Name: a flow cytometry-based cell surface protein binding assay for assessing selectivity and specificity of an anticancer aptamer
Uploaded: 2022-09-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer at JoVE.com

Авторы признают финансирование Seed Института психического и физического здоровья и клинического перевода (IMPACT), программу «Стипендия Альфреда Дикина для постдокторских исследований» в Университете Дикина и «Стипендию Австралийской правительственной исследовательской учебной программы».

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом эксперимента наденьте средства индивидуальной защиты, включая лабораторный халат, перчатки и очки. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации о материалах, реагентах, оборудовании и программном обеспечении, используемых в этом ?...

<ol>
	<li>Cancer. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers</a> (2022)</li><li>Liu, J. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+monoclonal+antibody+development+-+Progress,+remaining+challenges+and+future+innovations.">The history of monoclonal antibody development - Progress, remaining challenges and future innovations.</a> Annals of Medicine and Surgery. 3 (4), 113-116 (2014).</li><li>Nakhjavani, M., Shigdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+of+PD-1/PD-L1+axis+modulation+for+the+treatment+of+triple-negative+breast+cancer.">Future of PD-1/PD-L1 axis modulation for the treatment of triple-negative breast cancer.</a> Pharmacological Research. 175, 106019 (2022).</li><li>Bukari, B., Samarasinghe, R. M., Noibanchong, J., Shigdar, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+delivery+of+therapeutics+into+the+brain:+the+potential+of+aptamers+for+targeted+delivery.">Non-invasive delivery of therapeutics into the brain: the potential of aptamers for targeted delivery.</a> Biomedicines. 8 (5), 120 (2020).</li><li>Wu, X., Chen, J., Wu, M., Zhao, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers:+active+targeting+ligands+for+cancer+diagnosis+and+therapy.">Aptamers: active targeting ligands for cancer diagnosis and therapy.</a> Theranostics. 5 (4), 322 (2015).</li><li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aptamer+functionalized+nanocomposite+used+for+prostate+cancer+diagnosis+and+therapy.">The aptamer functionalized nanocomposite used for prostate cancer diagnosis and therapy.</a> Journal of Nanomaterials. 2022, (2022).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+aptamer-based+biomarker+discovery.">Advances in aptamer-based biomarker discovery.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 571 (2021).</li><li>Ashrafuzzaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers+as+both+drugs+and+drug-carriers.">Aptamers as both drugs and drug-carriers.</a> BioMed Research International. 2014, (2014).</li><li>Nakhjavani, M., Samarasinghe, R. M., Shigdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple-negative+breast+cancer+brain+metastasis:+an+update+on+druggable+targets,+current+clinical+trials,+and+future+treatment+options.">Triple-negative breast cancer brain metastasis: an update on druggable targets, current clinical trials, and future treatment options.</a> Drug Discovery Today. , (2022).</li><li>Macdonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+bifunctional+aptamer+targeting+the+transferrin+receptor+and+epithelial+cell+adhesion+molecule+(EpCAM)+for+the+treatment+of+brain+cancer+metastases.">Development of a bifunctional aptamer targeting the transferrin receptor and epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) for the treatment of brain cancer metastases.</a> ACS Chemical Neuroscience. 8 (4), 777-784 (2017).</li><li>Macdonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifunctional+aptamer-doxorubicin+conjugate+crosses+the+blood-brain+barrier+and+selectively+delivers+its+payload+to+EpCAM-positive+tumor+cells.">Bifunctional aptamer-doxorubicin conjugate crosses the blood-brain barrier and selectively delivers its payload to EpCAM-positive tumor cells.</a> Nucleic Acid Therapeutics. 30 (2), 117-128 (2020).</li><li>Shigdar, S., Agnello, L., Fedele, M., Camorani, S., Cerchia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+cancer+cells+by+cell-SELEX:+use+of+aptamers+for+discovery+of+actionable+biomarkers+and+therapeutic+applications+thereof.">Profiling cancer cells by cell-SELEX: use of aptamers for discovery of actionable biomarkers and therapeutic applications thereof.</a> Pharmaceutics. 14 (1), 28 (2021).</li><li>Rahimizadeh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell-specific+aptamers:+recent+advances+and+insight+into+the+selection+procedures.">Development of cell-specific aptamers: recent advances and insight into the selection procedures.</a> Molecules. 22 (12), 2070 (2017).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell-SELEX+technology+and+its+application+in+cancer+diagnosis+and+therapy.">Development of cell-SELEX technology and its application in cancer diagnosis and therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (12), 2079 (2016).</li><li>Shigdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+sensitive+chemical+antibodies+for+diagnosis:+detection+of+low+levels+of+EpCAM+in+breast+cancer.">The use of sensitive chemical antibodies for diagnosis: detection of low levels of EpCAM in breast cancer.</a> PLoS One. 8 (2), 57613 (2013).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+EpCAM+(CD326)+in+prostate+cancer+metastasis+and+progression.">Role of the EpCAM (CD326) in prostate cancer metastasis and progression.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 31 (3), 779-791 (2012).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+adhesion+molecule+(EpCAM)+is+associated+with+prostate+cancer+metastasis+and+chemo/radioresistance+via+the+PI3K/Akt/mTOR+signaling+pathway.">Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) is associated with prostate cancer metastasis and chemo/radioresistance via the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 45 (12), 2736-2748 (2013).</li><li>McKeague, M., Kruse, P. F., Patterson, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tissue Culture. , 395-397 (1973).</li><li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+minimum+aptamer+publication+standards+(MAPS+guidelines)+for+de+novo+aptamer+selection.">The minimum aptamer publication standards (MAPS guidelines) for de novo aptamer selection.</a> Aptamers. 6, 10-18 (2022).</li><li>Schoofs, G., Van Hout, A., D'huys, T., Schols, D., Van Loy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometry-based+assay+to+identify+compounds+that+disrupt+binding+of+fluorescently-labeled+CXC+Chemokine+ligand+12+to+CXC+Chemokine+receptor+4.">A flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled CXC Chemokine ligand 12 to CXC Chemokine receptor 4.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57271 (2018).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+an+overview.">Flow cytometry: an overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120 (1), 1-11 (2018).</li><li>Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+cell+viability+assays.">Guidelines for cell viability assays.</a> Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).</li><li>Ruscito, A., DeRosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+binding+aptamers:+Selection+strategies,+characterization,+and+applications.">Small-molecule binding aptamers: Selection strategies, characterization, and applications.</a> Frontiers in Chemistry. 4, 14 (2016).</li><li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analytical+comparison+of+strategies+used+for+small+molecule+aptamer+evaluation.">Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation.</a> Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).</li><li>Henri, J., Bayat, N., Macdonald, J., Shigdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+using+nucleic+acid+aptamers+in+cell+based+assays.">A guide to using nucleic acid aptamers in cell based assays.</a> Aptamers. 23, (2019).</li><li>Mao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+and+regularity+of+quenching+the+effect+of+bases+on+fluorophores:+the+base-quenched+probe+method.">The mechanism and regularity of quenching the effect of bases on fluorophores: the base-quenched probe method.</a> Analyst. 143 (14), 3292-3301 (2018).</li><li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+in+vitro+aptamer+selection+parameters.">Analysis of in vitro aptamer selection parameters.</a> Journal of Molecular Evolution. 81 (5), 150-161 (2015).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+negative+surface+charges+of+cancer+cells+by+multifunctional+nanoprobes.">Targeting negative surface charges of cancer cells by multifunctional nanoprobes.</a> Theranostics. 6 (11), 1887 (2016).</li><li>Shigdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+aptamers+targeting+cancer+stem+cell+marker+CD133.">RNA aptamers targeting cancer stem cell marker CD133.</a> Cancer Letters. 330 (1), 84-95 (2013).</li><li>Amraee, M., Oloomi, M., Yavari, A., Bouzari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+aptamer+identification+and+characterization+for+E.+coli+O157+detection+using+cell+based+SELEX+method.">DNA aptamer identification and characterization for E. coli O157 detection using cell based SELEX method.</a> Analytical Biochemistry. 536, 36-44 (2017).</li><li>Yu, X. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+and+characterization+of+a+novel+DNA+aptamer,+Apt-07S+specific+to+hepatocellular+carcinoma+cells.">Selection and characterization of a novel DNA aptamer, Apt-07S specific to hepatocellular carcinoma cells.</a> Drug Design, Development and Therapy. 14, 1535 (2020).</li></ol>

Ключевой проблемой при разработке новых аптамеров является отсутствие стандартных руководящих принципов, которые применяются к различным этапам этого процесса. McKeague et al. недавно продемонстрировали некоторые из связанных с этим проблем, которые приводят к неясному представлению данн...

Рак по-прежнему является одной из ведущих причин смертности во всем мире1. Несмотря на значительное улучшение лечения рака в последние десятилетия, разработка противоопухолевых препаратов по-прежнему является весьма обсуждаемой темой. Это связано с тем, что химиотерапия, как основа лечения рака, сопровождается серьезными побочными эффектами, которые ограничивают соблюдение пациентом лечения. Кроме того, вызванная химиотерапией устойчивость рака к лечению ограничила его применение в качестве единственного выбора медицинского вмешательства. Применение моноклональных антител (mAbs) вводило усиленный ответ на лечение рака2. Обоснование применения mAbs заключалось в повышении эффективности химиотерапевтических средств и минимизации их побочных реакций. Тем не менее, администрирование mAbs также стало проблемой. Это произошло не только из-за иммунологических реакций, вызванных mAb, но и из-за зависящих от животных и дорогостоящих производственных затрат и сложных условий хранения3. Внедрение аптамеров в 1990-х годах4 породило новые надежды в лечении рака, поскольку применение аптамеров может решить проблемы, связанные с mAbs.
Аптамеры представляют собой короткие последовательности нуклеиновых кислот, которые специально производятся для определенной мишени. Систематическая эволюция лигандов путем экспоненциального обогащения (SELEX) является распространенным методом в производстве аптамеров. В SELEX интересующий белок инкубируется с библиотекой случайных нуклеотидных последовательностей, и через серию итеративных циклов аптамер, специфичный для этого белка, очищается. Аптамеры имеют аналогичную селективность и специфичность мишеней с mAbs, и поэтому разработка лекарств в этой области показывает многообещающие будущие применения. Аптамеры, специфичные для биомаркеров рака, могут применяться как отдельные препараты и инструменты диагностики рака 5,6,7. Из-за их наноразмерной структуры эти аптамеры могут также выступать в качестве носителей лекарств для доставки цитотоксических агентов конкретно к опухоли8. Это повысит эффективность целевой доставки лекарств и уменьшит связанные с химиотерапией побочные реакции. Кроме того, эти нанолекарства обладают высоким проникновением в ткани, что делает их желательным кандидатом для доставки и лечения препаратов с глубокой опухолью. Аптамеры также могут быть разработаны для нацеливания на транспортеры, экспрессируемые на гематоэнцефалическом барьере (ГЭБ), для улучшения доставки лекарств к опухолям головного мозга9. Хорошим примером такого аптамера являются бифункциональные аптамеры, нацеленные на рецептор трансферрина (TfR)10 для улучшения доставки лекарств через ГЭБ и доставляющие полезную нагрузку цитотоксического препарата к опухолевым клеткам11.
Несмотря на все преимущества аптамеров, разработка лекарств в этой области еще не дала продаваемого, успешного противоопухолевого препарата. Одной из причин этого может быть отсутствие стандартных и воспроизводимых методов, которым могли бы следовать исследователи в этой области во всем мире. В этой статье продемонстрирован пошаговый протокол связывания аптамера с нативным белком, экспрессируемым на поверхности клетки. Этот протокол является обязательным этапом доклинической оценки противоопухолевых аптамеров. Анализ проводится, чтобы показать селективность и специфичность очищенного аптамера, собранного из SELEX или опубликованной последовательности аптамеров для подтверждения селективности и специфичности. Этот проточный цитометрический анализ представляет собой быстрый, надежный, чувствительный анализ, который точно показывает селективность и специфичность аптамера, где аптамер тестируется против белков на поверхности клетки 12,13,14. Этот метод продемонстрирован с использованием связывания аптамера, специфичного для EpCAM, показанного в настоящем документе15. EpCAM, как трансмембранный гликопротеин, играет роль в передаче сигналов опухолевых клеток, прогрессировании, миграции и метастазировании16,17. Чтобы показать селективность и специфичность этого аптамера, использовались EpCAM-положительные и -отрицательные раковые клетки. Ранее разработанный специфический аптамер EpCAM, TEPP (5'-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3'), и отрицательный контрольный аптамер, TENN (5'-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3), были использованы в качестве EpCAM-связывающих и -несвязывающих аптамеров, соответственно10. 3'-дюймовый конец TEPP и TENN были помечены флуорофором TYE665.
TEPP - это бифункциональный аптамер, который нацелен на EpCAM с одного конца и TfR на другом. Это сделало TEPP подходящим кандидатом для доставки лекарств к опухолям головного мозга EpCAM+ . Используя свой TfR-специфический конец, TEPP пересекает гематоэнцефалический барьер и, используя EpCAM-специфический конец, находит опухоль и доставляет ее груз (например, цитотоксические препараты) к опухоли. TENN имеет такую же длину и 2D-структуру, как TEPP, но он не имеет сродства к EpCAM или TfR и, следовательно, является подходящим отрицательным управляющим аптамером. Используя TEPP и TENN, тестирование связывания аптамера с целевым белком с помощью проточной цитометрии показано в этой статье. Этот протокол применяется к разработке клеточных аптамеров. Он также применим к дальнейшим дополнительным и подтверждающим анализам последовательностей аптамеров, имеющихся в литературе. Протокол также может быть использован новичками в области аптамеров, которые рассматривают возможность использования ранее опубликованного аптамера для своих целей исследований и разработок (НИОКР). В данной работе исследуются две аптамерные последовательности, имеющиеся в литературе.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipettes</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>606180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva V9.0</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder</td>
			<td>Sigma-AldrichTM</td>
			<td>A7906-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-line Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12100046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate- Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21300025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo, LLC 10.8.1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td>SFBS-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ACS-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Megafuge 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRM-HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A37834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen- and RNase-free ultrapure water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Cell Culture flask</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>658170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TENN</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5&#8242;-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEPP</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5&#8242;-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer RNA (tRNA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8508-5X1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow cytometry-based cell surface protein binding assay for assessing selectivity and specificity of an anticancer aptamer

Ключевой задачей при разработке противоопухолевого аптамера является эффективное определение селективности и специфичности разработанного аптамера к белку-мишени. Благодаря своим преимуществам перед моноклональными антителами, разработка аптамера приобрела огромную популярность среди исследователей рака. Систематическая эволюция лигандов путем экспоненциального обогащения (SELEX) является наиболее распространенным методом разработки аптамеров, специфичных для интересующих белков. Следуя SELEX, быстрый и эффективный связывающий анализ ускоряет процесс идентификации, подтверждая селективность и специфичность аптамера. 
В этой статье объясняется пошаговый проточный цитометрический анализ связывания аптамера, специфичного для молекулы клеточной адгезии эпителия (EpCAM). Трансмембранный гликопротеин EpCAM чрезмерно экспрессируется в большинстве карцином и играет роль в инициации, прогрессировании и метастазировании рака. Поэтому он является ценным кандидатом для адресной доставки лекарств к опухолям. Для оценки селективности и специфичности аптамера к мембранно-связанному EpCAM требуются EpCAM-положительные и -отрицательные клетки. Кроме того, требуется несвязывающий аптамер EpCAM с аналогичной длиной и 2-мерной (2D) структурой, что и EpCAM-связывающий аптамер. Анализ связывания включает в себя различные буферы (блокирующий буфер, буфер промывки, буфер инкубации и буфер FACS) и этапы инкубации. 
Аптамер инкубируется с клеточными линиями. После этапов инкубации и промывки клетки будут оценены с использованием чувствительного анализа проточной цитометрии. Анализ результатов показывает связывание EpCAM-специфического аптамера с EpCAM-положительными клетками, а не с EpCAM-отрицательными клетками. В EpCAM-положительных клетках это изображается как сдвиг полосы в связывании аптамера EpCAM вправо по сравнению с несвязывающим контролем аптамера. В EpCAM-отрицательных клетках соответствующие полосы EpCAM-связывающих и -несвязывающих аптамеров перекрываются. Это демонстрирует избирательность и специфичность аптамера EpCAM. Хотя этот протокол ориентирован на аптамер EpCAM, протокол применим к другим опубликованным аптамерам.

Важным аспектом открытия и разработки новых лекарств является обеспечение избирательности и специфичности препарата-кандидата. Это означает, что препарат-кандидат должен уметь различать разные клетки и влиять только на интересующую популяцию клеток (селективность). Селективность из...

Watch this Scientific Journal Video about A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer at JoVE.com

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

Необходимым шагом в разработке противоопухолевого аптамера является проверка его связывания с мишенью. Мы демонстрируем анализ на основе проточной цитометрии для изучения этого связывания, подчеркивая важность включения отрицательного контрольного аптамера и раковых клеток, которые являются положительными или отрицательными для этого конкретного белка.

Анализ связывания белка клеточной поверхности на поверхности проточной цитометрии для оценки селективности и специфичности противоопухолевого аптамера

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

Этот протокол поможет исследователям, новичкам в работе с аптамерами, иметь возможность использовать их в своих проектах, а также понимать отдельные маленькие шаги, необходимые для завершения протокола. Аптамеры очень универсальны, и этот протокол демонстрирует, насколько они легки и просты в иммунофенотипическом анализе. Аптамеры могут использоваться как для диагностических, так и для терапевтических применений.Этот протокол является первым шагом, предпринятым для подтверждения их специфики и чувствительности. В то время как этот конкретный анализ демонстрирует окрашивание рецептора одной клеточной поверхности, аптамеры могут очень легко использоваться для многопараметрической проточной цитометрии, обеспечивая высокий уровень фенотипических знаний. Важными аспектами работы с аптамерами являются обеспечение того, чтобы они были правильно сложены перед использованием, а также чтобы условия буфера и ионной силы были такими же, как при их выборе.После сбора и выбрасывания среды в колбу добавьте три миллилитра PBS и распределите их по клеткам. После добавления одного миллилитра 0,25% трипсина-ЭДТА в каждую колбу инкубируют в течение пяти-10 минут при 37 градусах Цельсия и визуализируют отслоение клеток под микроскопом. Затем добавьте один миллилитр полной среды к ячейкам и пипеткой клетки вверх и вниз, чтобы сделать одноклеточную суспензию.Пипетка клеток в соответствующую трубку и центрифугу при 200 Г в течение пяти минут. После выброса супернатанта повторно суспендируют клетки в одном миллилитре свежей среды и подсчитывают клетки с помощью окрашивания трипановым синим цветом, разбавляя определенный объем клеточной суспензии трипан-синим. Распределите примерно 15 микролитров смеси между гемоцитометром и покровным стеклом для подсчета клеток.Соберите необходимое количество клеток, убедившись, что на тестовый образец приходится сто тысяч клеток. Затем инкубируют клетки при 37 градусах Цельсия в течение двух часов, чтобы обеспечить стабилизацию белка, представляющего интерес, на клеточной мембране после ферментативной отслойки. После двухчасовой инкубации центрифугируют клетки при 500 г в течение пяти минут.После выброса супернатанта повторно суспендируют клетки в 500 микролитрах блокирующего буфера. Инкубируйте клетки при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут с прерывистым перемешиванием. Во время этой 30-минутной инкубации выполните складывание аптамера, приготовив в два раза больше концентраций аптамеров, как описано в рукописи.Затем смешайте и инкубируйте аптамеры с термоциклерной машиной в соответствии с требуемыми условиями складывания, обеспечивая при этом защиту аптамеров от света. После 30-минутной инкубации центрифугируйте клетки, как показано ранее, и удалите супернатант. Затем добавьте один миллилитр промывочного буфера и снова центрифугируйте клетки.После удаления супернатанта повторно суспендируйте клетки в подходящем объеме связывающего буфера. Далее пипетка 50 микролитров повторно суспендированных ячеек в каждую лунку ледяного холода 96 лунок черной пластины. Затем пипетку 50 микролитров аптамеров на 50 микролитров объема клеток, перемешайте и высиживайте в темноте при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут.После центрифуги и удаления супернатанта тщательно повторно суспендировать гранулу в буфере промывки и снова центрифугу при 500 Г в течение пяти минут. Затем повторно суспендировать в 100 микролитрах промывочного буфера для проточного цитометрического анализа, повторив этап промывки дважды. Сначала включите проточный цитометр, а затем компьютер.Затем откройте программное обеспечение для анализа проточной цитометрии, войдите в программу и под вкладкой цитометра запустите запуск жидкости. Чтобы создать новый эксперимент, на вкладке эксперимент щелкните Новая папка и назовите эксперимент косой черты папки соответствующим образом. Нажмите на новую папку, чтобы выделить ее.Затем на вкладке эксперимент снова щелкните Новый эксперимент и назовите его соответствующим образом. Чтобы добавить первый образец косой черты, на вкладке эксперимента щелкните новый образец и назовите образец соответствующим образом. Чтобы добавить образец пробирки, выделите образец и под вкладкой эксперимента щелкните Новая трубка.Затем добавьте соответствующее количество трубок и название. Чтобы подготовить необходимые графики, на вкладке листа откройте новый лист. Как только появится новое окно листа, подготовьте точечный график бокового рассеяния и прямого рассеяния, чтобы выбрать интересующую популяцию.Подготовьте точечный график высоты прямого рассеяния и области прямого рассеяния, чтобы выбрать популяцию одной ячейки. Далее подготовьте гистограмму количества событий против интересующего флуорофора. Перед началом проточной цитометрии убедитесь, что перед началом проточной цитометрии открыта панель сбора для управления сбором образцов, инспектор и цитометр для регулировки параметров напряжения, а также рабочий лист со всеми графиками.Во-первых, запустите необработанные клетки. Убедитесь, что стрелка, указывающая на трубку, зеленая. Если эта стрелка не зеленая, нажмите на стрелку, чтобы сделать ее зеленой.Используя пипетку, перенесите каждый образец из черной пластины из 96 скважин в проточную цитометрическую трубку. На панели мониторинга сбора выберите соответствующее количество событий для записи, измените скорость потока на низкую и нажмите кнопку Получить данные. Отрегулируйте напряжение для параметров FSC и SCC, гарантируя, что популяция клеток централизована внутри точечного графика и что ни одна ячейка не касается ни одной оси графика, чтобы избежать потери интересующих ячеек.Определите первые ворота, определив и выбрав интересующую популяцию на прямом и боковом участке рассеянной плотности, исключив при этом обломки, которые составляют популяцию с наименьшим сигналом прямого рассеяния. Определите второй вход, исключив популяции дублетных клеток, так как дублетные клетки значительно влияют на результаты и выводы. Увеличьте скорость сбора данных до средней или высокой, чтобы анализировать образцы быстрее, но не превышать более 200-300 событий в секунду.Затем нажмите кнопку Записать данные. После регулировки напряжения и блокировки и записи данных, извлеките образец и нажмите Next Tube. Вставьте следующий образец и повторите запись данных для всех контрольных и тестовых образцов.После того, как все данные собраны, промыть проточный цитометр, запустив три трубки с 50% отбеливателем, FACSRinse и сверхчистой водой, каждая в течение пяти минут с высокой скоростью потока. Затем в раскрывающемся меню цитометра щелкните Fluidics shut down. Экспортируйте результат в виде FSC-файлов на USB-накопитель для передачи.Проанализируйте их с помощью программного обеспечения для анализа, нажав кнопку new, чтобы создать новый документ и окно для обработки анализа, и перетащите файлы образцов в новое окно. Дважды щелкните, чтобы открыть незапятнанный образец. Чтобы определить популяцию с одной клеткой, выберите популяцию P1 и дважды щелкните на популяции P1, чтобы создать график FSCH против FSCA.Дважды щелкните по закрытым одиночным ячейкам, чтобы создать гистограмму событий против используемого фторхрома. В исходном окне выберите P1 и отдельные ячейки и перетащите их на все образцы, чтобы все образцы теперь содержали один и тот же затвор. Затем нажмите кнопку редактора макетов, чтобы открыть окно макетов, и перетащите два образца друг на друга, чтобы создать гистограмму наложения.В клетках EpCAM с положительным MDA-MB-231 наложение гистограмм, представляющих клетки, обработанные TEPP и TENN, показывает, что клетки, обработанные TEPP, смещены вправо по сравнению с клетками, обработанными TENN, демонстрируя, что связывание аптамера TEPP происходит с интересующим белком. В отрицательном контроле клетки HEK 293T, накладывающие гистограммы TEPP и TENN, не отражают какого-либо сдвига, указывающего на то, что в EpCAM-экспрессирующих клетках TEPP является аптамером EpCAM, прикрепленным к его рецептору. Кроме того, в отрицательных клетках EpCAM не наблюдалось связывания, что подтверждает селективность и специфичность разработанного аптамера.Убедитесь, что аптамеры защищены от света, аптамеры и клетки смешаны на пластине, а на проточном цитометре установлены правильные напряжения. Это сильно зависит от будущих применений аптамеров. Например, мы ориентированы на доставку лекарств.Таким образом, следующим шагом для нас будет оценка того, интернализуются ли аптамеры с помощью флуоресцентной микроскопии. Этот протокол продемонстрировал, насколько легко аптамерам заменить моноклональные и поликлональные антитела в иммунофенотипических анализах.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization

Метод Targeted Выделение клеток с помощью стеклянной поверхности функционализации

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual ...

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Флуоресцентные Ортотопическая Мышь Модель панкреатического рака

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

Антираковая Эффективность фотодинамической терапии рака легких с таргетингом наночастицами

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Потока на основе цитометрии наркотиков скрининг системы для идентификации малых молекул, которые способствуют клеточной дифференцировки стволовых клеток глиобластомы

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

В сочетании с методами масс-спектрометрии для анализа тканей протеома человека Аденома гипофиза двумерного гель-электрофорез

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Иммунофенотипирование ортотопическая Homograft (сингенных) из мышиных первичной КЗК аденокарциномы поджелудочной железы протоковой подачей Cytometry

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Фосфоресцентный проточной цитометрии с люминесцентные клеток штриховое кодирование для сигнализации биомаркер обнаружение и анализ отдельной ячейки

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Режиме реального времени обнаружения в апоптоз клеток in Vitro опухоли индуцированные CD8 клетки+ T для изучения подавляющей иммунные функции проникновения опухоли миелоидных клеток

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Простая миграция/вторжения рабочий процесс, с помощью автоматизированных Imager клеток

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Оценка жизнеспособности и смерти клеток в 3D сфероидных культурах раковых клеток

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...