux cellules EpCAM positives et non aux cellules EpCAM négatives. Dans les cellules EpCAM positives, cela est représenté comme un décalage de bande dans la liaison de l’aptamère EpCAM vers la droite par rapport au contrôle de l’aptamère non liant. Dans les cellules EpCAM négatives, les bandes correspondantes d’aptamères liant et non liant EpCAM se chevauchent. Cela démontre la sélectivité et la spécificité de l’aptamère EpCAM. Bien que ce protocole soit axé sur l’aptamère EpCAM, il est applicable à d’autres aptamères publiés.

Un aspect important de la découverte et du développement de nouveaux médicaments est d’assurer la sélectivité et la spécificité du candidat médicament. Cela signifie que le candidat médicament devrait être capable de discriminer entre différentes cellules et n’affecter que la population cellulaire d’intérêt (sélectivité). La sélectivité est étudiée à l’aide de lignées cellulaires qui diffèrent en termes d’expression de la protéine d’intérêt. Dans cette étude, les lignées cellulaires...

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A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

Une étape nécessaire dans le développement d’aptamères anticancéreux est de tester sa liaison à la cible. Nous démontrons un test basé sur la cytométrie en flux pour étudier cette liaison, en soulignant l’importance d’inclure un aptamère témoin négatif et des cellules cancéreuses positives ou négatives pour cette protéine particulière.

Essai de liaison à une protéine de surface cellulaire basé sur la cytométrie en flux pour évaluer la sélectivité et la spécificité d’un aptamère anticancéreux

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

Ce protocole aidera les chercheurs qui débutent à travailler avec les aptamères à être en mesure de les utiliser dans leurs projets et aussi à comprendre les petites étapes individuelles qui sont nécessaires pour compléter le protocole. Les aptamères sont très polyvalents, et ce protocole démontre à quel point ils sont faciles et simples dans un test d’immunophénotypage. Les aptamères peuvent être utilisés pour des applications diagnostiques et thérapeutiques.Ce protocole est la première étape entreprise pour confirmer leur spécificité et leur sensibilité. Bien que ce test particulier démontre la coloration d’un récepteur de surface cellulaire, les aptamères peuvent très facilement être utilisés pour la cytométrie en flux multi-paramétrique, fournissant un niveau élevé de connaissances phénotypiques. Les aspects importants du travail avec les aptamères sont de s’assurer qu’ils sont correctement pliés avant utilisation, et aussi que le tampon et les conditions de force ionique sont les mêmes que lorsqu’ils ont été sélectionnés.Après avoir recueilli et jeté le média dans le flacon, ajoutez trois millilitres de PBS et étalez-le sur les cellules. Après avoir ajouté un millilitre de 0,25% de trypsine-EDTA à chaque fiole, incuber pendant cinq à 10 minutes à 37 degrés Celsius et visualiser le détachement des cellules au microscope. Ensuite, ajoutez un millilitre de milieu complet aux cellules et pipette les cellules de haut en bas pour obtenir une suspension unicellulaire.Pipeter les cellules dans un tube approprié et centrifuger à 200 g pendant cinq minutes. Après avoir éliminé le surnageant, remettre les cellules en suspension dans un millilitre de milieu frais et compter les cellules en utilisant la coloration au bleu de trypan en diluant un certain volume de suspension cellulaire avec du bleu de trypan. Répartir environ 15 microlitres du mélange entre un hémocytomètre et un verre de couverture pour compter les cellules.Recueillir le nombre requis de cellules, en vous assurant d’avoir cent mille cellules par échantillon de test. Incuber ensuite les cellules à 37 degrés Celsius pendant deux heures pour permettre la stabilisation de la protéine d’intérêt sur la membrane cellulaire suite au décollement enzymatique. Après les deux heures d’incubation, centrifuger les cellules à 500 G pendant cinq minutes.Après avoir jeté le surnageant, remettez les cellules en suspension dans 500 microlitres de tampon bloquant. Incuber les cellules à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes avec un mélange intermittent. Au cours de cette incubation de 30 minutes, effectuez le pliage des aptamères en préparant deux fois les concentrations d’aptamères décrites dans le manuscrit.Ensuite, mélangez et incuber les aptamères avec la thermocycleuse en fonction des conditions de pliage requises tout en veillant à protéger les aptamères de la lumière. Après l’incubation de 30 minutes, centrifuger les cellules comme démontré précédemment et retirer le surnageant. Ajoutez ensuite un millilitre de tampon de lavage et centrifugez à nouveau les cellules.Après avoir retiré le surnageant, remettre les cellules en suspension dans un volume approprié du tampon de liaison. Ensuite, pipeter 50 microlitres des cellules remises en suspension dans chaque puits d’une plaque noire glacée de 96 puits. Ensuite, pipeter 50 microlitres des aptamères sur un volume de cellules de 50 microlitres, mélanger et incuber dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes.Après la centrifugeuse et le retrait du surnageant, remettre délicatement la pastille en suspension dans un tampon de lavage et centrifuger à nouveau à 500 G pendant cinq minutes. Remettez ensuite en suspension dans 100 microlitres de tampon de lavage pour l’analyse cytométrique en flux tout en répétant l’étape de lavage deux fois. Tout d’abord, allumez le cytomètre en flux, puis l’ordinateur.Ensuite, ouvrez le logiciel d’analyse de cytométrie en flux, connectez-vous au programme et, sous l’onglet cytomètre, exécutez le démarrage du fluide. Pour créer une nouvelle expérience, sous l’onglet Expérience, cliquez sur Nouveau dossier et nommez l’expérience de barre oblique de dossier de manière appropriée. Cliquez sur le nouveau dossier pour le mettre en surbrillance.Ensuite, sous l’onglet Expérience, cliquez à nouveau sur Nouvelle expérience et nommez-la de manière appropriée. Pour ajouter le premier échantillon de barre oblique, sous l’onglet expérience, cliquez sur Nouveau spécimen et nommez-le de manière appropriée. Pour ajouter un échantillon de tube, mettez l’échantillon en surbrillance et sous l’onglet expérience, cliquez sur nouveau tube.Ajoutez ensuite le nombre approprié de tubes et le nom. Pour préparer les graphiques requis, sous un onglet de feuille de calcul, ouvrez une nouvelle feuille de calcul. Une fois que la nouvelle fenêtre de feuille de calcul apparaît, préparez un graphique à points de dispersion latérale par rapport à la dispersion vers l’avant pour sélectionner la population d’intérêt.Préparez un graphique par transfert de points de la hauteur de diffusion vers l’avant par rapport à la zone de diffusion vers l’avant pour sélectionner la population de cellules individuelles. Ensuite, préparez un histogramme du nombre d’événements contre le fluorophore d’intérêt. Assurez-vous que le tableau de bord d’acquisition pour contrôler l’acquisition de l’échantillon, l’inspecteur et le cytomètre pour ajuster les paramètres de tension ainsi que la feuille de calcul avec tous les graphiques sont ouverts avant de commencer la cytométrie en flux.Tout d’abord, exécutez les cellules non traitées. Assurez-vous que la flèche pointant vers le tube est verte. Si cette flèche n’est pas verte, cliquez sur la flèche pour la rendre verte.À l’aide d’une pipette, transférer chaque échantillon de la plaque noire de 96 puits dans un tube de cytométrie en flux. Dans le tableau de bord d’acquisition, choisissez un nombre approprié d’événements à enregistrer, définissez le débit sur faible, puis cliquez sur Acquérir des données. Ajustez la tension pour les paramètres FSC et SCC, en vous assurant que la population de cellules est centralisée dans le diagramme à points et qu’aucune cellule ne touche l’un ou l’autre axe du graphique pour éviter de perdre les cellules d’intérêt.Définir la première porte en identifiant et en sélectionnant la population d’intérêt dans un diagramme de densité dispersée vers l’avant et sur les côtés, tout en excluant les débris, qui constituent la population ayant le signal de diffusion vers l’avant le plus faible. Définissez la deuxième porte en excluant les populations de doublets cellulaires, car les cellules doublet affectent considérablement les résultats et les conclusions. Augmentez la vitesse d’acquisition à moyenne ou élevée pour analyser les échantillons plus rapidement, mais ne dépassez pas plus de 200 à 300 événements par seconde.Cliquez ensuite sur Enregistrer les données. Après avoir réglé la tension, déclenché et enregistré les données, retirez l’échantillon et cliquez sur Next Tube (Tube suivant). Insérez l’échantillon suivant et répétez les données d’enregistrement pour tous les échantillons témoins et d’essai.Une fois toutes les données collectées, lavez le cytomètre en flux en faisant fonctionner trois tubes d’eau de Javel à 50%, de FACSRinse et d’eau ultrapure, chacun pendant cinq minutes à un débit élevé. Ensuite, dans le menu déroulant du cytomètre, cliquez sur fluidique s’arrêter. Exportez le résultat sous forme de fichiers fsc vers une clé USB pour le transférer.Analysez-les à l’aide du logiciel d’analyse en appuyant sur le bouton Nouveau pour créer un nouveau document et une nouvelle fenêtre pour gérer l’analyse, puis faites glisser les fichiers d’exemple dans la nouvelle fenêtre. Double-cliquez pour ouvrir l’échantillon non taché. Pour ouvrir la porte à la population unicellulaire, choisissez la population P1 et double-cliquez sur la population P1 pour créer un graphique FSCH versus FSCA.Double-cliquez sur les cellules individuelles fermées pour créer un histogramme des événements par rapport au fluorochrome utilisé. Dans la fenêtre d’origine, sélectionnez P1 et les cellules simples et faites-les glisser vers tous les échantillons afin que tous les échantillons contiennent désormais le même point de contrôle. Ensuite, cliquez sur le bouton de l’éditeur de mise en page pour ouvrir la fenêtre des mises en page et faites glisser deux échantillons l’un sur l’autre pour créer un histogramme de superposition.Dans les cellules MDA-MB-231 EpCAM positives, la superposition des histogrammes représentant les cellules traitées avec TEPP et TENN montre que les cellules traitées TEPP sont déplacées vers la droite, par rapport aux cellules traitées TENN, démontrant que la liaison de l’aptamère TEPP se produit à la protéine d’intérêt. Dans le contrôle négatif, les cellules HEK 293T superposées aux histogrammes de TEPP et de TENN ne reflètent aucun décalage indiquant que dans les cellules exprimant EpCAM, TEPP est l’aptamère EpCAM attaché à son récepteur. De plus, aucune liaison n’a été observée dans les cellules EpCAM négatives, ce qui confirme la sélectivité et la spécificité de l’aptamère développé.Assurez-vous que les aptamères sont protégés de la lumière, que les aptamères et les cellules sont mélangés sur la plaque et que les tensions correctes sont réglées sur le cytomètre en flux. Cela dépend fortement des applications futures des aptamères. Par exemple, nous nous concentrons sur l’administration de médicaments.La prochaine étape pour nous serait donc d’évaluer si les aptamères sont internalisés à l’aide de la microscopie fluorescente. Ce protocole a démontré à quel point il est facile pour les aptamères de remplacer les anticorps monoclonaux et polyclonaux dans les tests d’immunophénotypage.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization

Une méthode d&#39;isolement cellulaire ciblée via verre fonctionnalisation de surface

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Fluorescent modèle de souris orthotopique de cancer du pancréas

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

Anticancer efficacité de la thérapie photodynamique avec Lung Cancer-ciblée Nanoparticules

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Médicament à base de cytométrie en flux système de contrôle pour l’Identification de petites molécules qui favorisent la différenciation cellulaire des cellules souches de glioblastome

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

Électrophorèse bidimensionnelle, couplée avec des méthodes de spectrométrie de masse pour l’analyse du protéome de tissus Adénome hypophysaire humaine

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophénotypage de homogreffe orthotopique (syngéniques) d’adénocarcinome Ductal pancréatique KPC primaires murines par cytométrie en flux

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Cytométrie en flux phospho avec cellule fluorescente code-barres pour seule cellule signalisation d’analyse et découverte de Biomarker

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Détection en temps réel de dans l’apoptose des cellules tumorales in Vitro induite par CD8+ T Cells pour étudier les fonctions immunitaires de suppresseurs de tumeur-infiltration de cellules myéloïdes

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Un Workflow Simple Migration/Invasion à l’aide d’un imageur automatisé de cellules vivantes

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Évaluation de la viabilité cellulaire et de la mort dans les cultures sphéroïdes 3D des cellules cancéreuses

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...