Name: a flow cytometry-based cell surface protein binding assay for assessing selectivity and specificity of an anticancer aptamer
Uploaded: 2022-09-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer at JoVE.com

著者らは、心身の健康と臨床翻訳研究所(IMPACT)SEEDの資金提供、ディーキン大学の「アルフレッドディーキンポスドク研究フェローシップ」プログラム、および「オーストラリア政府研究トレーニングプログラム奨学金」を認めています。

注意: 実験を開始する前に、白衣、手袋、ゴーグルなどの個人用保護具を着用してください。このプロトコルで使用される材料、試薬、機器、およびソフトウェアの詳細については、 材料の表 を参照してください。
1. アッセイに必要なバッファー
<ol><li>この実験に必要なバッファーであるアプタマーフォールディングに必要なSELEXバッファー?...

<ol>
	<li>Cancer. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers</a> (2022)</li><li>Liu, J. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+monoclonal+antibody+development+-+Progress,+remaining+challenges+and+future+innovations.">The history of monoclonal antibody development - Progress, remaining challenges and future innovations.</a> Annals of Medicine and Surgery. 3 (4), 113-116 (2014).</li><li>Nakhjavani, M., Shigdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+of+PD-1/PD-L1+axis+modulation+for+the+treatment+of+triple-negative+breast+cancer.">Future of PD-1/PD-L1 axis modulation for the treatment of triple-negative breast cancer.</a> Pharmacological Research. 175, 106019 (2022).</li><li>Bukari, B., Samarasinghe, R. M., Noibanchong, J., Shigdar, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+delivery+of+therapeutics+into+the+brain:+the+potential+of+aptamers+for+targeted+delivery.">Non-invasive delivery of therapeutics into the brain: the potential of aptamers for targeted delivery.</a> Biomedicines. 8 (5), 120 (2020).</li><li>Wu, X., Chen, J., Wu, M., Zhao, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers:+active+targeting+ligands+for+cancer+diagnosis+and+therapy.">Aptamers: active targeting ligands for cancer diagnosis and therapy.</a> Theranostics. 5 (4), 322 (2015).</li><li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aptamer+functionalized+nanocomposite+used+for+prostate+cancer+diagnosis+and+therapy.">The aptamer functionalized nanocomposite used for prostate cancer diagnosis and therapy.</a> Journal of Nanomaterials. 2022, (2022).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+aptamer-based+biomarker+discovery.">Advances in aptamer-based biomarker discovery.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 571 (2021).</li><li>Ashrafuzzaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers+as+both+drugs+and+drug-carriers.">Aptamers as both drugs and drug-carriers.</a> BioMed Research International. 2014, (2014).</li><li>Nakhjavani, M., Samarasinghe, R. M., Shigdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple-negative+breast+cancer+brain+metastasis:+an+update+on+druggable+targets,+current+clinical+trials,+and+future+treatment+options.">Triple-negative breast cancer brain metastasis: an update on druggable targets, current clinical trials, and future treatment options.</a> Drug Discovery Today. , (2022).</li><li>Macdonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+bifunctional+aptamer+targeting+the+transferrin+receptor+and+epithelial+cell+adhesion+molecule+(EpCAM)+for+the+treatment+of+brain+cancer+metastases.">Development of a bifunctional aptamer targeting the transferrin receptor and epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) for the treatment of brain cancer metastases.</a> ACS Chemical Neuroscience. 8 (4), 777-784 (2017).</li><li>Macdonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifunctional+aptamer-doxorubicin+conjugate+crosses+the+blood-brain+barrier+and+selectively+delivers+its+payload+to+EpCAM-positive+tumor+cells.">Bifunctional aptamer-doxorubicin conjugate crosses the blood-brain barrier and selectively delivers its payload to EpCAM-positive tumor cells.</a> Nucleic Acid Therapeutics. 30 (2), 117-128 (2020).</li><li>Shigdar, S., Agnello, L., Fedele, M., Camorani, S., Cerchia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+cancer+cells+by+cell-SELEX:+use+of+aptamers+for+discovery+of+actionable+biomarkers+and+therapeutic+applications+thereof.">Profiling cancer cells by cell-SELEX: use of aptamers for discovery of actionable biomarkers and therapeutic applications thereof.</a> Pharmaceutics. 14 (1), 28 (2021).</li><li>Rahimizadeh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell-specific+aptamers:+recent+advances+and+insight+into+the+selection+procedures.">Development of cell-specific aptamers: recent advances and insight into the selection procedures.</a> Molecules. 22 (12), 2070 (2017).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell-SELEX+technology+and+its+application+in+cancer+diagnosis+and+therapy.">Development of cell-SELEX technology and its application in cancer diagnosis and therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (12), 2079 (2016).</li><li>Shigdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+sensitive+chemical+antibodies+for+diagnosis:+detection+of+low+levels+of+EpCAM+in+breast+cancer.">The use of sensitive chemical antibodies for diagnosis: detection of low levels of EpCAM in breast cancer.</a> PLoS One. 8 (2), 57613 (2013).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+EpCAM+(CD326)+in+prostate+cancer+metastasis+and+progression.">Role of the EpCAM (CD326) in prostate cancer metastasis and progression.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 31 (3), 779-791 (2012).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+adhesion+molecule+(EpCAM)+is+associated+with+prostate+cancer+metastasis+and+chemo/radioresistance+via+the+PI3K/Akt/mTOR+signaling+pathway.">Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) is associated with prostate cancer metastasis and chemo/radioresistance via the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 45 (12), 2736-2748 (2013).</li><li>McKeague, M., Kruse, P. F., Patterson, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tissue Culture. , 395-397 (1973).</li><li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+minimum+aptamer+publication+standards+(MAPS+guidelines)+for+de+novo+aptamer+selection.">The minimum aptamer publication standards (MAPS guidelines) for de novo aptamer selection.</a> Aptamers. 6, 10-18 (2022).</li><li>Schoofs, G., Van Hout, A., D'huys, T., Schols, D., Van Loy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometry-based+assay+to+identify+compounds+that+disrupt+binding+of+fluorescently-labeled+CXC+Chemokine+ligand+12+to+CXC+Chemokine+receptor+4.">A flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled CXC Chemokine ligand 12 to CXC Chemokine receptor 4.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57271 (2018).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+an+overview.">Flow cytometry: an overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120 (1), 1-11 (2018).</li><li>Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+cell+viability+assays.">Guidelines for cell viability assays.</a> Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).</li><li>Ruscito, A., DeRosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+binding+aptamers:+Selection+strategies,+characterization,+and+applications.">Small-molecule binding aptamers: Selection strategies, characterization, and applications.</a> Frontiers in Chemistry. 4, 14 (2016).</li><li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analytical+comparison+of+strategies+used+for+small+molecule+aptamer+evaluation.">Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation.</a> Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).</li><li>Henri, J., Bayat, N., Macdonald, J., Shigdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+using+nucleic+acid+aptamers+in+cell+based+assays.">A guide to using nucleic acid aptamers in cell based assays.</a> Aptamers. 23, (2019).</li><li>Mao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+and+regularity+of+quenching+the+effect+of+bases+on+fluorophores:+the+base-quenched+probe+method.">The mechanism and regularity of quenching the effect of bases on fluorophores: the base-quenched probe method.</a> Analyst. 143 (14), 3292-3301 (2018).</li><li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+in+vitro+aptamer+selection+parameters.">Analysis of in vitro aptamer selection parameters.</a> Journal of Molecular Evolution. 81 (5), 150-161 (2015).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+negative+surface+charges+of+cancer+cells+by+multifunctional+nanoprobes.">Targeting negative surface charges of cancer cells by multifunctional nanoprobes.</a> Theranostics. 6 (11), 1887 (2016).</li><li>Shigdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+aptamers+targeting+cancer+stem+cell+marker+CD133.">RNA aptamers targeting cancer stem cell marker CD133.</a> Cancer Letters. 330 (1), 84-95 (2013).</li><li>Amraee, M., Oloomi, M., Yavari, A., Bouzari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+aptamer+identification+and+characterization+for+E.+coli+O157+detection+using+cell+based+SELEX+method.">DNA aptamer identification and characterization for E. coli O157 detection using cell based SELEX method.</a> Analytical Biochemistry. 536, 36-44 (2017).</li><li>Yu, X. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+and+characterization+of+a+novel+DNA+aptamer,+Apt-07S+specific+to+hepatocellular+carcinoma+cells.">Selection and characterization of a novel DNA aptamer, Apt-07S specific to hepatocellular carcinoma cells.</a> Drug Design, Development and Therapy. 14, 1535 (2020).</li></ol>

新しいアプタマーを開発する際の重要な課題は、このプロセスのさまざまなステップに適用される標準的なガイドラインがないことです。McKeagueらは最近、関連する課題のいくつかを実証し、出版物でのデータの不明確な提示と研究の複製の失敗につながりました。彼らは、アプタマー19を特徴づける際に考慮するために必要な基本的なガイドラインを提案した。アプタマー...

がんは依然として世界中の主要な死亡原因の1つです1。ここ数十年で癌治療が大幅に改善されたにもかかわらず、抗癌剤の開発は依然として非常に議論されているトピックです。これは、がん治療の主力である化学療法には、患者の治療へのコンプライアンスを制限する重篤な副作用が伴うためです。さらに、化学療法誘発性癌治療に対する耐性は、医学的介入の唯一の選択肢としてのその適用を制限している。モノクローナル抗体(mAb)の適用により、がん治療に対する反応が増強されました2。モノクローナル抗体を使用する理論的根拠は、化学療法薬の有効性を改善し、その副作用を最小限に抑えることでした。.しかし、モノクローナル抗体の投与も課題となりました。これは、mAbによる免疫反応だけでなく、動物に依存して高価な製造コストと困難な保管条件によるものでした3。1990年代のアプタマーの導入4 は、アプタマーの適用がモノクローナル抗体に関連する課題に対処できるため、癌治療に新たな希望をもたらしました。
アプタマーは、特定の標的に対して特異的に産生される短い核酸配列です。指数関数的濃縮(SELEX)によるリガンドの系統的進化は、アプタマー生産における一般的な方法です。SELEXでは、目的のタンパク質をランダムなヌクレオチド配列のライブラリとともにインキュベートし、一連の反復サイクルを経て、そのタンパク質に特異的なアプタマーを精製します。アプタマーはモノクローナル抗体と同様の標的選択性・特異性を有しており、この分野の医薬品開発は有望な応用が期待されています。がんバイオマーカーに特異的なアプタマーは、単剤およびがん診断ツールとして適用できます5、6、7。ナノサイズの構造により、これらのアプタマーは、細胞傷害性物質を腫瘍に特異的に送達するための薬物キャリアとしても作用する可能性があります8。これにより、標的薬物送達の有効性が高まり、化学療法に関連するオフターゲットの副作用が減少します。.さらに、これらのナノ医薬品は組織浸透率が高いため、深部腫瘍の薬物送達および治療の望ましい候補となります。アプタマーは、血液脳関門(BBB)上に発現するトランスポーターを標的にして、脳腫瘍への薬物送達を改善するように設計することもできる9。このようなアプタマーの良い例は、トランスフェリン受容体(TfR)10 を標的にしてBBB全体の薬物送達を増強し、細胞傷害性薬物ペイロードを腫瘍細胞に送達する二機能性アプタマーである11。
アプタマーのすべての利点にもかかわらず、この分野での医薬品開発はまだ市販され、成功した抗がん剤を生み出していません。この理由の1つは、この分野の研究者が世界的に従うことができる標準的で再現可能な方法の欠如である可能性があります。この論文では、細胞表面に発現する天然タンパク質に結合するアプタマーの段階的なプロトコルが実証されています。このプロトコルは、抗がんアプタマーの前臨床評価における前提条件ステップです。アッセイは、選択性および特異性の確認のためにSELEXまたは公表されたアプタマー配列から収集された精製アプタマーの選択性および特異性を示すために行われる。このフローサイトメトリーベースのアッセイは、アプタマーの選択性と特異性を正確に示す迅速で信頼性の高い高感度アッセイであり、アプタマーは細胞表面のタンパク質に対してテストされています12、13、14。この方法は、この論文15に示すEpCAMに特異的なアプタマーの結合を用いて実証される。膜貫通糖タンパク質としてのEpCAMは、腫瘍細胞のシグナル伝達、進行、遊走、および転移において役割を果たします16,17。このアプタマーの選択性と特異性を示すために、EpCAM陽性および陰性の癌細胞を使用した。以前に開発されたEpCAM特異的アプタマーであるTEPP(5′-GC GCG GTAC CGC GC TAACG GA GGTTGCG TCC GT-3′)および陰性対照アプタマーであるTENN(5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3)を、それぞれEpCAM結合性アプタマーおよび非結合性アプタマーとして用いた10。TEPPおよびTENNの両方の3'末端をTYE665フルオロフォアで標識した。
TEPPは、一方の端からEpCAMを、もう一方の端からTfRを標的とする二機能性アプタマーです。これにより、TEPPはEpCAM+ 脳腫瘍への薬物送達に適した候補となっています。TEPPは、そのTfR特異的末端を使用して血液脳関門を横断し、EpCAM特異的末端を使用して腫瘍を発見し、その貨物(細胞傷害性薬物など)を腫瘍に送達する。TENNはTEPPと同様の長さと2D構造を持っていますが、EpCAMやTfRに親和性がないため、適切なネガティブコントロールアプタマーです。TEPPとTENNを用いて、フローサイトメトリーを用いてアプタマーの標的タンパク質への結合を試験する試験を本論文に示します。このプロトコルは、細胞特異的アプタマーの開発に適用されます。また、文献で入手可能なアプタマー配列のさらなる相補的および確認的解析にも適用可能である。このプロトコルは、以前に公開されたアプタマーを研究開発(R&D)目的で使用することを検討しているアプタマー分野の初心者にも使用できます。この論文では、文献で利用可能な2つのアプタマー配列を研究しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipettes</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>606180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva V9.0</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder</td>
			<td>Sigma-AldrichTM</td>
			<td>A7906-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-line Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12100046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate- Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21300025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo, LLC 10.8.1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td>SFBS-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ACS-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Megafuge 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRM-HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A37834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen- and RNase-free ultrapure water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Cell Culture flask</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>658170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TENN</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5&#8242;-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEPP</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5&#8242;-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer RNA (tRNA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8508-5X1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow cytometry-based cell surface protein binding assay for assessing selectivity and specificity of an anticancer aptamer

抗がんアプタマーの開発における重要な課題は、開発したアプタマーの標的タンパク質に対する選択性と特異性を効率的に決定することです。モノクローナル抗体に比べていくつかの利点があるため、アプタマーの開発は癌研究者の間で絶大な人気を得ています。指数関数的濃縮(SELEX)によるリガンドの系統的進化は、目的のタンパク質に特異的なアプタマーを開発する最も一般的な方法です。SELEXに続いて、迅速かつ効率的な結合アッセイにより同定プロセスが加速され、アプタマーの選択性と特異性が確認されます。 
この論文では、上皮細胞接着分子(EpCAM)に特異的なアプタマーの段階的なフローサイトメトリーベースの結合アッセイについて説明します。膜貫通糖タンパク質EpCAMは、ほとんどの癌腫で過剰発現しており、癌の開始、進行、および転移に役割を果たしています。したがって、腫瘍への標的薬物送達の貴重な候補です。膜結合型EpCAMに対するアプタマーの選択性および特異性を評価するには、EpCAM陽性および陰性細胞が必要である。さらに、EpCAM結合アプタマーと同様の長さおよび2次元(2D)構造を有する非結合EpCAMアプタマーが必要である。結合アッセイには、異なるバッファー(ブロッキングバッファー、洗浄バッファー、インキュベーションバッファー、およびFACSバッファー)およびインキュベーションステップが含まれます。 
アプタマーは細胞株と共にインキュベートされる。インキュベーションおよび洗浄ステップに続いて、細胞は高感度フローサイトメトリーアッセイを使用して評価されます。結果の分析は、EpCAM特異的アプタマーのEpCAM陰性細胞ではなくEpCAM陽性細胞への結合を示す。EpCAM陽性細胞では、これは、非結合アプタマー対照と比較して、EpCAMアプタマーの右への結合におけるバンドシフトとして描かれる。EpCAM陰性細胞では、EpCAM結合アプタマーおよび非結合アプタマーの対応するバンドが重複する。これは、EpCAMアプタマーの選択性と特異性を示しています。このプロトコルはEpCAMアプタマーに焦点を当てていますが、このプロトコルは他の公開されているアプタマーにも適用できます。

新薬の発見と開発の重要な側面は、医薬品候補の選択性と特異性を保証することです。これは、薬剤候補が異なる細胞を識別でき、目的の細胞集団にのみ影響を与えることができる必要があることを意味します(選択性)。選択性は、目的のタンパク質の発現に関して異なる細胞株を用いて研究される。この研究では、MDA-MB-231およびHEK 293T細胞株をEpCAM陽性および陰性細胞として選択した。特異...

Watch this Scientific Journal Video about A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer at JoVE.com

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

抗がんアプタマー開発に必要なステップは、標的への結合をテストすることです。この結合を研究するためのフローサイトメトリーベースのアッセイを実証し、ネガティブコントロールのアプタマーとその特定のタンパク質に対して陽性または陰性の癌細胞を含めることの重要性を強調しています。

抗がんアプタマーの選択性と特異性を評価するためのフローサイトメトリーベースの細胞表面タンパク質結合アッセイ

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

このプロトコルは、アプタマーを初めて使用する研究者がプロジェクトでアプタマーを使用できるようにし、プロトコルを完了するために必要な個々の小さなステップを理解するのに役立ちます。アプタマーは非常に汎用性が高く、このプロトコルは、イムノフェノタイピングアッセイにおいてアプタマーがいかに簡単でシンプルであるかを示しています。アプタマーは、診断用途と治療用途の両方に使用できます。このプロトコルは、それらの特異性と感度を確認するために行われる最初のステップです。この特定のアッセイは1つの細胞表面受容体の染色を示していますが、アプタマーはマルチパラメトリックフローサイトメトリーに非常に簡単に使用でき、表現型の高度な知識を提供します。アプタマーを使用する上で重要な側面は、使用前にアプタマーが正しく折り畳まれていること、およびバッファーとイオン強度の条件が選択されたときと同じであることを確認することです。フラスコ内の培地を集めて廃棄した後、3ミリリットルのPBSを加えて細胞全体に広げます。各フラスコに1ミリリットルの0.25%のトリプシン-EDTAを加えた後、摂氏37度で5〜10分間インキュベートし、顕微鏡下で細胞の剥離を視覚化します。次に、1ミリリットルの完全培地を細胞に加え、細胞を上下にピペットで動かして単一細胞懸濁液を作ります。細胞を適切なチューブにピペットで入れ、200 Gで5分間遠心分離します。上清を廃棄した後、細胞を1ミリリットルの新鮮な培地に再懸濁し、一定量の細胞懸濁液をトリパンブルーで希釈することにより、トリパンブルー染色を使用して細胞をカウントします。血球計算盤とカバーガラスの間に約15マイクロリットルの混合物を分配して、細胞を数えます。必要な数の細胞を収集し、テストサンプルごとに10万個の細胞があることを確認します。次に、細胞を摂氏37度で2時間インキュベートし、酵素剥離後の細胞膜上の目的のタンパク質の安定化を可能にします。2時間のインキュベーションの後、細胞を500 Gで5分間遠心分離します。上清を廃棄した後、細胞を500マイクロリットルのブロッキングバッファーに再懸濁します。細胞を摂氏4度で30分間、断続的に混合しながらインキュベートします。この30分間のインキュベーションの間に、原稿に記載されているように2倍の濃度のアプタマーを調製することによりアプタマーフォールディングを行う。次に、アプタマーを光から確実に保護しながら、必要な折り畳み条件に従ってサーモサイクラーマシンとアプタマーを混合してインキュベートします。30分間のインキュベーションの後、前に実証したように細胞を遠心分離し、上清を除去します。次に、1ミリリットルの洗浄バッファーを追加し、細胞を再度遠心分離します。上清を除去した後、細胞を適切な容量の結合バッファーに再懸濁する。次に、再懸濁した細胞50マイクロリットルを氷冷96ウェルブラックプレートの各ウェルにピペットで入れる。次に、50マイクロリットルのアプタマーを50マイクロリットルの細胞にピペットで移し、混合し、摂氏4度の暗所で30分間インキュベートします。遠心分離して上清を除去した後、ペレットを洗浄バッファーに注意深く再懸濁し、再び500Gで5分間遠心分離します。その後、洗浄ステップを2回繰り返しながら、フローサイトメトリー分析のために100マイクロリットルの洗浄バッファーに再懸濁します。まず、フローサイトメーターの電源を入れ、次にコンピューターの電源を入れます。次に、フローサイトメトリー分析ソフトウェアを開き、プログラムにログインし、サイトメータータブで流体の起動を実行します。新しい実験を作成するには、[実験] タブで [新しいフォルダー] をクリックし、フォルダーに "実験" という名前を適切に付けます。新しいフォルダをクリックして強調表示します。次に、もう一度 [実験] タブで [新しい実験] をクリックし、実験に適切な名前を付けます。最初のサンプルスラッシュ標本を追加するには、実験タブで新しい標本をクリックし、標本に適切な名前を付けます。チューブサンプルを追加するには、検体をハイライト表示し、実験タブで新しいチューブをクリックします。次に、適切な数のチューブと名前を追加します。必要なグラフを準備するには、ワークシートタブで新しいワークシートを開きます。新しいワークシートウィンドウが表示されたら、側方散乱と前方散乱のドットブロットグラフを準備して、目的の母集団を選択します。前方散乱高さ対前方散乱領域のドットブロットグラフを準備して、単一細胞集団を選択します。次に、目的の蛍光色素に対するイベント数のヒストグラムを作製します。フローサイトメトリーを開始する前に、サンプル取得を制御するための取得ダッシュボード、電圧パラメータを調整するためのインスペクターとサイトメーター、およびすべてのグラフを含むワークシートが開いていることを確認してください。まず、未処理の細胞を実行します。チューブを指す矢印が緑色であることを確認してください。この矢印が緑色でない場合は、矢印をクリックして緑色にします。ピペットを使用して、各サンプルを96ウェルブラックプレートからフローサイトメトリーチューブに移します。集録ダッシュボードで、記録するイベントの適切な数を選択し、流量を低に変更して、[データの取得]をクリックします。FSCおよびSCCパラメータの電圧を調整し、細胞集団がドットプロット内で集中し、目的の細胞が失われないように、グラフのどちらの軸にも細胞が接触しないようにします。前方散乱および側方散乱密度プロットで対象の母集団を特定して選択し、前方散乱信号が最も低い母集団を構成する破片を除外して、最初のゲートを定義します。ダブレット細胞は結果と結論に大きな影響を与えるため、ダブレット細胞集団を除外して2番目のゲートを定義します。取得速度を中または高に上げてサンプルをより速く分析しますが、毎秒200〜300イベントを超えないようにしてください。次に、[データの記録] をクリックします。電圧を調整し、データをゲーティングして記録した後、サンプルを取り出し、[次のチューブ]をクリックします。次のサンプルを挿入し、すべてのコントロールサンプルとテストサンプルのデータの記録を繰り返します。すべてのデータが収集されたら、50%漂白剤、FACSRinse、超純水の3本のチューブをそれぞれ高流量で5分間流して、フローサイトメーターを洗浄します。次に、サイトメーターのドロップダウンメニューから、[流路系シャットダウン]をクリックします。結果をfscファイルとしてUSBドライブにエクスポートして転送します。[新規]ボタンを押して分析ソフトウェアを使用して分析し、分析を処理するための新しいドキュメントとウィンドウを作成し、サンプルファイルを新しいウィンドウにドラッグします。ダブルクリックして、染色されていないサンプルを開きます。単一細胞集団をゲートするには、P1集団を選択し、P1集団をダブルクリックしてFSCH対FSCAグラフを作成します。ゲートされた単一セルをダブルクリックして、使用されている蛍光色素に対するイベントのヒストグラムを作成します。元のウィンドウでP1と単一セルを選択し、それらをすべてのサンプルにドラッグして、すべてのサンプルに同じゲーティングが含まれるようにします。次に、レイアウトエディターボタンをクリックしてレイアウトウィンドウを開き、2つのサンプルを互いにドラッグしてオーバーレイヒストグラムを作成します。EpCAM陽性MDA-MB-231細胞において、TEPPおよびTENNで処理された細胞を表すヒストグラムを重ね合わせることは、TEPP処理された細胞が右にシフトしていることを示し、TENN処理された細胞と比較して、TEPPアプタマーの目的のタンパク質への結合が起こることを実証する。陰性対照において、TEPPおよびTENNのヒストグラムを重ね合わせたHEK 293T細胞は、EpCAM発現細胞においてTEPPがその受容体に結合したEpCAMアプタマーであることを示すいかなるシフトも反映しない。さらに、EpCAM陰性細胞では結合は観察されず、開発されたアプタマーの選択性と特異性が確認されました。アプタマーが光から保護され、アプタマーと細胞がプレート上で混合され、フローサイトメーターに正しい電圧が設定されていることを確認します。これは、アプタマーの将来のアプリケーションに大きく依存します。たとえば、私たちはドラッグデリバリーに焦点を当てています。したがって、次のステップは、蛍光顕微鏡を使用してアプタマーが内在化されているかどうかを評価することです。このプロトコルは、イムノフェノタイピングアッセイにおいて、アプタマーがモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を置き換えることがいかに簡単であるかを実証しています。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization

ガラスの表面機能を介して、標的細胞の単離方法

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual ...

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

膵臓がんの蛍光同所性マウスモデル

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

肺癌標的化ナノ粒子と光線力学療法の抗がん効能

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

流れの Cytometry ベースの医薬品スクリーニング システム神経膠芽腫幹細胞の細胞分化を促進する小さい分子の同定に関する研究

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

ひと下垂体腺腫の組織のプロテオームの分析のための質量分析法と相まって二次元ゲル電気泳動

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

同所性同種 (同系) マウスのプライマリ KPC 膵管腺癌のフローサイトメトリーによる診療

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

単一細胞解析、バイオ マーカー探索をシグナル蛍光セル バーコードとリン フローサイトメトリー

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

CD8 による培養腫瘍細胞のアポトーシスのリアルタイム検出+ T 細胞腫瘍浸潤骨髄細胞の免疫抑制機能を勉強するには

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

自動生細胞固体撮像素子を使用して単純な移行/侵略ワークフロー

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

癌細胞の3Dスフェロイド培養における細胞生存率と死の評価

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...