Name: a flow cytometry-based cell surface protein binding assay for assessing selectivity and specificity of an anticancer aptamer
Uploaded: 2022-09-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer at JoVE.com

Die Autoren würdigen die SEED-Finanzierung des Institute for Mental and Physical Health and Clinical Translation (IMPACT), das Programm "Alfred Deakin Postdoctoral Research Fellowship" an der Deakin University und das "Australian Government Research Training Program Scholarship".

HINWEIS: Tragen Sie vor Beginn des Experiments persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Laborkittel, Handschuhe und Schutzbrille. Weitere Informationen zu Materialien, Reagenzien, Geräten und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle .
1. Für den Assay erforderliche Puffer
<ol><li>Bereiten Sie die für dieses Experiment erforderlichen Puffer - den für die Aptamerfaltung erforderlichen SELEX-Puffer, den Bl...

<ol>
	<li>Cancer. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers</a> (2022)</li><li>Liu, J. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+monoclonal+antibody+development+-+Progress,+remaining+challenges+and+future+innovations.">The history of monoclonal antibody development - Progress, remaining challenges and future innovations.</a> Annals of Medicine and Surgery. 3 (4), 113-116 (2014).</li><li>Nakhjavani, M., Shigdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+of+PD-1/PD-L1+axis+modulation+for+the+treatment+of+triple-negative+breast+cancer.">Future of PD-1/PD-L1 axis modulation for the treatment of triple-negative breast cancer.</a> Pharmacological Research. 175, 106019 (2022).</li><li>Bukari, B., Samarasinghe, R. M., Noibanchong, J., Shigdar, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+delivery+of+therapeutics+into+the+brain:+the+potential+of+aptamers+for+targeted+delivery.">Non-invasive delivery of therapeutics into the brain: the potential of aptamers for targeted delivery.</a> Biomedicines. 8 (5), 120 (2020).</li><li>Wu, X., Chen, J., Wu, M., Zhao, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers:+active+targeting+ligands+for+cancer+diagnosis+and+therapy.">Aptamers: active targeting ligands for cancer diagnosis and therapy.</a> Theranostics. 5 (4), 322 (2015).</li><li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aptamer+functionalized+nanocomposite+used+for+prostate+cancer+diagnosis+and+therapy.">The aptamer functionalized nanocomposite used for prostate cancer diagnosis and therapy.</a> Journal of Nanomaterials. 2022, (2022).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+aptamer-based+biomarker+discovery.">Advances in aptamer-based biomarker discovery.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 571 (2021).</li><li>Ashrafuzzaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers+as+both+drugs+and+drug-carriers.">Aptamers as both drugs and drug-carriers.</a> BioMed Research International. 2014, (2014).</li><li>Nakhjavani, M., Samarasinghe, R. M., Shigdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple-negative+breast+cancer+brain+metastasis:+an+update+on+druggable+targets,+current+clinical+trials,+and+future+treatment+options.">Triple-negative breast cancer brain metastasis: an update on druggable targets, current clinical trials, and future treatment options.</a> Drug Discovery Today. , (2022).</li><li>Macdonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+bifunctional+aptamer+targeting+the+transferrin+receptor+and+epithelial+cell+adhesion+molecule+(EpCAM)+for+the+treatment+of+brain+cancer+metastases.">Development of a bifunctional aptamer targeting the transferrin receptor and epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) for the treatment of brain cancer metastases.</a> ACS Chemical Neuroscience. 8 (4), 777-784 (2017).</li><li>Macdonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifunctional+aptamer-doxorubicin+conjugate+crosses+the+blood-brain+barrier+and+selectively+delivers+its+payload+to+EpCAM-positive+tumor+cells.">Bifunctional aptamer-doxorubicin conjugate crosses the blood-brain barrier and selectively delivers its payload to EpCAM-positive tumor cells.</a> Nucleic Acid Therapeutics. 30 (2), 117-128 (2020).</li><li>Shigdar, S., Agnello, L., Fedele, M., Camorani, S., Cerchia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+cancer+cells+by+cell-SELEX:+use+of+aptamers+for+discovery+of+actionable+biomarkers+and+therapeutic+applications+thereof.">Profiling cancer cells by cell-SELEX: use of aptamers for discovery of actionable biomarkers and therapeutic applications thereof.</a> Pharmaceutics. 14 (1), 28 (2021).</li><li>Rahimizadeh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell-specific+aptamers:+recent+advances+and+insight+into+the+selection+procedures.">Development of cell-specific aptamers: recent advances and insight into the selection procedures.</a> Molecules. 22 (12), 2070 (2017).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell-SELEX+technology+and+its+application+in+cancer+diagnosis+and+therapy.">Development of cell-SELEX technology and its application in cancer diagnosis and therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (12), 2079 (2016).</li><li>Shigdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+sensitive+chemical+antibodies+for+diagnosis:+detection+of+low+levels+of+EpCAM+in+breast+cancer.">The use of sensitive chemical antibodies for diagnosis: detection of low levels of EpCAM in breast cancer.</a> PLoS One. 8 (2), 57613 (2013).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+EpCAM+(CD326)+in+prostate+cancer+metastasis+and+progression.">Role of the EpCAM (CD326) in prostate cancer metastasis and progression.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 31 (3), 779-791 (2012).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+adhesion+molecule+(EpCAM)+is+associated+with+prostate+cancer+metastasis+and+chemo/radioresistance+via+the+PI3K/Akt/mTOR+signaling+pathway.">Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) is associated with prostate cancer metastasis and chemo/radioresistance via the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 45 (12), 2736-2748 (2013).</li><li>McKeague, M., Kruse, P. F., Patterson, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tissue Culture. , 395-397 (1973).</li><li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+minimum+aptamer+publication+standards+(MAPS+guidelines)+for+de+novo+aptamer+selection.">The minimum aptamer publication standards (MAPS guidelines) for de novo aptamer selection.</a> Aptamers. 6, 10-18 (2022).</li><li>Schoofs, G., Van Hout, A., D'huys, T., Schols, D., Van Loy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometry-based+assay+to+identify+compounds+that+disrupt+binding+of+fluorescently-labeled+CXC+Chemokine+ligand+12+to+CXC+Chemokine+receptor+4.">A flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled CXC Chemokine ligand 12 to CXC Chemokine receptor 4.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57271 (2018).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+an+overview.">Flow cytometry: an overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120 (1), 1-11 (2018).</li><li>Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+cell+viability+assays.">Guidelines for cell viability assays.</a> Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).</li><li>Ruscito, A., DeRosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+binding+aptamers:+Selection+strategies,+characterization,+and+applications.">Small-molecule binding aptamers: Selection strategies, characterization, and applications.</a> Frontiers in Chemistry. 4, 14 (2016).</li><li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analytical+comparison+of+strategies+used+for+small+molecule+aptamer+evaluation.">Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation.</a> Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).</li><li>Henri, J., Bayat, N., Macdonald, J., Shigdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+using+nucleic+acid+aptamers+in+cell+based+assays.">A guide to using nucleic acid aptamers in cell based assays.</a> Aptamers. 23, (2019).</li><li>Mao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+and+regularity+of+quenching+the+effect+of+bases+on+fluorophores:+the+base-quenched+probe+method.">The mechanism and regularity of quenching the effect of bases on fluorophores: the base-quenched probe method.</a> Analyst. 143 (14), 3292-3301 (2018).</li><li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+in+vitro+aptamer+selection+parameters.">Analysis of in vitro aptamer selection parameters.</a> Journal of Molecular Evolution. 81 (5), 150-161 (2015).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+negative+surface+charges+of+cancer+cells+by+multifunctional+nanoprobes.">Targeting negative surface charges of cancer cells by multifunctional nanoprobes.</a> Theranostics. 6 (11), 1887 (2016).</li><li>Shigdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+aptamers+targeting+cancer+stem+cell+marker+CD133.">RNA aptamers targeting cancer stem cell marker CD133.</a> Cancer Letters. 330 (1), 84-95 (2013).</li><li>Amraee, M., Oloomi, M., Yavari, A., Bouzari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+aptamer+identification+and+characterization+for+E.+coli+O157+detection+using+cell+based+SELEX+method.">DNA aptamer identification and characterization for E. coli O157 detection using cell based SELEX method.</a> Analytical Biochemistry. 536, 36-44 (2017).</li><li>Yu, X. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+and+characterization+of+a+novel+DNA+aptamer,+Apt-07S+specific+to+hepatocellular+carcinoma+cells.">Selection and characterization of a novel DNA aptamer, Apt-07S specific to hepatocellular carcinoma cells.</a> Drug Design, Development and Therapy. 14, 1535 (2020).</li></ol>

Die größte Herausforderung bei der Entwicklung neuer Aptamere ist das Fehlen von Standardrichtlinien, die für verschiedene Schritte dieses Prozesses gelten. McKeague et al. haben kürzlich einige der damit verbundenen Herausforderungen aufgezeigt, die zu unklaren Darstellungen von Daten in Publikationen und zum Versagen führen, die Forschung zu replizieren. Sie schlugen grundlegende Richtlinien vor, die für die Berücksichtigung bei der Charakterisierung von Aptameren erforderlich sind19. Ein...

Krebs ist nach wie vor eine der häufigsten Todesursachen weltweit1. Trotz der deutlichen Verbesserung der Krebsbehandlung in den letzten Jahrzehnten ist die Entwicklung von Krebsmedikamenten immer noch ein viel diskutiertes Thema. Dies liegt daran, dass die Chemotherapie als Hauptstütze der Krebsbehandlung von schwerwiegenden Nebenwirkungen begleitet wird, die die Einhaltung der Behandlung durch den Patienten einschränken. Darüber hinaus hat die durch Chemotherapie induzierte Krebsresistenz ihre Anwendung als einzige Wahl der medizinischen Intervention eingeschränkt. Die Anwendung von monoklonalen Antikörpern (mAbs) führte zu einem verbesserten Ansprechen aufKrebsbehandlungen 2. Der Grund für die Verwendung von mAbs bestand darin, die Wirksamkeit von Chemotherapeutika zu verbessern und ihre Nebenwirkungen zu minimieren. Die Verabreichung von mAbs wurde jedoch auch zu einer Herausforderung. Dies lag nicht nur an den mAb-induzierten immunologischen Reaktionen, sondern auch an den tierabhängigen und teuren Produktionskosten und schwierigen Lagerbedingungen3. Die Einführung von Aptameren in den 1990er Jahren4 weckte neue Hoffnungen in der Krebsbehandlung, da die Anwendung von Aptameren die mit mAbs verbundenen Herausforderungen angehen könnte.
Aptamere sind kurze Nukleinsäuresequenzen, die spezifisch für ein bestimmtes Ziel hergestellt werden. Die systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX) ist eine gängige Methode in der Aptamerproduktion. In SELEX wird das interessierende Protein mit einer Bibliothek zufälliger Nukleotidsequenzen inkubiert, und durch eine Reihe von iterativen Zyklen wird das für dieses Protein spezifische Aptamer gereinigt. Aptamere haben eine ähnliche Zielselektivität und Spezifität wie mAbs, und daher zeigt die Medikamentenentwicklung in diesem Bereich vielversprechende zukünftige Anwendungen. Aptamere spezifisch für Krebsbiomarker könnten als Einzelmedikamente und Krebsdiagnosewerkzeuge eingesetzt werden 5,6,7. Aufgrund ihrer nanoskaligen Struktur könnten diese Aptamere auch als Wirkstoffträger fungieren, um zytotoxische Wirkstoffe spezifisch an den Tumor abzugeben8. Dies würde die Wirksamkeit der gezielten Medikamentenabgabe erhöhen und chemotherapieassoziierte, Off-Target-Nebenwirkungen verringern. Darüber hinaus haben diese Nanomedikamente eine hohe Gewebepenetration, was sie zu einem wünschenswerten Kandidaten für die Verabreichung und Behandlung von Medikamenten in tiefen Tumoren macht. Aptamere können auch so konzipiert werden, dass sie auf die Transporter abzielen, die auf der Blut-Hirn-Schranke (BBB) exprimiert werden, um die Medikamentenabgabe an Hirntumoren zu verbessern9. Ein gutes Beispiel für ein solches Aptamer sind bifunktionelle Aptamere, die auf den Transferrinrezeptor (TfR)10 abzielen, um die Wirkstoffabgabe über die BHS zu verbessern, und eine zytotoxische Wirkstoffnutzlast an Tumorzellen abgeben11.
Trotz aller Vorteile von Aptameren hat die Medikamentenentwicklung auf diesem Gebiet noch kein vermarktetes, erfolgreiches Krebsmedikament hervorgebracht. Ein Grund dafür könnte das Fehlen standardisierter und reproduzierbarer Methoden sein, denen Forscher weltweit folgen könnten. In dieser Arbeit wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll eines Aptamers demonstriert, das an ein natives Protein bindet, das auf der Zelloberfläche exprimiert wird. Dieses Protokoll ist ein Voraussetzung für die präklinische Bewertung von Antikrebs-Aptameren. Der Assay wird durchgeführt, um die Selektivität und Spezifität des gereinigten Aptamers aus SELEX oder einer veröffentlichten Aptamersequenz zur Bestätigung der Selektivität und Spezifität nachzuweisen. Dieser durchflusszytometrische Assay ist ein schneller, zuverlässiger und empfindlicher Assay, der die Selektivität und Spezifität des Aptamers genau zeigt, wobei das Aptamer gegen Proteine auf der Zelloberflächegetestet wird 12,13,14. Diese Methode wird anhand der Bindung eines für EpCAM spezifischen Aptamers demonstriert, das in diesem Paper15 gezeigt wird. EpCAM spielt als Transmembran-Glykoprotein eine Rolle bei der Signalisierung, Progression, Migration und Metastasierung von Tumorzellen16,17. Um die Selektivität und Spezifität dieses Aptamers zu zeigen, wurden EpCAM-positive und -negative Krebszellen verwendet. Das zuvor entwickelte EpCAM-spezifische Aptamer TEPP (5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′) und ein Negativkontrollaptamer, TENN (5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3), wurden als EpCAM-bindende bzw. -unverbindliche Aptamere verwendet,10. Das 3'-Ende von TEPP und TENN wurde mit einem TYE665-Fluorophor markiert.
TEPP ist ein bifunktionaler Aptamer, der von einem Ende auf EpCAM und auf der anderen Seite auf TfR abzielt. Dies hat TEPP zu einem geeigneten Kandidaten für die Medikamentenabgabe bei EpCAM+ -Hirntumoren gemacht. Mit seinem TfR-spezifischen Ende durchquert TEPP die Blut-Hirn-Schranke und findet mit dem EpCAM-spezifischen Ende den Tumor und liefert seine Fracht (z. B. zytotoxische Medikamente) an den Tumor. TENN hat eine ähnliche Länge und 2D-Struktur wie TEPP, hat aber keine Affinität zur EpCAM oder TfR und ist daher ein geeigneter Negativkontrollaptamer. Unter Verwendung von TEPP und TENN wird in diesem Artikel gezeigt, wie die Bindung eines Aptamers an das Zielprotein mittels Durchflusszytometrie getestet wird. Dieses Protokoll gilt für die Entwicklung zellspezifischer Aptamere. Sie ist auch auf weitere Komplementär- und Bestätigungsanalysen der in der Literatur verfügbaren Aptamersequenzen anwendbar. Das Protokoll kann auch von Aptamer-Neulingen verwendet werden, die ein zuvor veröffentlichtes Aptamer für ihre Forschungs- und Entwicklungszwecke (F & E) verwenden möchten. In dieser Arbeit werden zwei in der Literatur verfügbare Aptamersequenzen untersucht.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipettes</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>606180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva V9.0</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder</td>
			<td>Sigma-AldrichTM</td>
			<td>A7906-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-line Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12100046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate- Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21300025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo, LLC 10.8.1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td>SFBS-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ACS-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Megafuge 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRM-HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A37834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen- and RNase-free ultrapure water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Cell Culture flask</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>658170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TENN</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5&#8242;-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEPP</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5&#8242;-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer RNA (tRNA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8508-5X1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow cytometry-based cell surface protein binding assay for assessing selectivity and specificity of an anticancer aptamer

Eine zentrale Herausforderung bei der Entwicklung eines Antikrebs-Aptamers besteht darin, die Selektivität und Spezifität des entwickelten Aptamers für das Zielprotein effizient zu bestimmen. Aufgrund seiner zahlreichen Vorteile gegenüber monoklonalen Antikörpern hat die Aptamer-Entwicklung unter Krebsforschern enorme Popularität erlangt. Die systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX) ist die gebräuchlichste Methode zur Entwicklung von Aptameren, die spezifisch für Proteine von Interesse sind. Nach SELEX beschleunigt ein schneller und effizienter Bindungsassay den Identifizierungsprozess und bestätigt die Selektivität und Spezifität des Aptamers. 
Dieser Artikel erläutert einen schrittweisen durchflusszytometrischen Bindungsassay eines Aptamers, das spezifisch für epitheliale zelluläre Adhäsionsmoleküle (EpCAM) ist. Das Transmembran-Glykoprotein EpCAM wird in den meisten Karzinomen überexprimiert und spielt eine Rolle bei der Initiierung, Progression und Metastasierung von Krebs. Daher ist es ein wertvoller Kandidat für die gezielte Medikamentenabgabe an Tumore. Um die Selektivität und Spezifität des Aptamers gegenüber der membrangebundenen EpCAM zu bewerten, werden EpCAM-positive und -negative Zellen benötigt. Zusätzlich wird ein unverbindlicher EpCAM-Aptamer mit ähnlicher Länge und 2-dimensionaler (2D) Struktur wie der EpCAM-bindende Aptamer benötigt. Der Bindungsassay umfasst verschiedene Puffer (Blockierungspuffer, Waschpuffer, Inkubationspuffer und FACS-Puffer) und Inkubationsschritte. 
Das Aptamer wird mit den Zelllinien inkubiert. Nach den Inkubations- und Waschschritten werden die Zellen mit einem empfindlichen Durchflusszytometrie-Assay bewertet. Die Analyse der Ergebnisse zeigt die Bindung des EpCAM-spezifischen Aptamers an EpCAM-positive Zellen und nicht an die EpCAM-negativen Zellen. In EpCAM-positiven Zellen wird dies als Bandverschiebung in der Bindung des EpCAM-Aptamers nach rechts im Vergleich zur unverbindlichen Aptamerkontrolle dargestellt. In EpCAM-negativen Zellen überlappen sich die entsprechenden Banden von EpCAM-bindenden und -nicht-bindenden Aptameren. Dies zeigt die Selektivität und Spezifität des EpCAM-Aptamers. Während sich dieses Protokoll auf den EpCAM-Aptamer konzentriert, ist das Protokoll auf andere veröffentlichte Aptamere anwendbar.

Ein wichtiger Aspekt der Entdeckung und Entwicklung neuer Wirkstoffe ist die Sicherstellung der Selektivität und Spezifität des Wirkstoffkandidaten. Dies bedeutet, dass der Wirkstoffkandidat in der Lage sein sollte, zwischen verschiedenen Zellen zu unterscheiden und nur die interessierende Zellpopulation zu beeinflussen (Selektivität). Die Selektivität wird anhand von Zelllinien untersucht, die sich in der Expression des interessierenden Proteins unterscheiden. In dieser Studie wurden MDA-MB-231 und HEK 293T Zelllini...

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A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

Ein notwendiger Schritt in der Entwicklung von Antikrebs-Aptamern besteht darin, seine Bindung an das Ziel zu testen. Wir demonstrieren einen durchflusszytometrischen Assay zur Untersuchung dieser Bindung und betonen die Bedeutung der Einbeziehung eines Negativkontrollaptamers und Krebszellen, die für dieses bestimmte Protein positiv oder negativ sind.

Ein auf Durchflusszytometrie basierender Zelloberflächenproteinbindungsassay zur Beurteilung der Selektivität und Spezifität eines Antikrebs-Aptamers

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

Dieses Protokoll wird Forschern, die neu in der Arbeit mit Aptameren sind, helfen, sie in ihren Projekten zu verwenden und auch die einzelnen kleinen Schritte zu verstehen, die erforderlich sind, um das Protokoll zu vervollständigen. Aptamere sind sehr vielseitig, und dieses Protokoll zeigt, wie einfach und einfach sie in einem Immunphänotypisierungsassay sind. Aptamere können sowohl für diagnostische als auch für therapeutische Anwendungen eingesetzt werden.Dieses Protokoll ist der erste Schritt, der unternommen wird, um ihre Spezifität und Sensitivität zu bestätigen. Während dieser spezielle Assay die Färbung eines Zelloberflächenrezeptors zeigt, können Aptamere sehr einfach für die multiparametrische Durchflusszytometrie verwendet werden, was ein hohes Maß an phänotypischem Wissen bietet. Die wichtigen Aspekte bei der Arbeit mit Aptameren sind sicherzustellen, dass sie vor der Verwendung korrekt gefaltet werden und dass die Puffer- und Ionenstärkebedingungen die gleichen sind wie bei der Auswahl.Nach dem Sammeln und Entsorgen der Medien im Kolben drei Milliliter PBS hinzufügen und über die Zellen verteilen. Nach Zugabe von einem Milliliter 0,25% Trypsin-EDTA in jeden Kolben fünf bis 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren und die Ablösung der Zellen unter einem Mikroskop visualisieren. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter komplettes Medium zu den Zellen hinzu und pipetten die Zellen nach oben und unten, um eine Einzelzellsuspension herzustellen.Die Zellen in ein geeignetes Röhrchen pipettieren und bei 200 G fünf Minuten lang zentrifugieren. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter frischem Medium und zählen Sie die Zellen mit Trypanblau-Färbung, indem Sie ein bestimmtes Volumen der Zellsuspension mit Trypanblau verdünnen. Verteilen Sie etwa 15 Mikroliter der Mischung zwischen einem Hämozytometer und einem Deckglas, um die Zellen zu zählen.Sammeln Sie die erforderliche Anzahl von Zellen und stellen Sie sicher, dass Sie hunderttausend Zellen pro Testprobe haben. Dann inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden, um die Stabilisierung des interessierenden Proteins auf der Zellmembran nach enzymatischer Ablösung zu ermöglichen. Nach der zweistündigen Inkubation die Zellen fünf Minuten lang bei 500 G zentrifugieren.Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern blockierendem Puffer. Inkubieren Sie die Zellen bei vier Grad Celsius für 30 Minuten mit intermittierendem Mischen. Führen Sie während dieser 30-minütigen Inkubation eine Aptamerfaltung durch, indem Sie die doppelten Konzentrationen von Aptameren wie im Manuskript beschrieben vorbereiten.Dann mischen und inkubieren Sie die Aptamere mit der Thermocycler-Maschine entsprechend den erforderlichen Faltbedingungen, wobei Sie sicherstellen, dass die Aptamere vor Licht geschützt werden. Nach der 30-minütigen Inkubation zentrifugieren Sie die Zellen wie zuvor demonstriert und entfernen Sie den Überstand. Dann einen Milliliter Waschpuffer hinzufügen und die Zellen erneut zentrifugieren.Nach dem Entfernen des Überstands resuspendieren Sie die Zellen in einem geeigneten Volumen des Bindungspuffers. Als nächstes pipettieren Sie 50 Mikroliter der resuspendierten Zellen in jede Vertiefung einer eiskalten 96 Well-schwarzen Platte. Dann 50 Mikroliter der Aptamere auf ein 50 Mikroliter großes Zellvolumen pipettieren, mischen und bei Dunkelheit bei vier Grad Celsius 30 Minuten lang inkubieren.Nach dem Zentrifugieren und Entfernen des Überstands das Pellet vorsichtig im Waschpuffer resuspendieren und erneut fünf Minuten bei 500 G zentrifugieren. Anschließend in 100 Mikroliter Waschpuffer für die durchflusszytometrische Analyse resuspendieren, während der Waschschritt zweimal wiederholt wird. Schalten Sie zuerst das Durchflusszytometer und dann den Computer ein.Öffnen Sie als Nächstes die Durchflusszytometrie-Analysesoftware, melden Sie sich beim Programm an und führen Sie auf der Registerkarte Zytometer den Flüssigkeitsstart aus. Um ein neues Experiment zu erstellen, klicken Sie auf der Registerkarte Experiment auf Neuer Ordner, und benennen Sie den Ordner entsprechend Schrägstrichexperiment. Klicken Sie auf den neuen Ordner, um ihn zu markieren.Klicken Sie dann erneut auf der Registerkarte Experiment auf Neues Experiment, und benennen Sie das Experiment entsprechend. Um die erste Probenschrägstrichprobe hinzuzufügen, klicken Sie auf der Registerkarte Experiment auf Neue Probe und benennen Sie die Probe entsprechend. Um eine Röhrchenprobe hinzuzufügen, markieren Sie die Probe, und klicken Sie auf der Registerkarte Experiment auf Neues Röhrchen.Fügen Sie dann die entsprechende Anzahl von Röhren und den Namen hinzu. Um die erforderlichen Diagramme vorzubereiten, öffnen Sie auf einer Arbeitsblattregisterkarte ein neues Arbeitsblatt. Sobald das neue Arbeitsblattfenster angezeigt wird, bereiten Sie ein Punktfleckdiagramm der Seitenstreuung im Vergleich zur Vorwärtsstreuung vor, um die gewünschte Grundgesamtheit auszuwählen.Bereiten Sie ein Punkt-Blot-Diagramm der Vorwärtsstreuhöhe im Vergleich zum Vorwärtsstreubereich vor, um die einzelne Zellpopulation auszuwählen. Als nächstes bereiten Sie ein Histogramm der Anzahl der Ereignisse gegen das interessierende Fluorophor vor. Stellen Sie sicher, dass das Erfassungs-Dashboard zur Steuerung der Probenaufnahme, des Inspektors und des Zytometers zur Anpassung der Spannungsparameter sowie das Arbeitsblatt mit allen Diagrammen geöffnet ist, bevor Sie mit der Durchflusszytometrie beginnen.Führen Sie zuerst die unbehandelten Zellen aus. Stellen Sie sicher, dass der Pfeil, der auf die Röhre zeigt, grün ist. Wenn dieser Pfeil nicht grün ist, klicken Sie auf den Pfeil, um ihn grün zu machen.Übertragen Sie mit der Pipette jede Probe von der 96 Well-Black-Platte in ein Durchflusszytometrieröhrchen. Wählen Sie im Erfassungsdashboard eine geeignete Anzahl von Ereignissen aus, die aufgezeichnet werden sollen, ändern Sie die Durchflussrate in niedrig, und klicken Sie auf Daten erfassen. Passen Sie die Spannung für die FSC- und SCC-Parameter an, um sicherzustellen, dass die Zellpopulation innerhalb des Punktdiagramms zentralisiert ist und dass keine Zellen eine der beiden Achsen des Diagramms berühren, um den Verlust der interessierenden Zellen zu vermeiden.Definieren Sie das erste Gatter, indem Sie die gewünschte Grundgesamtheit in einem Vorwärts- und Seitenstreudichtediagramm identifizieren und auswählen, während Sie die Trümmer ausschließen, die die Grundgesamtheit mit dem niedrigsten Vorwärtsstreusignal darstellen. Definieren Sie das zweite Tor, indem Sie Dublettenzellpopulationen ausschließen, da Dublettenzellen die Ergebnisse und Schlussfolgerungen erheblich beeinflussen. Erhöhen Sie die Erfassungsgeschwindigkeit auf mittel oder hoch, um die Proben schneller zu analysieren, überschreiten Sie jedoch nicht mehr als 200 bis 300 Ereignisse pro Sekunde.Klicken Sie dann auf Daten aufzeichnen. Nachdem Sie die Spannung angepasst und die Daten angegessen und aufgezeichnet haben, nehmen Sie die Probe heraus und klicken Sie auf Next Tube. Legen Sie die nächste Probe ein und wiederholen Sie die Aufzeichnungsdaten für alle Kontroll- und Testproben.Sobald alle Daten gesammelt sind, waschen Sie das Durchflusszytometer, indem Sie drei Röhrchen mit 50% Bleichmittel, FACSRinse und Reinstwasser jeweils fünf Minuten lang mit einer hohen Durchflussrate laufen lassen. Klicken Sie dann im Dropdown-Menü des Zytometers auf Fluidics Herunterfahren. Exportieren Sie das Ergebnis als fsc-Dateien auf ein USB-Laufwerk, um es zu übertragen.Analysieren Sie sie mit der Analysesoftware, indem Sie auf die Schaltfläche "Neu" klicken, um ein neues Dokument und ein neues Fenster für die Analyse zu erstellen, und ziehen Sie die Beispieldateien in das neue Fenster. Doppelklicken Sie, um die ungefärbte Probe zu öffnen. Um die einzelne Zellpopulation zu gatesen, wählen Sie die P1-Population und doppelklicken Sie auf die P1-Population, um ein FSCH- versus FSCA-Diagramm zu erstellen.Doppelklicken Sie auf die umzäunten Einzelzellen, um ein Histogramm der Ereignisse gegen das verwendete Fluorochrom zu erstellen. Wählen Sie im Originalfenster P1 und einzelne Zellen aus und ziehen Sie sie auf alle Proben, so dass alle Proben nun den gleichen Gating enthalten. Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche des Layout-Editors, um das Layoutfenster zu öffnen, und ziehen Sie zwei Beispiele übereinander, um ein Overlay-Histogramm zu erstellen.In EpCAM-positiven MDA-MB-231-Zellen zeigt die Überlagerung der Histogramme, die mit TEPP und TENN behandelte Zellen darstellen, dass die TEPP-behandelten Zellen im Vergleich zu den mit TENN behandelten Zellen nach rechts verschoben sind, was zeigt, dass die Bindung des TEPP-Aptamers an das interessierende Protein erfolgt. Bei der Negativkontrolle spiegeln HEK 293T-Zellen, die Histogramme von TEPP und TENN überlagern, keine Verschiebung wider, was darauf hindeutet, dass TEPP in EpCAM-exprimierenden Zellen der EpCAM-Aptamer ist, der an seinen Rezeptor gebunden ist. Darüber hinaus wurde keine Bindung in EpCAM-negativen Zellen beobachtet, was die Selektivität und Spezifität des entwickelten Aptamers bestätigt.Stellen Sie sicher, dass die Aptamere vor Licht geschützt sind, die Aptamere und Zellen auf der Platte gemischt sind und die richtigen Spannungen auf dem Durchflusszytometer eingestellt sind. Dies hängt stark von zukünftigen Anwendungen der Aptamere ab. Zum Beispiel konzentrieren wir uns auf die Medikamentenabgabe.Der nächste Schritt für uns wäre also, mittels Fluoreszenzmikroskopie zu beurteilen, ob die Aptamere internalisiert werden. Dieses Protokoll hat gezeigt, wie einfach es für Aptamere ist, monoklonale und polyklonale Antikörper in Immunphänotypisierungsassays zu ersetzen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization

Ein Verfahren zur gezielten Zellisolierung über Glas Oberflächenfunktionalisierung

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual ...

Forschung

Krebsforschung

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Fluoreszierende orthotopen Mausmodell des Bauchspeicheldrüsenkrebs

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

Anti-Krebs-Wirksamkeit der Photodynamischen Therapie mit Lungenkrebs-Targeted-Nanopartikel

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Flow Cytometry-based Drug Screening-System für die Identifizierung von kleinen Molekülen, die zelluläre Differenzierung von Stammzellen Glioblastom zu fördern

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

Zweidimensionaler Gelelektrophorese gekoppelt mit Massenspektrometrie Methoden für eine Analyse der menschlichen Hypophyse Adenom Gewebe Proteom

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Die Immunphänotypisierung der Orthotopen Homograft (Phänomen) der murinen primäre KPC duktales Pankreaskarzinom durch Durchflusszytometrie

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Phospho-Durchflusszytometrie mit fluoreszierenden Zelle Barcoding für einzelne Zelle Signalisierung Analyse und Entdeckung von Biomarkern

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Echtzeit-Erkennung von In Vitro Tumor Zelle Apoptose induziert durch CD8+ T-Zellen, unterdrückende Immunfunktionen Tumor infiltrieren myeloische Zellen zu studieren

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Eine einfache Migration/Invasion Workflow mit einer automatisierten Leben-Zelle-Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Beurteilung der Zelllebensfähigkeit und des Todes in 3D-Sphäroidkulturen von Krebszellen

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...