Name: a flow cytometry-based cell surface protein binding assay for assessing selectivity and specificity of an anticancer aptamer
Uploaded: 2022-09-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer at JoVE.com

Gli autori riconoscono il finanziamento SEED dell'Institute for Mental and Physical Health and Clinical Translation (IMPACT), il programma "Alfred Deakin Postdoctoral Research Fellowship" presso la Deakin University e la "Australian Government Research Training Program Scholarship".

NOTA: Prima di iniziare l'esperimento, indossare dispositivi di protezione individuale, tra cui camici da laboratorio, guanti e occhiali protettivi. Vedere la tabella dei materiali per informazioni dettagliate su materiali, reagenti, apparecchiature e software utilizzati in questo protocollo.
1. Tamponi necessari per il test
<ol><li>Preparare i tamponi necessari per questo esperimento - il tampone SELEX necessario per il ripiegamento dell'aptamero, il tampon...

<ol>
	<li>Cancer. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers</a> (2022)</li><li>Liu, J. K. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+delivery+of+therapeutics+into+the+brain:+the+potential+of+aptamers+for+targeted+delivery.">Non-invasive delivery of therapeutics into the brain: the potential of aptamers for targeted delivery.</a> Biomedicines. 8 (5), 120 (2020).</li><li>Wu, X., Chen, J., Wu, M., Zhao, J. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tissue Culture. , 395-397 (1973).</li><li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+minimum+aptamer+publication+standards+(MAPS+guidelines)+for+de+novo+aptamer+selection.">The minimum aptamer publication standards (MAPS guidelines) for de novo aptamer selection.</a> Aptamers. 6, 10-18 (2022).</li><li>Schoofs, G., Van Hout, A., D'huys, T., Schols, D., Van Loy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometry-based+assay+to+identify+compounds+that+disrupt+binding+of+fluorescently-labeled+CXC+Chemokine+ligand+12+to+CXC+Chemokine+receptor+4.">A flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled CXC Chemokine ligand 12 to CXC Chemokine receptor 4.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57271 (2018).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+an+overview.">Flow cytometry: an overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120 (1), 1-11 (2018).</li><li>Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+cell+viability+assays.">Guidelines for cell viability assays.</a> Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).</li><li>Ruscito, A., DeRosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+binding+aptamers:+Selection+strategies,+characterization,+and+applications.">Small-molecule binding aptamers: Selection strategies, characterization, and applications.</a> Frontiers in Chemistry. 4, 14 (2016).</li><li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analytical+comparison+of+strategies+used+for+small+molecule+aptamer+evaluation.">Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation.</a> Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).</li><li>Henri, J., Bayat, N., Macdonald, J., Shigdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+using+nucleic+acid+aptamers+in+cell+based+assays.">A guide to using nucleic acid aptamers in cell based assays.</a> Aptamers. 23, (2019).</li><li>Mao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+and+regularity+of+quenching+the+effect+of+bases+on+fluorophores:+the+base-quenched+probe+method.">The mechanism and regularity of quenching the effect of bases on fluorophores: the base-quenched probe method.</a> Analyst. 143 (14), 3292-3301 (2018).</li><li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+in+vitro+aptamer+selection+parameters.">Analysis of in vitro aptamer selection parameters.</a> Journal of Molecular Evolution. 81 (5), 150-161 (2015).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+negative+surface+charges+of+cancer+cells+by+multifunctional+nanoprobes.">Targeting negative surface charges of cancer cells by multifunctional nanoprobes.</a> Theranostics. 6 (11), 1887 (2016).</li><li>Shigdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+aptamers+targeting+cancer+stem+cell+marker+CD133.">RNA aptamers targeting cancer stem cell marker CD133.</a> Cancer Letters. 330 (1), 84-95 (2013).</li><li>Amraee, M., Oloomi, M., Yavari, A., Bouzari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+aptamer+identification+and+characterization+for+E.+coli+O157+detection+using+cell+based+SELEX+method.">DNA aptamer identification and characterization for E. coli O157 detection using cell based SELEX method.</a> Analytical Biochemistry. 536, 36-44 (2017).</li><li>Yu, X. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+and+characterization+of+a+novel+DNA+aptamer,+Apt-07S+specific+to+hepatocellular+carcinoma+cells.">Selection and characterization of a novel DNA aptamer, Apt-07S specific to hepatocellular carcinoma cells.</a> Drug Design, Development and Therapy. 14, 1535 (2020).</li></ol>

La sfida principale con lo sviluppo di nuovi aptameri è la mancanza di linee guida standard che si applicano alle diverse fasi di questo processo. McKeague et al. hanno recentemente dimostrato alcune delle sfide associate, che portano a presentazioni poco chiare dei dati nelle pubblicazioni e alla mancata replica della ricerca. Hanno proposto linee guida fondamentali necessarie per la caratterizzazione degli aptameri19. Un test di legame dell'aptamero è un passo fondamentale nello screening e / ...

Il cancro è ancora una delle principali cause di mortalità in tutto il mondo1. Nonostante il significativo miglioramento nel trattamento del cancro negli ultimi decenni, lo sviluppo di farmaci antitumorali è ancora un argomento molto dibattuto. Questo perché la chemioterapia, come cardine del trattamento del cancro, è accompagnata da gravi effetti collaterali che limitano la compliance del paziente al trattamento. Inoltre, la resistenza al trattamento del cancro indotta dalla chemioterapia ha limitato la sua applicazione come unica scelta di intervento medico. L'applicazione di anticorpi monoclonali (mAbs) ha introdotto una migliore risposta ai trattamenti contro il cancro2. Il razionale dell'uso di mAbs era quello di migliorare l'efficacia dei chemioterapici e ridurre al minimo le loro reazioni avverse. Tuttavia, anche la somministrazione di mAbs è diventata una sfida. Ciò non era dovuto solo alle reazioni immunologiche indotte da mAb, ma anche ai costosi costi di produzione dipendenti dagli animali e alle difficili condizionidi conservazione 3. L'introduzione degli aptameri nel 19904 ha sollevato nuove speranze nel trattamento del cancro, poiché l'applicazione degli aptameri potrebbe affrontare le sfide associate ai mAbs.
Gli aptameri sono brevi sequenze di acido nucleico prodotte specificamente per un determinato bersaglio. L'evoluzione sistematica dei ligandi mediante arricchimento esponenziale (SELEX) è un metodo comune nella produzione di aptameri In SELEX, la proteina di interesse viene incubata con una libreria di sequenze nucleotidiche casuali e, attraverso una serie di cicli iterativi, l'aptamero specifico per quella proteina viene purificato. Gli aptameri hanno selettività e specificità target simili ai mAbs, e quindi lo sviluppo di farmaci in questo campo mostra promettenti applicazioni future. Gli aptameri specifici per i biomarcatori tumorali potrebbero essere applicati come singoli farmaci e strumenti diagnostici per il cancro 5,6,7. A causa della loro struttura di dimensioni nanometriche, questi aptameri potrebbero anche agire come vettori di farmaci per fornire agenti citotossici specificamente al tumore8. Ciò aumenterebbe l'efficacia della somministrazione mirata di farmaci e ridurrebbe le reazioni avverse fuori bersaglio associate alla chemioterapia. Inoltre, questi nanofarmaci hanno un'elevata penetrazione tissutale, che li rende un candidato desiderabile per la somministrazione e il trattamento di farmaci per tumori profondi. Gli aptameri possono anche essere progettati per colpire i trasportatori espressi sulla barriera emato-encefalica (BBB) per migliorare la somministrazione di farmaci ai tumori cerebrali9. Un buon esempio di tale aptamero sono gli aptameri bifunzionali, che prendono di mira il recettore della transferrina (TfR)10 per migliorare la somministrazione del farmaco attraverso la BBB e forniscono un carico utile di farmaci citotossici alle cellule tumorali11.
Nonostante tutti i vantaggi degli aptameri, lo sviluppo di farmaci in questo campo non ha ancora prodotto un farmaco antitumorale commercializzato e di successo. Una ragione di ciò potrebbe essere la mancanza di metodi standard e riproducibili che potrebbero essere seguiti a livello globale dai ricercatori del settore. In questo articolo, viene dimostrato un protocollo passo-passo di un aptamero che si lega a una proteina nativa espressa sulla superficie cellulare. Questo protocollo è un passo prerequisito nella valutazione preclinica degli aptameri antitumorali. Il test viene eseguito per mostrare la selettività e la specificità dell'aptamero purificato raccolto da SELEX o una sequenza di aptameri pubblicata per la conferma della selettività e della specificità. Questo test basato sulla citometria a flusso è un test rapido, affidabile e sensibile che mostra accuratamente la selettività e la specificità dell'aptamero, dove l'aptamero viene testato contro le proteine sulla superficie cellulare12,13,14. Questo metodo è dimostrato utilizzando il legame di un aptamero specifico per EpCAM mostrato in questo articolo15. EpCAM, come glicoproteina transmembrana, svolge ruoli nella segnalazione, progressione, migrazione e metastasi delle cellule tumorali16,17. Per mostrare la selettività e la specificità di questo aptamero, sono state utilizzate cellule tumorali EpCAM-positive e -negative. L'aptamero specifico EpCAM precedentemente sviluppato, TEPP (5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′), e un aptamero di controllo negativo, TENN (5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3), sono stati utilizzati rispettivamente come aptameri leganti e non leganti EpCAM10. L'estremità 3' di TEPP e TENN è stata etichettata con un fluoroforo TYE665.
TEPP è un aptamero bifunzionale che ha come target EpCAM da un'estremità e TfR dall'altra. Ciò ha reso TEPP un candidato adatto per la somministrazione di farmaci ai tumori cerebrali EpCAM + . Utilizzando la sua estremità specifica per TfR, TEPP attraversa la barriera emato-encefalica e, utilizzando l'estremità specifica di EpCAM, trova il tumore e consegna il suo carico (ad esempio, farmaci citotossici) al tumore. TENN ha una lunghezza e una struttura 2D simili a TEPP, ma non ha affinità per l'EpCAM o il TfR, e quindi è un aptamero di controllo negativo adatto. Utilizzando TEPP e TENN, testare il legame di un aptamero alla proteina bersaglio usando la citometria a flusso è mostrato in questo articolo. Questo protocollo si applica allo sviluppo di aptameri cellulo-specifici. È applicabile anche a ulteriori analisi complementari e di conferma delle sequenze aptameri disponibili in letteratura. Il protocollo può essere utilizzato anche da coloro che sono nuovi nel campo degli aptameri che stanno cercando di utilizzare un aptamero precedentemente pubblicato per i loro scopi di ricerca e sviluppo (R & S). In questo articolo vengono studiate due sequenze di aptameri disponibili in letteratura.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipettes</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>606180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva V9.0</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder</td>
			<td>Sigma-AldrichTM</td>
			<td>A7906-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-line Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12100046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate- Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21300025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo, LLC 10.8.1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td>SFBS-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ACS-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Megafuge 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRM-HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A37834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen- and RNase-free ultrapure water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Cell Culture flask</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>658170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TENN</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5&#8242;-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEPP</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5&#8242;-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer RNA (tRNA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8508-5X1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow cytometry-based cell surface protein binding assay for assessing selectivity and specificity of an anticancer aptamer

Una sfida chiave nello sviluppo di un aptamero antitumorale è determinare in modo efficiente la selettività e la specificità dell'aptamero sviluppato rispetto alla proteina bersaglio. Grazie ai suoi numerosi vantaggi rispetto agli anticorpi monoclonali, lo sviluppo dell'aptamero ha guadagnato un'enorme popolarità tra i ricercatori sul cancro. L'evoluzione sistematica dei ligandi mediante arricchimento esponenziale (SELEX) è il metodo più comune per sviluppare aptameri specifici per le proteine di interesse. Dopo SELEX, un test di legame rapido ed efficiente accelera il processo di identificazione, confermando la selettività e la specificità dell'aptamero. 
Questo articolo spiega un saggio di legame basato su citometria a flusso passo-passo di un aptamero specifico per la molecola di adesione cellulare epiteliale (EpCAM). La glicoproteina transmembrana EpCAM è sovraespressa nella maggior parte dei carcinomi e svolge un ruolo nell'inizio, nella progressione e nelle metastasi del cancro. Pertanto, è un valido candidato per la somministrazione mirata di farmaci ai tumori. Per valutare la selettività e la specificità dell'aptamero all'EpCAM legato alla membrana, sono necessarie cellule EpCAM-positive e -negative. Inoltre, è richiesto un aptamero EpCAM non vincolante con una lunghezza e una struttura 2D simili all'aptamero con legame EpCAM. Il test di legame include diversi buffer (buffer di blocco, buffer di lavaggio, buffer di incubazione e buffer FACS) e fasi di incubazione. 
L'aptamero viene incubato con le linee cellulari. Dopo le fasi di incubazione e lavaggio, le cellule saranno valutate utilizzando un saggio di citometria a flusso sensibile. L'analisi dei risultati mostra il legame dell'aptamero specifico di EpCAM alle cellule EpCAM-positive e non alle cellule EpCAM-negative. Nelle celle EpCAM-positive, questo è rappresentato come uno spostamento di banda nel legame dell'aptamero EpCAM verso destra rispetto al controllo aptamero non vincolante. Nelle cellule EpCAM-negative, le bande corrispondenti di aptameri leganti e non leganti EpCAM si sovrappongono. Ciò dimostra la selettività e la specificità dell'aptamero EpCAM. Mentre questo protocollo è focalizzato sull'aptamero EpCAM, il protocollo è applicabile ad altri aptameri pubblicati.

Un aspetto importante della scoperta e dello sviluppo di nuovi farmaci è assicurare la selettività e la specificità del farmaco candidato. Ciò significa che il farmaco candidato dovrebbe essere in grado di discriminare tra cellule diverse e influenzare solo la popolazione cellulare di interesse (selettività). La selettività viene studiata utilizzando linee cellulari che differiscono in termini di espressione della proteina di interesse. In questo studio, le linee cellulari MDA-MB-231 e HEK 293T sono state scelte co...

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A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

Un passo necessario nello sviluppo dell'aptamero antitumorale è testare il suo legame con il bersaglio. Dimostriamo un saggio basato sulla citometria a flusso per studiare questo legame, sottolineando l'importanza di includere un aptamero di controllo negativo e cellule tumorali positive o negative per quella particolare proteina.

Un saggio di legame proteico della superficie cellulare basato sulla citometria a flusso per valutare la selettività e la specificità di un aptamero antitumorale

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

Questo protocollo aiuterà i ricercatori nuovi a lavorare con gli aptameri per essere in grado di usarli nei loro progetti e anche a comprendere i singoli piccoli passi necessari per completare il protocollo. Gli aptameri sono molto versatili e questo protocollo dimostra quanto siano facili e semplici in un test di immunofenotipizzazione. Gli aptameri possono essere utilizzati sia per applicazioni diagnostiche che terapeutiche.Questo protocollo è il primo passo intrapreso per confermare la loro specificità e sensibilità. Mentre questo particolare test dimostra la colorazione di un recettore della superficie cellulare, gli aptameri possono essere facilmente utilizzati per la citometria a flusso multiparametrica, fornendo un alto livello di conoscenza fenotipica. Gli aspetti importanti del lavoro con gli aptameri sono garantire che siano piegati correttamente prima dell'uso e anche che le condizioni di buffer e forza ionica siano le stesse di quando sono state selezionate.Dopo aver raccolto e scartato il supporto nel pallone, aggiungere tre millilitri di PBS e distribuirlo sulle cellule. Dopo aver aggiunto un millilitro di 0,25% di tripsina-EDTA a ciascun pallone, incubare per cinque a 10 minuti a 37 gradi Celsius e visualizzare il distacco delle cellule al microscopio. Quindi, aggiungere un millilitro di mezzo completo alle celle e pipettare le celle su e giù per creare una sospensione a cella singola.Pipettare le cellule in un tubo appropriato e centrifugare a 200 G per cinque minuti. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere le cellule in un millilitro di terreno fresco e contare le cellule usando la colorazione blu tripano diluendo un certo volume di sospensione cellulare con blu tripano. Distribuire circa 15 microlitri della miscela tra un emocitometro e un vetro di copertura per contare le cellule.Raccogliere il numero richiesto di celle, assicurandosi di avere centomila celle per campione di prova. Quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius per due ore per consentire la stabilizzazione della proteina di interesse sulla membrana cellulare a seguito del distacco enzimatico. Dopo le due ore di incubazione, centrifugare le cellule a 500 G per cinque minuti.Dopo aver scartato il surnatante, risospendere le cellule in 500 microlitri di tampone bloccante. Incubare le cellule a quattro gradi Celsius per 30 minuti con miscelazione intermittente. Durante questa incubazione di 30 minuti, eseguire il ripiegamento dell'aptamero preparando il doppio delle concentrazioni di aptameri descritte nel manoscritto.Quindi mescolare e incubare gli aptameri con la macchina termociclatrice in base alle condizioni di piegatura richieste, assicurando al contempo di proteggere gli aptameri dalla luce. Dopo l'incubazione di 30 minuti, centrifugare le cellule come dimostrato in precedenza e rimuovere il surnatante. Quindi aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio e centrifugare nuovamente le celle.Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere le celle in un volume adeguato del buffer di legame. Quindi, pipettare 50 microlitri delle celle risospese in ciascun pozzetto di una lastra nera ghiacciata da 96 pozzetti. Quindi pipettare 50 microlitri di aptameri su un volume di 50 microlitri di cellule, mescolare e incubare al buio a quattro gradi Celsius per 30 minuti.Dopo la centrifuga e la rimozione del surnatante, risospendere accuratamente il pellet nel tampone di lavaggio e centrifugare nuovamente a 500 G per cinque minuti. Quindi risospendere in 100 microlitri di tampone di lavaggio per l'analisi citometrica a flusso ripetendo la fase di lavaggio due volte. Innanzitutto, accendi il citometro a flusso e poi il computer.Quindi, apri il software di analisi della citometria a flusso, accedi al programma e nella scheda del citometro esegui l'avvio del fluido. Per creare un nuovo esperimento, nella scheda dell'esperimento fare clic su nuova cartella e assegnare al esperimento la barra assegna il nome appropriato. Fare clic sulla nuova cartella per evidenziarla.Quindi, nella scheda dell'esperimento, fai di nuovo clic su nuovo esperimento e assegna al esperimento il nome appropriato. Per aggiungere il primo campione barra, nella scheda dell'esperimento fare clic su nuovo campione e assegnare al campione il nome appropriato. Per aggiungere un campione di provetta, evidenziare il campione e nella scheda dell'esperimento, fare clic su nuovo tubo.Quindi aggiungere il numero appropriato di tubi e il nome. Per preparare i grafici necessari, in una scheda del foglio di lavoro aprire un nuovo foglio di lavoro. Una volta visualizzata la nuova finestra del foglio di lavoro, preparare un grafico a macchie di punti della dispersione laterale rispetto alla dispersione in avanti per selezionare la popolazione di interesse.Preparare un grafico a punti macchia dell'altezza di dispersione diretta rispetto all'area di dispersione diretta per selezionare la popolazione di singole celle. Quindi, preparare un istogramma del numero di eventi rispetto al fluoroforo di interesse. Assicurarsi che il cruscotto di acquisizione per il controllo dell'acquisizione del campione, dell'ispettore e del citometro per regolare i parametri di tensione e il foglio di lavoro con tutti i grafici siano aperti prima di iniziare la citometria a flusso.Innanzitutto, eseguire le cellule non trattate. Assicurati che la freccia che punta al tubo sia verde. Se questa freccia non è verde, fare clic sulla freccia per renderla verde.Utilizzando la pipetta, trasferire ogni campione dalla piastra nera a 96 pozzetti a un tubo di citometria a flusso. Nel dashboard di acquisizione, scegliere un numero appropriato di eventi da registrare, impostare la portata su bassa e fare clic su Acquisisci dati. Regolare la tensione per i parametri FSC e SCC, assicurandosi che la popolazione di celle sia centralizzata all'interno del dot plot e che nessuna cella tocchi entrambi gli assi del grafico per evitare di perdere le celle di interesse.Definire la prima porta identificando e selezionando la popolazione di interesse in un grafico di densità diffusa in avanti e lateralmente escludendo i detriti, che costituiscono la popolazione con il segnale di dispersione diretta più basso. Definire il secondo gate escludendo le popolazioni di cellule doppiette, poiché le cellule doppiette influenzano considerevolmente i risultati e le conclusioni. Aumentare la velocità di acquisizione a media o alta per analizzare i campioni più velocemente, ma non superare più di 200-300 eventi al secondo.Quindi fare clic su registra dati. Dopo aver regolato la tensione e il gating e registrato i dati, estrarre il campione e fare clic su Next Tube. Inserire il campione successivo e ripetere i dati di registrazione per tutti i campioni di controllo e di prova.Una volta raccolti tutti i dati, lavare il citometro a flusso facendo funzionare tre tubi di candeggina al 50%, FACSRinse e acqua ultrapura, ciascuno per cinque minuti ad alta portata. Quindi, dal menu a discesa del citometro, fare clic su fluidics shutdown. Esporta il risultato come file fsc su un'unità USB da trasferire.Analizzarli utilizzando il software di analisi premendo il nuovo pulsante per creare un nuovo documento e una finestra per gestire l'analisi e trascinare i file di esempio nella nuova finestra. Fare doppio clic per aprire il campione non macchiato. Per controllare la popolazione a cella singola, scegliere la popolazione P1 e fare doppio clic sulla popolazione P1 per creare un grafico FSCH rispetto a FSCA.Fare doppio clic sulle singole celle gated per creare un istogramma di eventi rispetto al fluorocromo utilizzato. Nella finestra originale selezionare P1 e celle singole e trascinarle su tutti i campioni in modo che tutti i campioni contengano ora lo stesso gating. Quindi, fai clic sul pulsante dell'editor di layout per aprire la finestra dei layout e trascina due esempi uno sull'altro per creare un istogramma sovrapposto.Nelle cellule MDA-MB-231 positive all'EpCAM, la sovrapposizione degli istogrammi che rappresentano le cellule trattate con TEPP e TENN mostra che le cellule trattate con TEPP sono spostate verso destra, rispetto alle cellule trattate con TENN dimostrando che il legame dell'aptamero TEPP avviene alla proteina di interesse. Nel controllo negativo, le cellule HEK 293T sovrapposte agli istogrammi di TEPP e TENN non riflettono alcuno spostamento indicando che nelle cellule che esprimono EpCAM TEPP è l'aptamero EpCAM attaccato al suo recettore. Inoltre, non è stato osservato alcun legame nelle cellule EpCAM negative, il che conferma la selettività e la specificità dell'aptamero sviluppato.Assicurarsi che gli aptameri siano protetti dalla luce, che gli aptameri e le cellule siano miscelati sulla piastra e che le tensioni corrette siano impostate sul citometro a flusso. Questo dipende fortemente dalle future applicazioni per gli aptameri. Ad esempio, ci concentriamo sulla somministrazione di farmaci.Quindi il prossimo passo per noi sarebbe valutare se gli aptameri sono internalizzati usando la microscopia fluorescente. Questo protocollo ha dimostrato quanto sia facile per gli aptameri sostituire gli anticorpi monoclonali e policlonali nei saggi di immunofenotipizzazione.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization

Un metodo di isolamento delle cellule mirata tramite Glass funzionalizzazione superficiale

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Fluorescente ortotopico modello murino di cancro al pancreas

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

Anticancro Efficacia della terapia fotodinamica con cancro del polmone con targeting nanoparticelle

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Farmaco a base di citometria a flusso sistema di Screening per l'identificazione di piccole molecole che promuovono la differenziazione cellulare delle cellule staminali di Glioblastoma

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

Elettroforesi bidimensionale accoppiata con spettrometria di massa per un'analisi del proteoma di tessuto umano Adenoma pituitario

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping di Orthotopic omotrapianto (Syngeneic) dell'Adenocarcinoma Ductal pancreatico murino primario KPC tramite flusso Cytometry

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Citometria a flusso di phospho con codici a barre fluorescenti cella per cella singola segnalazione analisi e scoperta del biomarcatore

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Rilevazione in tempo reale nell'apoptosi delle cellule tumorali in Vitro indotta da CD8+ T cellule per studiare funzioni immuni soppressive di tumore-infiltrazione di cellule mieloidi

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Un flusso di lavoro semplice migrazione/invasione utilizzando un Imager di vivere-cella automatizzata

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Valutare la vitalità cellulare e la morte nelle colture di sferoidi 3D delle cellule tumorali

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...