Name: a flow cytometry-based cell surface protein binding assay for assessing selectivity and specificity of an anticancer aptamer
Uploaded: 2022-09-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer at JoVE.com

המחברים מכירים במימון SEED של המכון לבריאות נפשית ופיזית ותרגום קליני (IMPACT), בתוכנית "מלגת מחקר פוסט-דוקטורט ע"ש אלפרד דיקין" באוניברסיטת דיקין, וב"מלגת תוכנית ההכשרה למחקר של ממשלת אוסטרליה".

הערה: לפני תחילת הניסוי, יש ללבוש ציוד מגן אישי, כולל מעיל מעבדה, כפפות ומשקפי מגן. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים אודות חומרים, ריאגנטים, ציוד ותוכנות המשמשים בפרוטוקול זה.
1. מאגרים נדרשים לבדיקה
<ol><li>הכן את המאגרים הדרושים לניסוי זה - מאגר SELEX הנדרש לקיפול...

<ol>
	<li>Cancer. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers</a> (2022)</li><li>Liu, J. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+monoclonal+antibody+development+-+Progress,+remaining+challenges+and+future+innovations.">The history of monoclonal antibody development - Progress, remaining challenges and future innovations.</a> Annals of Medicine and Surgery. 3 (4), 113-116 (2014).</li><li>Nakhjavani, M., Shigdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+of+PD-1/PD-L1+axis+modulation+for+the+treatment+of+triple-negative+breast+cancer.">Future of PD-1/PD-L1 axis modulation for the treatment of triple-negative breast cancer.</a> Pharmacological Research. 175, 106019 (2022).</li><li>Bukari, B., Samarasinghe, R. M., Noibanchong, J., Shigdar, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+delivery+of+therapeutics+into+the+brain:+the+potential+of+aptamers+for+targeted+delivery.">Non-invasive delivery of therapeutics into the brain: the potential of aptamers for targeted delivery.</a> Biomedicines. 8 (5), 120 (2020).</li><li>Wu, X., Chen, J., Wu, M., Zhao, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers:+active+targeting+ligands+for+cancer+diagnosis+and+therapy.">Aptamers: active targeting ligands for cancer diagnosis and therapy.</a> Theranostics. 5 (4), 322 (2015).</li><li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aptamer+functionalized+nanocomposite+used+for+prostate+cancer+diagnosis+and+therapy.">The aptamer functionalized nanocomposite used for prostate cancer diagnosis and therapy.</a> Journal of Nanomaterials. 2022, (2022).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+aptamer-based+biomarker+discovery.">Advances in aptamer-based biomarker discovery.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 571 (2021).</li><li>Ashrafuzzaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers+as+both+drugs+and+drug-carriers.">Aptamers as both drugs and drug-carriers.</a> BioMed Research International. 2014, (2014).</li><li>Nakhjavani, M., Samarasinghe, R. M., Shigdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple-negative+breast+cancer+brain+metastasis:+an+update+on+druggable+targets,+current+clinical+trials,+and+future+treatment+options.">Triple-negative breast cancer brain metastasis: an update on druggable targets, current clinical trials, and future treatment options.</a> Drug Discovery Today. , (2022).</li><li>Macdonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+bifunctional+aptamer+targeting+the+transferrin+receptor+and+epithelial+cell+adhesion+molecule+(EpCAM)+for+the+treatment+of+brain+cancer+metastases.">Development of a bifunctional aptamer targeting the transferrin receptor and epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) for the treatment of brain cancer metastases.</a> ACS Chemical Neuroscience. 8 (4), 777-784 (2017).</li><li>Macdonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifunctional+aptamer-doxorubicin+conjugate+crosses+the+blood-brain+barrier+and+selectively+delivers+its+payload+to+EpCAM-positive+tumor+cells.">Bifunctional aptamer-doxorubicin conjugate crosses the blood-brain barrier and selectively delivers its payload to EpCAM-positive tumor cells.</a> Nucleic Acid Therapeutics. 30 (2), 117-128 (2020).</li><li>Shigdar, S., Agnello, L., Fedele, M., Camorani, S., Cerchia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+cancer+cells+by+cell-SELEX:+use+of+aptamers+for+discovery+of+actionable+biomarkers+and+therapeutic+applications+thereof.">Profiling cancer cells by cell-SELEX: use of aptamers for discovery of actionable biomarkers and therapeutic applications thereof.</a> Pharmaceutics. 14 (1), 28 (2021).</li><li>Rahimizadeh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell-specific+aptamers:+recent+advances+and+insight+into+the+selection+procedures.">Development of cell-specific aptamers: recent advances and insight into the selection procedures.</a> Molecules. 22 (12), 2070 (2017).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell-SELEX+technology+and+its+application+in+cancer+diagnosis+and+therapy.">Development of cell-SELEX technology and its application in cancer diagnosis and therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (12), 2079 (2016).</li><li>Shigdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+sensitive+chemical+antibodies+for+diagnosis:+detection+of+low+levels+of+EpCAM+in+breast+cancer.">The use of sensitive chemical antibodies for diagnosis: detection of low levels of EpCAM in breast cancer.</a> PLoS One. 8 (2), 57613 (2013).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+EpCAM+(CD326)+in+prostate+cancer+metastasis+and+progression.">Role of the EpCAM (CD326) in prostate cancer metastasis and progression.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 31 (3), 779-791 (2012).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+adhesion+molecule+(EpCAM)+is+associated+with+prostate+cancer+metastasis+and+chemo/radioresistance+via+the+PI3K/Akt/mTOR+signaling+pathway.">Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) is associated with prostate cancer metastasis and chemo/radioresistance via the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 45 (12), 2736-2748 (2013).</li><li>McKeague, M., Kruse, P. F., Patterson, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tissue Culture. , 395-397 (1973).</li><li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+minimum+aptamer+publication+standards+(MAPS+guidelines)+for+de+novo+aptamer+selection.">The minimum aptamer publication standards (MAPS guidelines) for de novo aptamer selection.</a> Aptamers. 6, 10-18 (2022).</li><li>Schoofs, G., Van Hout, A., D'huys, T., Schols, D., Van Loy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometry-based+assay+to+identify+compounds+that+disrupt+binding+of+fluorescently-labeled+CXC+Chemokine+ligand+12+to+CXC+Chemokine+receptor+4.">A flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled CXC Chemokine ligand 12 to CXC Chemokine receptor 4.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57271 (2018).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+an+overview.">Flow cytometry: an overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120 (1), 1-11 (2018).</li><li>Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+cell+viability+assays.">Guidelines for cell viability assays.</a> Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).</li><li>Ruscito, A., DeRosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+binding+aptamers:+Selection+strategies,+characterization,+and+applications.">Small-molecule binding aptamers: Selection strategies, characterization, and applications.</a> Frontiers in Chemistry. 4, 14 (2016).</li><li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analytical+comparison+of+strategies+used+for+small+molecule+aptamer+evaluation.">Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation.</a> Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).</li><li>Henri, J., Bayat, N., Macdonald, J., Shigdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+using+nucleic+acid+aptamers+in+cell+based+assays.">A guide to using nucleic acid aptamers in cell based assays.</a> Aptamers. 23, (2019).</li><li>Mao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+and+regularity+of+quenching+the+effect+of+bases+on+fluorophores:+the+base-quenched+probe+method.">The mechanism and regularity of quenching the effect of bases on fluorophores: the base-quenched probe method.</a> Analyst. 143 (14), 3292-3301 (2018).</li><li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+in+vitro+aptamer+selection+parameters.">Analysis of in vitro aptamer selection parameters.</a> Journal of Molecular Evolution. 81 (5), 150-161 (2015).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+negative+surface+charges+of+cancer+cells+by+multifunctional+nanoprobes.">Targeting negative surface charges of cancer cells by multifunctional nanoprobes.</a> Theranostics. 6 (11), 1887 (2016).</li><li>Shigdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+aptamers+targeting+cancer+stem+cell+marker+CD133.">RNA aptamers targeting cancer stem cell marker CD133.</a> Cancer Letters. 330 (1), 84-95 (2013).</li><li>Amraee, M., Oloomi, M., Yavari, A., Bouzari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+aptamer+identification+and+characterization+for+E.+coli+O157+detection+using+cell+based+SELEX+method.">DNA aptamer identification and characterization for E. coli O157 detection using cell based SELEX method.</a> Analytical Biochemistry. 536, 36-44 (2017).</li><li>Yu, X. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+and+characterization+of+a+novel+DNA+aptamer,+Apt-07S+specific+to+hepatocellular+carcinoma+cells.">Selection and characterization of a novel DNA aptamer, Apt-07S specific to hepatocellular carcinoma cells.</a> Drug Design, Development and Therapy. 14, 1535 (2020).</li></ol>

האתגר המרכזי בפיתוח אפטמרים חדשים הוא היעדר הנחיות סטנדרטיות החלות על שלבים שונים בתהליך זה. McKeague et al. הדגימו לאחרונה כמה מהאתגרים הנלווים, שמובילים להצגה לא ברורה של נתונים בפרסומים ואי שכפול המחקר. הם הציעו קווים מנחים יסודיים הדרושים לשיקול באפיון אפטאמרים19. בדיקת קשירת א?...

סרטן הוא עדיין אחד הגורמים המובילים לתמותה ברחבי העולם1. למרות השיפור המשמעותי בטיפול בסרטן בעשורים האחרונים, פיתוח תרופות נגד סרטן הוא עדיין נושא שנוי במחלוקת. הסיבה לכך היא שכימותרפיה, כעמוד התווך של הטיפול בסרטן, מלווה בתופעות לוואי חמורות המגבילות את ציות המטופל לטיפול. יתר על כן, עמידות לסרטן הנגרמת על ידי כימותרפיה לטיפול הגבילה את יישומו כבחירה היחידה של התערבות רפואית. היישום של נוגדנים חד שבטיים (mAbs) הציג תגובה משופרת לטיפולים בסרטן2. הרציונל של השימוש ב-mAbs היה לשפר את היעילות של כימותרפיה ולמזער את התגובות השליליות שלהם. עם זאת, הממשל של mAbs הפך גם אתגר. זה היה לא רק בגלל התגובות החיסוניות הנגרמות על ידי mAb, אלא גם בגלל עלויות הייצור התלויות והיקרות של בעלי חיים ותנאי אחסון קשים3. הצגת האפטמרים בשנות ה-90 של המאה ה-20העלתה תקוות חדשות בטיפול בסרטן, שכן היישום של אפטמרים יכול היה להתמודד עם האתגרים הקשורים ל-mAbs.
אפטמרים הם רצפי חומצות גרעין קצרים המיוצרים במיוחד עבור מטרה מסוימת. אבולוציה שיטתית של ליגנדות על ידי העשרה אקספוננציאלית (SELEX) היא שיטה נפוצה בייצור אפטמרים. ב-SELEX, החלבון המעניין מודגר עם ספרייה של רצפי נוקלאוטידים אקראיים, ובאמצעות סדרה של מחזורים איטרטיביים, האפטמר הספציפי לחלבון זה מטוהר. ל-Aptamers יש סלקטיביות מטרה וספציפיות דומות ל-mAbs, ולכן פיתוח תרופות בתחום זה מראה יישומים עתידיים מבטיחים. Aptamers ספציפיים עבור סמנים ביולוגיים לסרטן יכול להיות מיושם כתרופות בודדות וכלי אבחון סרטן 5,6,7. בשל המבנה הננו-גדול שלהם, אפטמרים אלה יכולים לשמש גם כנשאי תרופות כדי לספק חומרים ציטוטוקסיים במיוחד לגידול8. זה יגביר את היעילות של מתן תרופות ממוקדות ויפחית את התגובות השליליות הקשורות לכימותרפיה, מחוץ למטרה. יתר על כן, לננו-רפואה אלה יש חדירה גבוהה לרקמות, מה שהופך אותם למועמדים רצויים להעברת תרופות וטיפול בגידולים עמוקים. ניתן גם לתכנן את האפטמרים כך שיתמקדו במובילים המתבטאים במחסום הדם-מוח (BBB) כדי לשפר את אספקת התרופות לגידולי מוח9. דוגמה טובה לאפטמר כזה הם אפטמרים דו-כיווניים, המכוונים לקולטן טרנספרין (TfR)10 כדי לשפר את אספקת התרופות ברחבי ה-BBB, ומעבירים מטען של תרופה ציטוטוקסית לתאי הגידול11.
למרות כל היתרונות של אפטמרים, פיתוח תרופות בתחום זה עדיין לא הניב תרופה משווקת ומוצלחת נגד סרטן. סיבה אחת לכך יכולה להיות היעדר שיטות סטנדרטיות וניתנות לשחזור שניתן לעקוב אחריהן ברחבי העולם על ידי חוקרים בתחום. במאמר זה מודגם פרוטוקול שלב אחר שלב של קשירת אפטמר לחלבון מקומי המתבטא על פני התא. פרוטוקול זה הוא שלב מוקדם בהערכה הפרה-קלינית של אפטמרים נגד סרטן. הבדיקה מבוצעת כדי להראות את הסלקטיביות והספציפיות של האפטמר המטוהר שנאסף מ- SELEX או רצף אפטמר שפורסם לאישור סלקטיביות וספציפיות. בדיקה זו, המבוססת על ציטומטריה, היא בדיקה מהירה, אמינה ורגישה המציגה במדויק את הסלקטיביות והספציפיות של האפטאמר, כאשר האפטמר נבדק מול חלבונים על פני התא12,13,14. שיטה זו מודגמת באמצעות כריכה של aptamer ספציפי עבור EpCAM המוצג במאמר זה15. EpCAM, כגליקופרוטאין טרנסממברן, ממלא תפקידים באיתות תאי הגידול, התקדמות, נדידה וגרורות16,17. כדי להראות את הסלקטיביות והספציפיות של אפטמר זה, נעשה שימוש בתאי סרטן חיוביים ושליליים של EpCAM. האפטאמר הספציפי של EpCAM שפותח בעבר, TEPP (5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′), ואפטמר בקרה שלילית, TENN (5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3), שימשו כמחייבים EpCAM ו--לא מחייבים aptamers, בהתאמה10. הקצה 3' של TEPP ו- TENN סומנו עם פלואורופור TYE665.
TEPP הוא אפטמר דו-תכליתי המכוון ל-EpCAM מקצה אחד ול-TfR מצד שני. עובדה זו הפכה את TEPP למועמדת מתאימה לאספקת תרופות לגידולי מוח מסוג EpCAM+ . באמצעות הקצה הספציפי ל-TfR, TEPP חוצה את מחסום הדם-מוח, ובאמצעות הקצה הספציפי ל-EpCAM, מוצא את הגידול ומעביר את המטען שלו (למשל, תרופות ציטוטוקסיות) לגידול. ל- TENN יש אורך ומבנה דו-ממדי דומה לזה של TEPP, אך אין לו זיקה ל- EpCAM או TfR, ולכן הוא אפתמר מתאים לבקרה שלילית. באמצעות TEPP ו- TENN, בדיקת קשירת אפטמר לחלבון המטרה באמצעות ציטומטריה של זרימה מוצגת במאמר זה. פרוטוקול זה חל על פיתוח של aptamers ספציפיים לתא. הוא ישים גם לניתוחים משלימים ומאשרים נוספים של רצפי האפטמרים הזמינים בספרות. הפרוטוקול יכול לשמש גם את אלה החדשים בתחום האפטמר אשר בוחנים שימוש באפטמר שפורסם בעבר למטרות המחקר והפיתוח (מו"פ) שלהם. במאמר זה נלמדים שני רצפי אפטאמרים הזמינים בספרות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipettes</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>606180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva V9.0</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder</td>
			<td>Sigma-AldrichTM</td>
			<td>A7906-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-line Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12100046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate- Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21300025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo, LLC 10.8.1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td>SFBS-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ACS-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Megafuge 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRM-HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A37834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen- and RNase-free ultrapure water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Cell Culture flask</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>658170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TENN</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5&#8242;-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEPP</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5&#8242;-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer RNA (tRNA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8508-5X1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow cytometry-based cell surface protein binding assay for assessing selectivity and specificity of an anticancer aptamer

אתגר מרכזי בפיתוח אפטמר נגד סרטן הוא לקבוע ביעילות את הסלקטיביות והספציפיות של האפטמר המפותח לחלבון המטרה. בשל יתרונותיו הרבים על פני נוגדנים חד שבטיים, פיתוח אפטמר זכה לפופולריות עצומה בקרב חוקרי סרטן. אבולוציה שיטתית של ליגנדות על ידי העשרה מעריכית (SELEX) היא השיטה הנפוצה ביותר לפיתוח אפטמרים ספציפיים לחלבונים בעלי עניין. בעקבות SELEX, בדיקת קשירה מהירה ויעילה מאיצה את תהליך הזיהוי, ומאשרת את הסלקטיביות והספציפיות של האפטאמר. 
מאמר זה מסביר שלב אחר שלב בדיקת קשירה מבוססת ציטומטריה של אפטמר ספציפי למולקולת הידבקות תאית אפיתל (EpCAM). הגליקופרוטאין EpCAM של טרנסממברנה מתבטא יתר על המידה ברוב הקרצינומות וממלא תפקידים בייזום סרטן, התקדמות וגרורות. לכן, הוא מועמד בעל ערך למתן תרופות ממוקדות לגידולים. כדי להעריך את הסלקטיביות והספציפיות של האפטמר ל- EpCAM הקשור לממברנה, נדרשים תאים חיוביים ושליליים של EpCAM. בנוסף, נדרש אפטמר EpCAM לא מחייב עם אורך דומה ומבנה דו-ממדי (2D) לאפטמר מחייב EpCAM. בדיקת האיגוד כוללת מאגרים שונים (מאגר חוסם, מאגר כביסה, מאגר דגירה ומאגר FACS) ושלבי דגירה. 
האפטמר הוא דגירה עם קווי התא. לאחר שלבי הדגירה והשטיפה, התאים יוערכו באמצעות בדיקת ציטומטריה של זרימה רגישה. ניתוח התוצאות מראה את הקישור של האפטמר הספציפי ל- EpCAM לתאים חיוביים ל- EpCAM ולא לתאים השליליים של EpCAM. בתאים חיוביים ל-EpCAM, זה מתואר כהזזת פס בכריכה של אפטמר EpCAM מימין בהשוואה לבקרת האפטאמר הלא מחייבת. בתאים שליליים של EpCAM, הרצועות המתאימות של אפטמרים קושרי EpCAM ו--לא-מחייבים חופפים. זה מדגים את הסלקטיביות והספציפיות של אפטאמר EpCAM. בעוד שפרוטוקול זה מתמקד באפטמר EpCAM, הפרוטוקול חל על אפטאמרים אחרים שפורסמו.

היבט חשוב של גילוי ופיתוח תרופות חדשות הוא הבטחת הסלקטיביות והספציפיות של המועמד לתרופה. משמעות הדבר היא כי המועמד לתרופה צריך להיות מסוגל להפלות בין תאים שונים ולהשפיע רק על אוכלוסיית התא של עניין (סלקטיביות). סלקטיביות נחקרת באמצעות קווי תאים הנבדלים זה מזה מבחינת הביטוי של החלבון המענ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer at JoVE.com

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

צעד הכרחי בפיתוח אפטמר נגד סרטן הוא לבחון את קשירתו למטרה. אנו מדגימים בדיקה מבוססת ציטומטריה של זרימה כדי לחקור את הקשירה הזו, תוך הדגשת החשיבות של הכללת אפטמר בקרה שלילית ותאים סרטניים חיוביים או שליליים עבור אותו חלבון מסוים.

בדיקת קשירה של חלבון פני התא המבוסס על ציטומטריה של זרימה להערכת סלקטיביות וספציפיות של אפטמר אנטי-סרטני

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

פרוטוקול זה יסייע לחוקרים חדשים בעבודה עם אפטמרים כדי שיוכלו להשתמש בהם בפרויקטים שלהם וגם להבין את הצעדים הקטנים האינדיבידואליים הנדרשים להשלמת הפרוטוקול. Aptamers הם מאוד תכליתיים, ופרוטוקול זה מדגים עד כמה הם קלים ופשוטים במבחן אימונופנוטיפ. Aptamers ניתן להשתמש הן עבור יישומים אבחון וטיפול.פרוטוקול זה הוא הצעדים הראשונים שננקטו כדי לאשר את הספציפיות והרגישות שלהם. בעוד שבדיקה מסוימת זו מדגימה צביעה של קולטן פני השטח של תא אחד, aptamers יכולים בקלות רבה לשמש עבור ציטומטריה זרימה רב-פרמטרית, המספקת רמה גבוהה של ידע פנוטיפי. ההיבטים החשובים של עבודה עם aptamers הם להבטיח כי הם מקופלים כראוי לפני השימוש, וגם כי החיץ ואת תנאי הכוח היוני זהים כאשר הם נבחרו.לאחר איסוף והשלכת המדיה בבקבוקון, מוסיפים שלושה מיליליטר של PBS ומורחים אותו על התאים. לאחר הוספת מיליליטר אחד של 0.25% של טריפסין-EDTA לכל בקבוקון, דגירה במשך חמש עד 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ולדמיין את ניתוק התאים תחת מיקרוסקופ. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של מדיום שלם לתאים ופיפט את התאים למעלה ולמטה כדי ליצור תרחיף של תא בודד.לשפוך את התאים לצינור מתאים וצנטריפוגה ב-200 גרם למשך חמש דקות. לאחר השלכת הסופרנטנט, יש לתלות את התאים במיליליטר אחד של מדיום טרי ולספור את התאים באמצעות צביעה כחולה טריפאן על ידי דילול נפח מסוים של תרחיף התאים בכחול טריפאן. להפיץ כ 15 microliters של התערובת בין hemocytometer וכוס כיסוי לספור את התאים.לאסוף את המספר הנדרש של תאים, ולוודא שיש מאה אלף תאים לכל דגימת בדיקה. לאחר מכן דגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים כדי לאפשר ייצוב של החלבון המעניין על קרום התא לאחר ניתוק אנזימטי. לאחר הדגירה של שעתיים, סובבו את התאים בעוצמה של 500 גרם למשך חמש דקות.לאחר השלכת supernatant, להשעות את התאים ב 500 microliters של חסימת חיץ. דגירה של התאים בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עם ערבוב לסירוגין. במהלך דגירה זו של 30 דקות, בצע קיפול אפטמר על ידי הכנת ריכוזים כפולים של אפטמרים כמתואר בכתב היד.לאחר מכן מערבבים ומדגרים את האפטמרים עם מכונת התרמוציקלר בהתאם לתנאי הקיפול הנדרשים תוך הקפדה על הגנה על האפטמרים מפני אור. לאחר 30 דקות הדגירה, צנטריפוגה של התאים כפי שהוכח קודם לכן ולהסיר את supernatant. לאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של מאגר לשטוף צנטריפוגה את התאים שוב.לאחר הסרת supernatant, לתלות את התאים בנפח מתאים של חיץ מחייב. לאחר מכן, פיפטה 50 מיקרוליטר של התאים המחיים לתוך כל באר של צלחת קרה כקרח 96 שחור היטב. לאחר מכן פיפטה 50 מיקרוליטרים של האפטמרים על נפח של 50 מיקרוליטרים של תאים, מערבבים ודוגרים בחושך בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.לאחר הצנטריפוגה והסרת הסופרנטאנט, יש להשעות בזהירות את הכדור במאגר הכביסה ושוב את הצנטריפוגה ב-500 גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן יש להשעות ב-100 מיקרוליטרים של מאגר הכביסה לצורך ניתוח ציטומטרי של זרימה תוך חזרה על שלב השטיפה פעמיים. ראשית, הפעל את ציטומטר הזרימה ולאחר מכן את המחשב.לאחר מכן, פתח את תוכנת ניתוח ציטומטריה של זרימה, היכנס לתוכנית, ותחת הכרטיסייה ציטומטר הפעל אתחול זורם. כדי ליצור ניסוי חדש, תחת הכרטיסיה ניסוי, לחץ על תיקיה חדשה ותן שם הולם לניסוי הלוכסן של התיקיה. לחץ על התיקיה החדשה כדי להדגיש אותה.לאחר מכן, תחת הכרטיסייה ניסוי שוב, לחץ על ניסוי חדש ותן שם לניסוי בהתאם. כדי להוסיף את דגימת הלוכסן הראשונה לדוגמה, תחת הכרטיסיה ניסוי לחץ על דגימה חדשה ותן שם לדגימה בהתאם. כדי להוסיף דגימת צינור, סמן את הדגימה ותחת הכרטיסייה ניסוי, לחץ על צינור חדש.לאחר מכן הוסף את המספר המתאים של צינורות ושם. כדי להכין את הגרפים הנדרשים, תחת לשונית גליון עבודה, פתח גליון עבודה חדש. לאחר שחלון גליון העבודה החדש יופיע, הכן גרף כתם נקודות של פיזור צדדי לעומת פיזור קדימה כדי לבחור את האוכלוסייה המעניינת.הכן גרף כתם נקודה של גובה הפיזור קדימה לעומת אזור הפיזור קדימה כדי לבחור את אוכלוסיית התא הבודד. לאחר מכן, להכין היסטוגרמה של מספר האירועים נגד fluorophore של עניין. ודא שלוח המחוונים של הרכישה לשליטה ברכישת הדגימה, המפקח והציטומטר להתאמת פרמטרי המתח וכן גליון העבודה עם כל הגרפים פתוח לפני תחילת ציטומטריה של זרימה.ראשית, הפעל את התאים שלא טופלו. ודא שהחץ המצביע על הצינור ירוק. אם חץ זה אינו ירוק, לחץ על החץ כדי להפוך אותו לירוק.באמצעות פיפטה, העבירו כל דגימה מהצלחת השחורה 96 לצינור ציטומטריה של זרימה. בלוח המחוונים של הרכישה, בחר מספר מתאים של אירועים להקלטה, שנה את קצב הזרימה לנמוך ולחץ על רכוש נתונים. התאם את המתח עבור הפרמטרים FSC ו- SCC, וודא שאוכלוסיית התאים מרוכזת בתוך מתווה הנקודה ושאף תא לא נוגע באף אחד מהצירים של הגרף כדי למנוע אובדן של התאים המעניינים.הגדר את השער הראשון על ידי זיהוי ובחירת האוכלוסייה המעניינת בחלקת צפיפות מפוזרת קדימה ובצד תוך אי הכללת הפסולת, המהווה את האוכלוסייה עם אות הפיזור הקדמי הנמוך ביותר. הגדר את השער השני על-ידי אי-הכללת אוכלוסיות תאים כפולים, שכן תאים כפולים משפיעים במידה ניכרת על התוצאות והמסקנות. הגדל את מהירות הרכישה לבינונית או גבוהה כדי לנתח את הדגימות מהר יותר, אך אל תעלה על יותר מ -200 עד 300 אירועים בשנייה.לאחר מכן לחץ על נתוני רשומה. לאחר התאמת המתח וההתחמקות והקלטת הנתונים, הוצא את הדגימה ולחץ על הצינור הבא. הוסף את הדוגמה הבאה וחזור על נתוני ההקלטה עבור כל דוגמאות הבקרה והבדיקה.לאחר איסוף כל הנתונים, יש לשטוף את ציטומטר הזרימה על ידי הפעלת שלושה צינורות של 50% אקונומיקה, FACSRinse ומים אולטרה-פוריים, כל אחד במשך חמש דקות בקצב זרימה גבוה. לאחר מכן, מהתפריט הנפתח של הציטומטר, לחץ על כיבוי fluidics. ייצא את התוצאה כקבצי fsc לכונן USB להעברה.נתח אותם באמצעות תוכנת הניתוח על-ידי לחיצה על הלחצן החדש כדי ליצור מסמך וחלון חדשים לטיפול בניתוח, וגרור את הקבצים לדוגמה לחלון החדש. לחץ פעמיים כדי לפתוח את הדוגמה שלא הוכתמה. כדי לשער את אוכלוסיית התא הבודד, בחר באוכלוסיית P1 ולחץ פעמיים על אוכלוסיית P1 כדי ליצור גרף FSCH לעומת FSCA.לחץ פעמיים על התאים הבודדים המגודרים כדי ליצור היסטוגרמה של אירועים כנגד הפלואורוכרום המשמש. בחלון המקורי, בחר P1 ותאים בודדים וגרור אותם לכל הדגימות כך שכל הדגימות יכילו כעת את אותו gating. לאחר מכן, לחץ על כפתור עורך הפריסה כדי לפתוח את חלון הפריסות וגרור שתי דוגמאות זו מעל זו כדי ליצור היסטוגרמה של שכבת-על.בתאי MDA-MB-231 חיוביים ל-EpCAM, כיסוי ההיסטוגרמות המייצגות תאים שטופלו ב-TEPP וב-TENN מראה שהתאים המטופלים ב-TEPP מוסטים ימינה, בהשוואה לתאים המטופלים ב-TENN המוכיחים כי הקשירה של ה-TEPP aptamer מתרחשת לחלבון המעניין. בבקרה שלילית, תאי HEK 293T מעל כיסוי היסטוגרמות של TEPP ו- TENN אינם משקפים כל תזוזה המציינת כי בתאים המבטאים EpCAM TEPP הוא אפטמר EpCAM מחובר לקולטן שלו. יתר על כן, לא נצפתה קשירה בתאים שליליים של EpCAM, המאשרת את הסלקטיביות והספציפיות של האפטאמר המפותח.ודא שהאפטמרים מוגנים מפני אור, האפטמרים והתאים מעורבבים על הצלחת, והמתחים הנכונים מוגדרים על ציטומטר הזרימה. זה תלוי מאוד ביישומים עתידיים עבור האפטמרים. לדוגמה, אנו מתמקדים באספקת תרופות.אז השלב הבא עבורנו יהיה להעריך אם האפטמרים מופנמים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. פרוטוקול זה הדגים עד כמה קל לאפטמרים להחליף נוגדנים חד שבטיים ופוליקלונליים במבחנים אימונופנוטיפיים.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization

שיטה של ​​בידוד תא ממוקד באמצעות Functionalization משטח הזכוכית

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual ...

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

דגם פלורסנט Orthotopic עכבר של סרטן הלבלב

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

יעילות אנטי סרטנית של טיפול פוטודינמי עם ריאות חלקיקים סרטן ממוקד

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

סמים מבוססי Cytometry זרימה מערכת הסינון לצורך זיהוי מולקולות קטנות המקדמים התמיינות של תאי גזע גליובלסטומה

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

אלקטרופורזה דו-ממדית בג'ל בשילוב עם שיטות ספקטרומטר מסה על ניתוח של רקמת גידול בבלוטת יותרת המוח האנושי פרוטאום

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping של Orthotopic מאותו מין (Syngeneic) של KPC העיקרי מאתר אדנוקרצינומה Ductal הלבלב על ידי Cytometry זרימה

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Cytometry זרימה פוספו עם פלורסנט תא Barcoding עבור תא בודד איתות ניתוח וגילוי סמן

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

זיהוי בזמן אמת של הגידול Vitro תאים אפופטוזיס שנגזרות CD8+ T תאים ללמוד פונקציות החיסונית מדכא גידולים הסתננות התאים מיאלואידית

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

זרימת עבודה פשוטה הגירה/הפלישה באמצעות Imager אוטומטיות של תאים חיים

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

הערכת הכדאיות תא ומוות ב 3D בתרבויות ספרואיד של תאים סרטניים

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...