Name: a flow cytometry-based cell surface protein binding assay for assessing selectivity and specificity of an anticancer aptamer
Uploaded: 2022-09-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer at JoVE.com

저자는 정신 및 신체 건강 및 임상 번역 연구소 (IMPACT) SEED 기금, 디킨 대학의 "Alfred Deakin 박사후 연구 펠로우십"프로그램 및 "호주 정부 연구 훈련 프로그램 장학금"을 인정합니다.

알림: 실험을 시작하기 전에 실험실 코트, 장갑 및 고글을 포함한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 이 프로토콜에 사용되는 재료, 시약, 장비 및 소프트웨어에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 분석에 필요한 완충액
<ol><li>본 실험에 필요한 완충액인 압타머 폴딩에 필요한 SELEX 완충액, 블로킹 완충액(BB), 세척 완충액(WB) 및 결합 완충액...

<ol>
	<li>Cancer. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers</a> (2022)</li><li>Liu, J. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+monoclonal+antibody+development+-+Progress,+remaining+challenges+and+future+innovations.">The history of monoclonal antibody development - Progress, remaining challenges and future innovations.</a> Annals of Medicine and Surgery. 3 (4), 113-116 (2014).</li><li>Nakhjavani, M., Shigdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+of+PD-1/PD-L1+axis+modulation+for+the+treatment+of+triple-negative+breast+cancer.">Future of PD-1/PD-L1 axis modulation for the treatment of triple-negative breast cancer.</a> Pharmacological Research. 175, 106019 (2022).</li><li>Bukari, B., Samarasinghe, R. M., Noibanchong, J., Shigdar, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+delivery+of+therapeutics+into+the+brain:+the+potential+of+aptamers+for+targeted+delivery.">Non-invasive delivery of therapeutics into the brain: the potential of aptamers for targeted delivery.</a> Biomedicines. 8 (5), 120 (2020).</li><li>Wu, X., Chen, J., Wu, M., Zhao, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers:+active+targeting+ligands+for+cancer+diagnosis+and+therapy.">Aptamers: active targeting ligands for cancer diagnosis and therapy.</a> Theranostics. 5 (4), 322 (2015).</li><li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aptamer+functionalized+nanocomposite+used+for+prostate+cancer+diagnosis+and+therapy.">The aptamer functionalized nanocomposite used for prostate cancer diagnosis and therapy.</a> Journal of Nanomaterials. 2022, (2022).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+aptamer-based+biomarker+discovery.">Advances in aptamer-based biomarker discovery.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 571 (2021).</li><li>Ashrafuzzaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers+as+both+drugs+and+drug-carriers.">Aptamers as both drugs and drug-carriers.</a> BioMed Research International. 2014, (2014).</li><li>Nakhjavani, M., Samarasinghe, R. M., Shigdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple-negative+breast+cancer+brain+metastasis:+an+update+on+druggable+targets,+current+clinical+trials,+and+future+treatment+options.">Triple-negative breast cancer brain metastasis: an update on druggable targets, current clinical trials, and future treatment options.</a> Drug Discovery Today. , (2022).</li><li>Macdonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+bifunctional+aptamer+targeting+the+transferrin+receptor+and+epithelial+cell+adhesion+molecule+(EpCAM)+for+the+treatment+of+brain+cancer+metastases.">Development of a bifunctional aptamer targeting the transferrin receptor and epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) for the treatment of brain cancer metastases.</a> ACS Chemical Neuroscience. 8 (4), 777-784 (2017).</li><li>Macdonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifunctional+aptamer-doxorubicin+conjugate+crosses+the+blood-brain+barrier+and+selectively+delivers+its+payload+to+EpCAM-positive+tumor+cells.">Bifunctional aptamer-doxorubicin conjugate crosses the blood-brain barrier and selectively delivers its payload to EpCAM-positive tumor cells.</a> Nucleic Acid Therapeutics. 30 (2), 117-128 (2020).</li><li>Shigdar, S., Agnello, L., Fedele, M., Camorani, S., Cerchia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+cancer+cells+by+cell-SELEX:+use+of+aptamers+for+discovery+of+actionable+biomarkers+and+therapeutic+applications+thereof.">Profiling cancer cells by cell-SELEX: use of aptamers for discovery of actionable biomarkers and therapeutic applications thereof.</a> Pharmaceutics. 14 (1), 28 (2021).</li><li>Rahimizadeh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell-specific+aptamers:+recent+advances+and+insight+into+the+selection+procedures.">Development of cell-specific aptamers: recent advances and insight into the selection procedures.</a> Molecules. 22 (12), 2070 (2017).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell-SELEX+technology+and+its+application+in+cancer+diagnosis+and+therapy.">Development of cell-SELEX technology and its application in cancer diagnosis and therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (12), 2079 (2016).</li><li>Shigdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+sensitive+chemical+antibodies+for+diagnosis:+detection+of+low+levels+of+EpCAM+in+breast+cancer.">The use of sensitive chemical antibodies for diagnosis: detection of low levels of EpCAM in breast cancer.</a> PLoS One. 8 (2), 57613 (2013).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+EpCAM+(CD326)+in+prostate+cancer+metastasis+and+progression.">Role of the EpCAM (CD326) in prostate cancer metastasis and progression.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 31 (3), 779-791 (2012).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+adhesion+molecule+(EpCAM)+is+associated+with+prostate+cancer+metastasis+and+chemo/radioresistance+via+the+PI3K/Akt/mTOR+signaling+pathway.">Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) is associated with prostate cancer metastasis and chemo/radioresistance via the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 45 (12), 2736-2748 (2013).</li><li>McKeague, M., Kruse, P. F., Patterson, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tissue Culture. , 395-397 (1973).</li><li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+minimum+aptamer+publication+standards+(MAPS+guidelines)+for+de+novo+aptamer+selection.">The minimum aptamer publication standards (MAPS guidelines) for de novo aptamer selection.</a> Aptamers. 6, 10-18 (2022).</li><li>Schoofs, G., Van Hout, A., D'huys, T., Schols, D., Van Loy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometry-based+assay+to+identify+compounds+that+disrupt+binding+of+fluorescently-labeled+CXC+Chemokine+ligand+12+to+CXC+Chemokine+receptor+4.">A flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled CXC Chemokine ligand 12 to CXC Chemokine receptor 4.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57271 (2018).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+an+overview.">Flow cytometry: an overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120 (1), 1-11 (2018).</li><li>Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+cell+viability+assays.">Guidelines for cell viability assays.</a> Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).</li><li>Ruscito, A., DeRosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+binding+aptamers:+Selection+strategies,+characterization,+and+applications.">Small-molecule binding aptamers: Selection strategies, characterization, and applications.</a> Frontiers in Chemistry. 4, 14 (2016).</li><li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analytical+comparison+of+strategies+used+for+small+molecule+aptamer+evaluation.">Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation.</a> Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).</li><li>Henri, J., Bayat, N., Macdonald, J., Shigdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+using+nucleic+acid+aptamers+in+cell+based+assays.">A guide to using nucleic acid aptamers in cell based assays.</a> Aptamers. 23, (2019).</li><li>Mao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+and+regularity+of+quenching+the+effect+of+bases+on+fluorophores:+the+base-quenched+probe+method.">The mechanism and regularity of quenching the effect of bases on fluorophores: the base-quenched probe method.</a> Analyst. 143 (14), 3292-3301 (2018).</li><li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+in+vitro+aptamer+selection+parameters.">Analysis of in vitro aptamer selection parameters.</a> Journal of Molecular Evolution. 81 (5), 150-161 (2015).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+negative+surface+charges+of+cancer+cells+by+multifunctional+nanoprobes.">Targeting negative surface charges of cancer cells by multifunctional nanoprobes.</a> Theranostics. 6 (11), 1887 (2016).</li><li>Shigdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+aptamers+targeting+cancer+stem+cell+marker+CD133.">RNA aptamers targeting cancer stem cell marker CD133.</a> Cancer Letters. 330 (1), 84-95 (2013).</li><li>Amraee, M., Oloomi, M., Yavari, A., Bouzari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+aptamer+identification+and+characterization+for+E.+coli+O157+detection+using+cell+based+SELEX+method.">DNA aptamer identification and characterization for E. coli O157 detection using cell based SELEX method.</a> Analytical Biochemistry. 536, 36-44 (2017).</li><li>Yu, X. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+and+characterization+of+a+novel+DNA+aptamer,+Apt-07S+specific+to+hepatocellular+carcinoma+cells.">Selection and characterization of a novel DNA aptamer, Apt-07S specific to hepatocellular carcinoma cells.</a> Drug Design, Development and Therapy. 14, 1535 (2020).</li></ol>

새로운 압타머 개발의 주요 과제는 이 프로세스의 여러 단계에 적용되는 표준 지침이 없다는 것입니다. McKeague et al.은 최근 출판물에서 데이터의 불분명 한 표현과 연구 복제 실패로 이어지는 관련 문제 중 일부를 보여주었습니다. 그들은 압타머19를 특성화할 때 고려해야 할 기본 지침을 제안했습니다. 압타머 결합 분석은 해당 분야의 연구자들이 널리 사용하는 압타머<sup class="...

암은 여전히 전 세계적으로 사망의 주요 원인 중 하나입니다1. 최근 수십 년 동안 암 치료의 상당한 개선에도 불구하고 항암제 개발은 여전히 논쟁의 여지가 많은 주제입니다. 암 치료의 주류 인 화학 요법은 환자의 치료 순응도를 제한하는 심각한 부작용을 동반하기 때문입니다. 더욱이, 화학 요법으로 유발 된 암 내성은 의학적 개입의 유일한 선택으로서의 적용을 제한했다. 단클론 항체(mAbs)의 적용은 암 치료에 대한 향상된 반응을 도입했습니다2. mAb를 사용한 이유는 화학 요법의 효능을 개선하고 부작용을 최소화하는 것이 었습니다. 그러나 mAb의 관리도 도전이되었습니다. 이는 mAb 유도 면역반응뿐만 아니라 동물의존적이고 고가의 생산 비용과 어려운보관 조건 때문이었습니다3. 1990년대에 압 타머의 도입4 앱타머의 적용이 mAb와 관련된 문제를 해결할 수 있기 때문에 암 치료에 대한 새로운 희망을 불러일으켰습니다.
압타머는 특정 표적에 대해 특이적으로 생산되는 짧은 핵산 서열입니다. 지수 농축(SELEX)에 의한 리간드의 체계적인 진화는 압타머 생산에서 일반적인 방법입니다. SELEX에서 관심 단백질은 무작위 뉴클레오티드 서열 라이브러리와 함께 배양되고 일련의 반복 주기를 통해 해당 단백질에 특이적인 앱타머가 정제됩니다. 압타머는 mAb와 유사한 표적 선택성 및 특이성을 가지므로 이 분야의 약물 개발은 유망한 미래 응용 분야를 보여줍니다. 암 바이오마커에 특이적인 압타머는 단일 약물 및 암 진단 도구 5,6,7로서 적용될 수 있다. 이들의 나노 크기 구조로 인해, 이들 앱타머는 또한 종양에 특이적으로 세포독성제를 전달하는 약물 운반체로서 작용할 수 있다(8). 이것은 표적 약물 전달의 효능을 증가시키고 화학 요법과 관련된 표적 외 부작용을 감소시킵니다. 또한, 이러한 나노 의약품은 조직 침투율이 높기 때문에 심부 종양 약물 전달 및 치료에 바람직한 후보가됩니다. 압타머는 또한 뇌종양으로의 약물 전달을 개선하기 위해 혈액-뇌 장벽(BBB) 상에 발현된 수송체를 표적으로 하도록 설계될 수있다9. 이러한 앱타머의 좋은 예는 BBB를 가로지르는 약물 전달을 향상시키기 위해 트랜스페린 수용체(TfR)10을 표적화하고, 종양 세포(11)에 세포독성 약물 페이로드를 전달하는 이관능성 앱타머이다.
압타머의 모든 장점에도 불구하고 이 분야의 약물 개발은 아직 시판되고 성공적인 항암제를 산출하지 못했습니다. 그 이유 중 하나는 해당 분야의 연구자들이 전 세계적으로 따를 수 있는 표준적이고 재현 가능한 방법이 부족하기 때문일 수 있습니다. 이 논문에서는 세포 표면에 발현된 천연 단백질에 결합하는 앱타머의 단계별 프로토콜을 시연합니다. 이 프로토콜은 항암 앱타머의 전임상 평가에서 전제 조건 단계입니다. 분석법은 선택성 및 특이성의 확인을 위해 SELEX 또는 공개된 압타머 서열로부터 수집된 정제된 압타머의 선택성 및 특이성을 보여주기 위해 수행된다. 이 유세포 분석 기반 분석은 압타머의 선택성과 특이성을 정확하게 보여주는 빠르고 신뢰할 수 있으며 민감한 분석이며, 여기서 압타머는 세포 표면12,13,14의 단백질에 대해 테스트됩니다. 이 방법은 이 논문15에 나타낸 EpCAM에 특이적인 압타머의 결합을 사용하여 입증된다. 막횡단 당단백질인 EpCAM은 종양 세포 신호 전달, 진행, 이동 및 전이에 역할을 합니다16,17. 이 압타머의 선택성 및 특이성을 보여주기 위해, EpCAM 양성 및 음성 암세포가 사용되었다. 이전에 개발된 EpCAM 특이적 압타머인 TEPP (5'-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3') 및 음성 대조군 압타머인 TENN (5'-GC GCG TGCA CGC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3), 각각10개의 EpCAM 결합 및 비결합 압타머를 사용하였다. TEPP 및 TENN 모두의 3' 말단은 TYE665 형광단으로 표지되었다.
TEPP는 한쪽 끝에서 EpCAM을 표적으로 하고 다른 쪽 끝에서 TfR을 표적으로 하는 이중 기능 압타머입니다. 이로 인해 TEPP는 EpCAM+ 뇌종양에 대한 약물 전달에 적합한 후보가 되었습니다. TEPP는 TfR 특이적 말단을 사용하여 혈액-뇌 장벽을 횡단하고 EpCAM 특이적 말단을 사용하여 종양을 찾아 화물(예: 세포독성 약물)을 종양에 전달합니다. TENN은 TEPP와 유사한 길이 및 2D 구조를 갖지만 EpCAM 또는 TfR에 대한 친화력이 없으므로 적합한 음성 대조군 압타머입니다. TEPP 및 TENN을 사용하여 유세포 분석을 사용하여 표적 단백질에 대한 압타머의 결합을 테스트하는 것이 이 논문에 나와 있습니다. 이 프로토콜은 세포 특이적 압타머의 개발에 적용됩니다. 또한 문헌에서 이용 가능한 압타머 서열의 추가 보완 및 확인 분석에도 적용 가능하다. 이 프로토콜은 또한 이전에 발표 된 압타머를 연구 개발 (R & D) 목적으로 사용하려는 압타머 분야를 처음 접하는 사람들도 사용할 수 있습니다. 이 논문에서는 문헌에서 이용 가능한 두 가지 압타머 서열을 연구합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipettes</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>606180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva V9.0</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder</td>
			<td>Sigma-AldrichTM</td>
			<td>A7906-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-line Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12100046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate- Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21300025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo, LLC 10.8.1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td>SFBS-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ACS-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Megafuge 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRM-HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A37834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen- and RNase-free ultrapure water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Cell Culture flask</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>658170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TENN</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5&#8242;-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEPP</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5&#8242;-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer RNA (tRNA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8508-5X1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow cytometry-based cell surface protein binding assay for assessing selectivity and specificity of an anticancer aptamer

항암 앱타머 개발의 핵심 과제는 개발된 앱타머의 표적 단백질에 대한 선택성과 특이성을 효율적으로 결정하는 것입니다. 단일 클론 항체에 비해 몇 가지 장점으로 인해 압타머 개발은 암 연구자들 사이에서 엄청난 인기를 얻었습니다. 지수 농축 (SELEX)에 의한 리간드의 체계적인 진화는 관심 단백질에 특이적인 압타머를 개발하는 가장 일반적인 방법입니다. SELEX에 이어 빠르고 효율적인 결합 분석은 식별 과정을 가속화하여 압타머의 선택성과 특이성을 확인합니다. 
이 논문은 상피 세포 접착 분자(EpCAM)에 특이적인 압타머의 단계별 유세포 분석 기반 결합 분석을 설명합니다. 막횡단 당단백질 EpCAM은 대부분의 암종에서 과발현되며 암 시작, 진행 및 전이에 역할을 합니다. 따라서, 종양으로의 표적 약물 전달을 위한 귀중한 후보이다. 막 결합된 EpCAM에 대한 앱타머의 선택성 및 특이성을 평가하기 위해서는 EpCAM 양성 및 음성 세포가 필요하다. 추가적으로, EpCAM 결합 압타머와 유사한 길이 및 2차원(2D) 구조를 갖는 비결합 EpCAM 압타머가 요구된다. 결합 분석은 상이한 완충제 (블로킹 완충액, 세척 완충액, 인큐베이션 완충액, 및 FACS 완충액) 및 배양 단계를 포함한다. 
앱타머는 세포주와 함께 배양된다. 인큐베이션 및 세척 단계에 이어서, 세포를 민감성 유동 세포분석 방법을 사용하여 평가할 것이다. 결과를 분석한 결과, EpCAM 음성 세포가 아닌 EpCAM 양성 세포에 대한 EpCAM 특이적 압타머의 결합을 보여준다. EpCAM 양성 세포에서, 이것은 비결합 압타머 대조군과 비교하여 EpCAM 압타머의 우측으로의 결합에서의 밴드 이동으로서 도시된다. EpCAM 음성 세포에서, EpCAM 결합 및 비 결합 압타머의 상응하는 밴드가 겹친다. 이것은 EpCAM 압타머의 선택성과 특이성을 입증합니다. 이 프로토콜은 EpCAM 압타머에 초점을 맞추고 있지만, 프로토콜은 다른 공개된 압타머에도 적용할 수 있다.

신약 발견 및 개발의 중요한 측면은 약물 후보의 선택성과 특이성을 보장하는 것입니다. 이는 약물 후보가 서로 다른 세포를 구별할 수 있어야 하며 관심 세포 집단(선택성)에만 영향을 미칠 수 있어야 함을 의미합니다. 선택성은 관심있는 단백질의 발현 측면에서 다른 세포주를 사용하여 연구됩니다. 본 연구에서, MDA-MB-231 및 HEK 293T 세포주를 EpCAM 양성 및 음성 세포로서 선택하였다. 특이성은 관?...

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A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

항암 앱타머 개발에 필요한 단계는 표적에 대한 결합을 테스트하는 것입니다. 우리는 이 결합을 연구하기 위한 유세포 분석 기반 분석을 시연하며, 특정 단백질에 대해 음성 대조군 압타머와 양성 또는 음성 암세포를 포함하는 것의 중요성을 강조합니다.

항암 압타머의 선택성 및 특이성을 평가하기 위한 유세포분석 기반 세포 표면 단백질 결합 분석

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

이 프로토콜은 앱타머를 처음 사용하는 연구원이 프로젝트에서 앱타머를 사용하고 프로토콜을 완료하는 데 필요한 개별적인 작은 단계를 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 압타머는 매우 다재다능하며 이 프로토콜은 면역표현형 분석에서 얼마나 쉽고 간단한지를 보여줍니다. 압타머는 진단 및 치료 응용 분야 모두에 사용할 수 있습니다.이 프로토콜은 특이성과 민감도를 확인하기 위해 수행되는 첫 번째 단계입니다. 이 특정 분석은 하나의 세포 표면 수용체의 염색을 입증하지만, 앱타머는 다중 파라미터 유세포분석에 매우 쉽게 사용되어 높은 수준의 표현형 지식을 제공할 수 있습니다. 압타머 작업의 중요한 측면은 사용하기 전에 올바르게 접혀 있는지, 완충액과 이온 강도 조건이 선택되었을 때와 동일한지 확인하는 것입니다.플라스크에서 배지를 수집하여 버린 후 PBS 3 밀리리터를 넣고 세포 위에 뿌립니다. 각 플라스크에 0.25 %의 트립신 -EDTA 1 밀리리터를 첨가 한 후 섭씨 37도에서 5-10 분 동안 배양하고 현미경으로 세포의 분리를 시각화합니다. 다음으로, 1밀리리터의 완전 배지를 세포에 추가하고 세포를 위아래로 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다.세포를 적절한 튜브에 피펫팅하고 200G에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버린 후, 세포를 1 밀리리터의 새로운 배지에 재현 탁시키고 일정 부피의 세포 현탁액을 트리판 블루로 희석하여 트리판 블루 염색을 사용하여 세포를 계수합니다. 약 15 마이크로 리터의 혼합물을 혈구 측정기와 커버 글라스 사이에 분배하여 세포를 계산합니다.필요한 수의 세포를 수집하여 테스트 샘플 당 십만 개의 세포가 있는지 확인하십시오. 그런 다음 세포를 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양하여 효소 분리 후 세포막에서 관심 단백질이 안정화되도록 합니다. 2시간 인큐베이션 후, 세포를 500 G에서 5분 동안 원심분리한다.상청액을 버린 후, 세포를 500 마이크로리터의 블로킹 완충액에 재현탁시킨다. 간헐적 혼합으로 세포를 섭씨 4도에서 30 분 동안 배양합니다. 이 30분 배양 동안, 원고에 기재된 압타머의 두 배 농도를 준비하여 압타머 폴딩을 수행한다.그런 다음 압타머를 빛으로부터 보호하면서 필요한 접힘 조건에 따라 압타머를 열순환기 기계와 혼합하고 배양합니다. 30분 인큐베이션 후, 이전에 입증된 바와 같이 세포를 원심분리하고 상청액을 제거하였다. 그런 다음 1 밀리리터의 세척 버퍼를 넣고 세포를 다시 원심 분리하십시오.상청액을 제거한 후, 세포를 결합 완충액의 적절한 부피에 재현탁시킨다. 다음으로, 50 마이크로리터의 재현탁된 세포를 얼음처럼 차가운 96 웰 검정 플레이트의 각 웰에 피펫팅한다. 그런 다음 50 마이크로리터의 압타머를 50 마이크로리터 부피의 세포에 피펫팅하고, 혼합하고 섭씨 4도의 어둠 속에서 30분 동안 배양한다.원심분리하고 상청액을 제거한 후, 펠릿을 세척 완충액에 조심스럽게 재현탁시키고 다시 500G에서 5분 동안 원심분리한다. 이어서 유세포분석 분석을 위해 100 마이크로리터의 세척 완충액에 재현탁시키면서 세척 단계를 2회 반복한다. 먼저 유세포 분석기를 켠 다음 컴퓨터를 켭니다.그런 다음 유세포 분석 소프트웨어를 열고 프로그램에 로그인 한 다음 세포 분석기 탭에서 유체 시작을 실행하십시오. 새 실험을 만들려면 실험 탭에서 새 폴더를 클릭하고 폴더 이름을 슬래시 실험으로 적절하게 지정합니다. 새 폴더를 클릭하여 강조 표시합니다.그런 다음 실험 탭에서 새 실험을 다시 클릭하고 실험 이름을 적절하게 지정합니다. 첫 번째 샘플 슬래시 표본을 추가하려면 실험 탭에서 새 표본을 클릭하고 표본의 이름을 적절하게 지정합니다. 튜브 샘플을 추가하려면 표본을 강조 표시하고 실험 탭에서 새 튜브를 클릭합니다.그런 다음 적절한 수의 튜브와 이름을 추가하십시오. 필요한 그래프를 준비하려면 워크시트 탭에서 새 워크시트를 엽니다. 새 워크시트 창이 나타나면 측면 분산과 전방 분산의 도트 블롯 그래프를 준비하여 관심 모집단을 선택합니다.전방 산란 높이 대 전방 산란 영역의 도트 블롯 그래프를 준비하여 단일 세포 집단을 선택합니다. 다음으로, 관심있는 형광단에 대한 사건 수의 히스토그램을 준비하십시오. 유세포분석을 시작하기 전에 전압 파라미터를 조정하기 위한 샘플 수집, 검사기 및 세포분석기를 제어하기 위한 수집 대시보드와 모든 그래프가 포함된 워크시트가 열려 있는지 확인하십시오.먼저 처리되지 않은 세포를 실행합니다. 튜브를 가리키는 화살표가 녹색인지 확인하십시오. 이 화살표가 녹색이 아닌 경우 화살표를 클릭하여 녹색으로 만듭니다.피펫을 사용하여 각 샘플을 96웰 블랙 플레이트에서 유세포분석 튜브로 옮깁니다. 획득 대시보드에서 기록할 적절한 이벤트 수를 선택하고 유속을 낮음으로 변경한 다음 데이터 수집을 클릭합니다. FSC 및 SCC 파라미터의 전압을 조정하여 셀 모집단이 점도표 내에 집중되고 관심 있는 셀이 손실되지 않도록 그래프의 어느 축에도 닿지 않도록 합니다.전방 및 측면 산란 밀도 플롯에서 관심 모집단을 식별하고 선택하고 전방 산란 신호가 가장 낮은 모집단을 구성하는 파편을 제외하여 첫 번째 게이트를 정의합니다. 이중항 세포 집단을 제외하여 두 번째 게이트를 정의하면 이중항 세포가 결과와 결론에 상당한 영향을 미치므로 두 번째 게이트를 정의합니다. 샘플을 더 빠르게 분석하려면 수집 속도를 중간 또는 높음으로 높이되 초당 200-300개 이벤트를 초과하지 마십시오.그런 다음 데이터 기록을 클릭합니다. 전압을 조정하고 게이팅하고 데이터를 기록한 후 샘플을 꺼내고 Next Tube를 클릭합니다. 다음 샘플을 삽입하고 모든 제어 및 테스트 샘플에 대해 기록 데이터를 반복합니다.모든 데이터가 수집되면 50% 표백제, FACSRinse 및 초순수로 구성된 3개의 튜브를 각각 높은 유속으로 5분 동안 실행하여 유세포분석기를 세척합니다. 그런 다음 세포분석기 드롭다운 메뉴에서 유체 시스템 종료를 클릭합니다. 결과를 fsc 파일로 USB 드라이브로 내보내 전송합니다.새로 만들기 버튼을 눌러 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하여 분석을 처리할 새 문서와 창을 만들고 샘플 파일을 새 창으로 드래그합니다. 두 번 클릭하여 염색되지 않은 샘플을 엽니다. 단일 세포 모집단을 게이트하려면 P1 모집단을 선택하고 P1 모집단을 두 번 클릭하여 FSCH 대 FSCA 그래프를 생성합니다.제어된 단일 셀을 두 번 클릭하여 사용된 형광 색소에 대한 이벤트의 히스토그램을 만듭니다. 원래 창에서 P1 및 단일 셀을 선택하고 모든 샘플로 드래그하여 모든 샘플에 동일한 게이팅이 포함되도록 합니다. 그런 다음 레이아웃 편집기 버튼을 클릭하여 레이아웃 창을 열고 두 샘플을 서로 드래그하여 오버레이 히스토그램을 만듭니다.EpCAM 양성 MDA-MB-231 세포에서, TEPP 및 TENN으로 처리된 세포를 나타내는 히스토그램을 오버레이하는 것은 TEPP 처리된 세포가 TENN 처리된 세포와 비교하여 오른쪽으로 이동한다는 것을 보여주며, 이는 TEPP 앱타머의 결합이 관심 단백질에 발생한다는 것을 입증한다. 음성 대조군에서, TEPP 및 TENN의 히스토그램을 오버레이하는 HEK 293T 세포는 EpCAM 발현 세포에서 TEPP가 그의 수용체에 부착된 EpCAM 압타머임을 나타내는 어떠한 이동도 반영하지 않는다. 또한, EpCAM 음성 세포에서는 결합이 관찰되지 않았으며, 이는 개발된 앱타머의 선택성 및 특이성을 확인시켜준다.압타머가 빛으로부터 보호되고 압타머와 세포가 플레이트에 혼합되고 유세포분석기에 올바른 전압이 설정되어 있는지 확인합니다. 이것은 압타머에 대한 향후 응용 분야에 크게 의존합니다. 예를 들어, 우리는 약물 전달에 중점을 둡니다.따라서 다음 단계는 압타머가 형광 현미경을 사용하여 내재화되었는지 평가하는 것입니다. 이 프로토콜은 앱타머가 면역표현형 분석에서 단클론 및 다클론 항체를 대체하는 것이 얼마나 쉬운지를 보여주었습니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization

유리 표면 기능화를 통해 표적 세포 격리 방법

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual ...

연구

암 연구학

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

췌장암의 형광 동소 이식 마우스 모델

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

폐암 표적 나노 입자와 광 역학 치료의 항암 효능

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

교류 Cytometry 기반 약물 세포종 줄기 세포의 세포 분화를 촉진 하는 작은 분자의 식별에 대 한 시스템 검사

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

2 차원 젤 전기 이동 법 질량 분석 방법으로 인간의 뇌 Adenoma 조직 프로테옴의 분석에 대 한 결합

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping Orthotopic Homograft (Syngeneic) Murine 기본 KPC 췌 장 Ductal 선 암의 Cytometry로의

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

신호 분석 및 바이오 마커 발견 하는 단일 셀에 대 한 형광 셀 바코드와 인 Cytometry

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

실시간 탐지의 체 외 종양 세포 Apoptosis에 CD8에 의해 유도 된+ T 세포 종양 침투 골수성 세포의 면역 진압 기능 연구

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

자동된 라이브 셀 이미징 사용 하 여 간단한 마이그레이션/침공 워크플로

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

암세포의 3D 스페로이드 배양에서 세포 생존력과 사망 평가

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...