Name: a flow cytometry-based cell surface protein binding assay for assessing selectivity and specificity of an anticancer aptamer
Uploaded: 2022-09-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer at JoVE.com

Yazarlar, Zihinsel ve Fiziksel Sağlık ve Klinik Çeviri Enstitüsü (IMPACT) SEED finansmanını, Deakin Üniversitesi'ndeki "Alfred Deakin Doktora Sonrası Araştırma Bursu" programını ve "Avustralya Hükümeti Araştırma Eğitim Programı Bursu" nu kabul etmektedir.

NOT: Deneye başlamadan önce, laboratuvar önlüğü, eldiven ve gözlük dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman giyin. Bu protokolde kullanılan malzemeler, reaktifler, ekipman ve yazılımlar hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.
1. Tahlil için gerekli tamponlar
<ol><li>Bu deney için gerekli tamponları (aptamer katlama için gerekli olan SELEX tamponu, Blokaj Tamponu (BB), Yıkama Tamponu (WB) ve Bağlayıcı Tampon (BiB) (<stro...

<ol>
	<li>Cancer. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers</a> (2022)</li><li>Liu, J. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+monoclonal+antibody+development+-+Progress,+remaining+challenges+and+future+innovations.">The history of monoclonal antibody development - Progress, remaining challenges and future innovations.</a> Annals of Medicine and Surgery. 3 (4), 113-116 (2014).</li><li>Nakhjavani, M., Shigdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+of+PD-1/PD-L1+axis+modulation+for+the+treatment+of+triple-negative+breast+cancer.">Future of PD-1/PD-L1 axis modulation for the treatment of triple-negative breast cancer.</a> Pharmacological Research. 175, 106019 (2022).</li><li>Bukari, B., Samarasinghe, R. M., Noibanchong, J., Shigdar, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+delivery+of+therapeutics+into+the+brain:+the+potential+of+aptamers+for+targeted+delivery.">Non-invasive delivery of therapeutics into the brain: the potential of aptamers for targeted delivery.</a> Biomedicines. 8 (5), 120 (2020).</li><li>Wu, X., Chen, J., Wu, M., Zhao, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers:+active+targeting+ligands+for+cancer+diagnosis+and+therapy.">Aptamers: active targeting ligands for cancer diagnosis and therapy.</a> Theranostics. 5 (4), 322 (2015).</li><li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aptamer+functionalized+nanocomposite+used+for+prostate+cancer+diagnosis+and+therapy.">The aptamer functionalized nanocomposite used for prostate cancer diagnosis and therapy.</a> Journal of Nanomaterials. 2022, (2022).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+aptamer-based+biomarker+discovery.">Advances in aptamer-based biomarker discovery.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 571 (2021).</li><li>Ashrafuzzaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers+as+both+drugs+and+drug-carriers.">Aptamers as both drugs and drug-carriers.</a> BioMed Research International. 2014, (2014).</li><li>Nakhjavani, M., Samarasinghe, R. M., Shigdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple-negative+breast+cancer+brain+metastasis:+an+update+on+druggable+targets,+current+clinical+trials,+and+future+treatment+options.">Triple-negative breast cancer brain metastasis: an update on druggable targets, current clinical trials, and future treatment options.</a> Drug Discovery Today. , (2022).</li><li>Macdonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+bifunctional+aptamer+targeting+the+transferrin+receptor+and+epithelial+cell+adhesion+molecule+(EpCAM)+for+the+treatment+of+brain+cancer+metastases.">Development of a bifunctional aptamer targeting the transferrin receptor and epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) for the treatment of brain cancer metastases.</a> ACS Chemical Neuroscience. 8 (4), 777-784 (2017).</li><li>Macdonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifunctional+aptamer-doxorubicin+conjugate+crosses+the+blood-brain+barrier+and+selectively+delivers+its+payload+to+EpCAM-positive+tumor+cells.">Bifunctional aptamer-doxorubicin conjugate crosses the blood-brain barrier and selectively delivers its payload to EpCAM-positive tumor cells.</a> Nucleic Acid Therapeutics. 30 (2), 117-128 (2020).</li><li>Shigdar, S., Agnello, L., Fedele, M., Camorani, S., Cerchia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+cancer+cells+by+cell-SELEX:+use+of+aptamers+for+discovery+of+actionable+biomarkers+and+therapeutic+applications+thereof.">Profiling cancer cells by cell-SELEX: use of aptamers for discovery of actionable biomarkers and therapeutic applications thereof.</a> Pharmaceutics. 14 (1), 28 (2021).</li><li>Rahimizadeh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell-specific+aptamers:+recent+advances+and+insight+into+the+selection+procedures.">Development of cell-specific aptamers: recent advances and insight into the selection procedures.</a> Molecules. 22 (12), 2070 (2017).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell-SELEX+technology+and+its+application+in+cancer+diagnosis+and+therapy.">Development of cell-SELEX technology and its application in cancer diagnosis and therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (12), 2079 (2016).</li><li>Shigdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+sensitive+chemical+antibodies+for+diagnosis:+detection+of+low+levels+of+EpCAM+in+breast+cancer.">The use of sensitive chemical antibodies for diagnosis: detection of low levels of EpCAM in breast cancer.</a> PLoS One. 8 (2), 57613 (2013).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+EpCAM+(CD326)+in+prostate+cancer+metastasis+and+progression.">Role of the EpCAM (CD326) in prostate cancer metastasis and progression.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 31 (3), 779-791 (2012).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+adhesion+molecule+(EpCAM)+is+associated+with+prostate+cancer+metastasis+and+chemo/radioresistance+via+the+PI3K/Akt/mTOR+signaling+pathway.">Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) is associated with prostate cancer metastasis and chemo/radioresistance via the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 45 (12), 2736-2748 (2013).</li><li>McKeague, M., Kruse, P. F., Patterson, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tissue Culture. , 395-397 (1973).</li><li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+minimum+aptamer+publication+standards+(MAPS+guidelines)+for+de+novo+aptamer+selection.">The minimum aptamer publication standards (MAPS guidelines) for de novo aptamer selection.</a> Aptamers. 6, 10-18 (2022).</li><li>Schoofs, G., Van Hout, A., D'huys, T., Schols, D., Van Loy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometry-based+assay+to+identify+compounds+that+disrupt+binding+of+fluorescently-labeled+CXC+Chemokine+ligand+12+to+CXC+Chemokine+receptor+4.">A flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled CXC Chemokine ligand 12 to CXC Chemokine receptor 4.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57271 (2018).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+an+overview.">Flow cytometry: an overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120 (1), 1-11 (2018).</li><li>Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+cell+viability+assays.">Guidelines for cell viability assays.</a> Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).</li><li>Ruscito, A., DeRosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+binding+aptamers:+Selection+strategies,+characterization,+and+applications.">Small-molecule binding aptamers: Selection strategies, characterization, and applications.</a> Frontiers in Chemistry. 4, 14 (2016).</li><li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analytical+comparison+of+strategies+used+for+small+molecule+aptamer+evaluation.">Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation.</a> Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).</li><li>Henri, J., Bayat, N., Macdonald, J., Shigdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+using+nucleic+acid+aptamers+in+cell+based+assays.">A guide to using nucleic acid aptamers in cell based assays.</a> Aptamers. 23, (2019).</li><li>Mao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+and+regularity+of+quenching+the+effect+of+bases+on+fluorophores:+the+base-quenched+probe+method.">The mechanism and regularity of quenching the effect of bases on fluorophores: the base-quenched probe method.</a> Analyst. 143 (14), 3292-3301 (2018).</li><li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+in+vitro+aptamer+selection+parameters.">Analysis of in vitro aptamer selection parameters.</a> Journal of Molecular Evolution. 81 (5), 150-161 (2015).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+negative+surface+charges+of+cancer+cells+by+multifunctional+nanoprobes.">Targeting negative surface charges of cancer cells by multifunctional nanoprobes.</a> Theranostics. 6 (11), 1887 (2016).</li><li>Shigdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+aptamers+targeting+cancer+stem+cell+marker+CD133.">RNA aptamers targeting cancer stem cell marker CD133.</a> Cancer Letters. 330 (1), 84-95 (2013).</li><li>Amraee, M., Oloomi, M., Yavari, A., Bouzari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+aptamer+identification+and+characterization+for+E.+coli+O157+detection+using+cell+based+SELEX+method.">DNA aptamer identification and characterization for E. coli O157 detection using cell based SELEX method.</a> Analytical Biochemistry. 536, 36-44 (2017).</li><li>Yu, X. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+and+characterization+of+a+novel+DNA+aptamer,+Apt-07S+specific+to+hepatocellular+carcinoma+cells.">Selection and characterization of a novel DNA aptamer, Apt-07S specific to hepatocellular carcinoma cells.</a> Drug Design, Development and Therapy. 14, 1535 (2020).</li></ol>

Yeni aptamers geliştirmenin temel zorluğu, bu sürecin farklı adımlarına uygulanan standart kılavuzların eksikliğidir. McKeague ve ark. son zamanlarda, yayınlardaki verilerin belirsiz sunumlarına ve araştırmanın çoğaltılamamasına yol açan bazı ilgili zorlukları göstermiştir. Aptamerlerin19'unu karakterize etmede dikkate alınması gereken temel kılavuzları önerdiler. Bir aptamer bağlama testi, alandaki araştırmacılar tarafından yaygın olarak kullanılan aptamers<sup ...

Kanser hala dünya çapında mortalitenin önde gelen nedenlerinden biridir1. Son yıllarda kanser tedavisindeki önemli iyileşmeye rağmen, antikanser ilaç geliştirme hala çok tartışılan bir konudur. Bunun nedeni, kanser tedavisinin temel dayanağı olan kemoterapiye, hastanın tedaviye uyumunu sınırlayan ciddi yan etkilerin eşlik etmesidir. Ayrıca, kemoterapiye bağlı kanserin tedaviye direnci, tıbbi müdahalenin tek tercihi olarak uygulanmasını kısıtlamıştır. Monoklonal antikorların (mAbs) uygulanması, kanser tedavilerine gelişmiş bir yanıtgetirmiştir 2. mAbs kullanmanın mantığı, kemoterapötiklerin etkinliğini artırmak ve advers reaksiyonlarını en aza indirmekti. Bununla birlikte, mAbs'lerin yönetimi de bir zorluk haline geldi. Bu sadece mAb kaynaklı immünolojik reaksiyonlardan değil, aynı zamanda hayvana bağımlı ve pahalı üretim maliyetlerinden ve zorlu depolama koşullarından da kaynaklanıyordu3. 1990'larda aptamerlerin tanıtılması4 , kanser tedavisinde yeni umutlar yarattı, çünkü aptamerlerin uygulanması mAbs ile ilgili zorlukları ele alabilir.
Aptamerler, belirli bir hedef için özel olarak üretilen kısa nükleik asit dizileridir. Ligandların üstel zenginleştirme (SELEX) ile sistematik evrimi, aptamer üretiminde yaygın bir yöntemdir. SELEX'te, ilgilenilen protein, rastgele nükleotid dizilerinden oluşan bir kütüphane ile inkübe edilir ve bir dizi yinelemeli döngü yoluyla, bu protein için spesifik aptamer saflaştırılır. Aptamerler, mAb'lere benzer hedef seçiciliğe ve özgüllüğe sahiptir ve bu nedenle bu alandaki ilaç geliştirme, gelecekteki umut verici uygulamaları göstermektedir. Kanser biyobelirteçlerine özgü aptamerler tek ilaç ve kanser tanı araçları olarak uygulanabilir 5,6,7. Nano boyutlu yapıları nedeniyle, bu aptamerler ayrıca sitotoksik ajanları özellikle tümöre vermek için ilaç taşıyıcıları olarak da işlev görebilir8. Bu, hedeflenen ilaç dağıtımının etkinliğini artıracak ve kemoterapi ile ilişkili, hedef dışı advers reaksiyonları azaltacaktır. Dahası, bu nanoilaçlar yüksek doku penetrasyonuna sahiptir, bu da onları derin tümör ilaç dağıtımı ve tedavisi için arzu edilen bir aday haline getirir. Aptamerler ayrıca beyin tümörlerine ilaç dağıtımını iyileştirmek için kan-beyin bariyerinde (BBB) ifade edilen taşıyıcıları hedeflemek üzere tasarlanabilir9. Böyle bir aptamerin iyi bir örneği, BBB boyunca ilaç dağıtımını arttırmak için transferrin reseptörünü (TfR)10 hedefleyen ve tümör hücrelerine sitotoksik bir ilaç yükü veren iki işlevli aptamerlerdir11.
Aptamers'ın tüm avantajlarına rağmen, bu alandaki ilaç geliştirme henüz pazarlanmış, başarılı bir antikanser ilacı vermemiştir. Bunun bir nedeni, alandaki araştırmacılar tarafından küresel olarak takip edilebilecek standart ve tekrarlanabilir yöntemlerin eksikliği olabilir. Bu yazıda, hücre yüzeyinde eksprese edilen doğal bir proteine bağlanan bir aptamerin adım adım protokolü gösterilmiştir. Bu protokol, antikanser aptamerlerinin klinik öncesi değerlendirmesinde ön koşul adımıdır. Tahlil, seçicilik ve özgüllüğün doğrulanması için SELEX'ten toplanan saflaştırılmış aptamerin veya yayınlanmış bir aptamer dizisinin seçiciliğini ve özgüllüğünü göstermek için yapılır. Bu akış sitometrik tabanlı tahlil, aptamerin hücre yüzeyindeki proteinlere karşı test edildiği aptamerin seçiciliğini ve özgüllüğünü doğru bir şekilde gösteren hızlı, güvenilir, hassas bir tahlildir12,13,14. Bu yöntem, bu makalede gösterilen EpCAM için spesifik bir aptamerin bağlanması kullanılarak gösterilmiştir15. EpCAM, bir transmembran glikoprotein olarak, tümör hücresi sinyalizasyonu, progresyonu, migrasyon ve metastazda rol oynar16,17. Bu aptamerin seçiciliğini ve özgüllüğünü göstermek için EpCAM-pozitif ve -negatif kanser hücreleri kullanıldı. Daha önce geliştirilen EpCAM'e özgü aptamer, TEPP (5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′) ve negatif kontrol aptameri TENN (5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3), sırasıyla10 EpCAM bağlayıcı ve -bağlayıcı olmayan aptamers olarak kullanılmıştır. Hem TEPP hem de TERN'in 3' ucu bir TYE665 florofor ile etiketlendi.
TEPP, bir uçtan EpCAM'i ve diğer uçtan TfR'yi hedefleyen iki işlevli bir aptamerdir. Bu, TEPP'yi EpCAM + beyin tümörlerine ilaç dağıtımı için uygun bir aday haline getirmiştir. TEPP, TfR'ye özgü ucunu kullanarak kan-beyin bariyerini geçer ve EpCAM'e özgü ucu kullanarak tümörü bulur ve kargosunu (örneğin, sitotoksik ilaçlar) tümöre iletir. TERN, TEPP ile benzer bir uzunluğa ve 2D yapıya sahiptir, ancak EpCAM veya TfR için afiniteye sahip değildir ve bu nedenle uygun bir negatif kontrol aptameridir. TEPP ve TENN kullanılarak, bir aptamerin hedef proteine bağlanmasının akış sitometrisi kullanılarak test edilmesi bu makalede gösterilmiştir. Bu protokol, hücreye özgü aptamerlerin gelişimi için geçerlidir. Ayrıca literatürde mevcut olan aptamer dizilerinin tamamlayıcı ve doğrulama analizleri için de geçerlidir. Protokol, daha önce yayınlanmış bir aptamer'ı araştırma ve geliştirme (Ar-Ge) amaçları için kullanmayı düşünen aptamer alanında yeni olanlar tarafından da kullanılabilir. Bu yazıda literatürde mevcut olan iki aptamer dizisi incelenmiştir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipettes</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>606180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva V9.0</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder</td>
			<td>Sigma-AldrichTM</td>
			<td>A7906-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-line Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12100046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate- Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21300025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo, LLC 10.8.1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td>SFBS-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ACS-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Megafuge 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRM-HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A37834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogen- and RNase-free ultrapure water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Cell Culture flask</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>658170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TENN</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5&#8242;-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEPP</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5&#8242;-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer RNA (tRNA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8508-5X1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow cytometry-based cell surface protein binding assay for assessing selectivity and specificity of an anticancer aptamer

Bir antikanser aptamer geliştirmede önemli bir zorluk, geliştirilen aptamerin hedef proteine seçiciliğini ve özgüllüğünü etkili bir şekilde belirlemektir. Monoklonal antikorlara göre çeşitli avantajları nedeniyle, aptamer gelişimi kanser araştırmacıları arasında muazzam bir popülerlik kazanmıştır. Ligandların üstel zenginleştirme (SELEX) ile sistematik evrimi, ilgilenilen proteinlere özgü aptamerler geliştirmenin en yaygın yöntemidir. SELEX'i takiben, hızlı ve etkili bir bağlama testi, aptamerin seçiciliğini ve özgüllüğünü doğrulayarak tanımlama sürecini hızlandırır. 
Bu yazıda, epitelyal hücresel adezyon molekülü (EpCAM) için spesifik bir aptamerin adım adım akış sitometrik tabanlı bağlanma testi açıklanmaktadır. Transmembran glikoprotein EpCAM çoğu karsinomda aşırı eksprese edilir ve kanser başlangıcı, progresyonu ve metastazda rol oynar. Bu nedenle, tümörlere hedefe yönelik ilaç dağıtımı için değerli bir adaydır. Aptamerin membrana bağlı EpCAM'e seçiciliğini ve özgüllüğünü değerlendirmek için, EpCAM-pozitif ve -negatif hücreler gereklidir. Ek olarak, EpCAM bağlayıcı aptamer'e benzer uzunlukta ve 2 boyutlu (2D) yapıya sahip bağlayıcı olmayan bir EpCAM aptamer gereklidir. Bağlama tahlili farklı tamponlar (blokaj tamponu, yıkama tamponu, inkübasyon tamponu ve FACS tamponu) ve inkübasyon adımlarını içerir. 
Aptamer, hücre hatları ile inkübe edilir. Kuluçka ve yıkama adımlarını takiben, hücreler hassas bir akış sitometri testi kullanılarak değerlendirilecektir. Sonuçların analizi, EpCAM'e özgü aptamerin EpCAM-negatif hücrelere değil, EpCAM-pozitif hücrelere bağlandığını göstermektedir. EpCAM-pozitif hücrelerde bu, bağlanmayan aptamer kontrolüne kıyasla EpCAM aptamer'in sağa bağlanmasında bir bant kayması olarak tasvir edilir. EpCAM-negatif hücrelerde, karşılık gelen EpCAM bağlayıcı ve -bağlanmayan aptamer bantları üst üste biner. Bu, EpCAM aptamerinin seçiciliğini ve özgüllüğünü gösterir. Bu protokol EpCAM aptamerine odaklanırken, protokol yayınlanan diğer aptamerler için geçerlidir.

Yeni ilaç keşfi ve geliştirilmesinin önemli bir yönü, ilaç adayının seçiciliğini ve özgüllüğünü sağlamaktır. Bu, ilaç adayının farklı hücreler arasında ayrım yapabilmesi ve yalnızca ilgilenilen hücre popülasyonunu (seçicilik) etkilemesi gerektiği anlamına gelir. Seçicilik, ilgilenilen proteinin ekspresyonu açısından farklılık gösteren hücre hatları kullanılarak incelenir. Bu çalışmada MDA-MB-231 ve HEK 293T hücre hatları EpCAM-pozitif ve -negatif hücreler olarak seçilmişt...

Watch this Scientific Journal Video about A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer at JoVE.com

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

Antikanser aptamer gelişiminde gerekli bir adım, hedefe bağlanmasını test etmektir. Bu bağlanmayı incelemek için akış sitometrik tabanlı bir tahlil gösteriyoruz ve negatif bir kontrol aptamer ve bu belirli protein için pozitif veya negatif olan kanser hücrelerinin dahil edilmesinin önemini vurguluyoruz.

Bir Antikanser Aptamerinin Seçiciliğini ve Özgüllüğünü Değerlendirmek için Akış Sitometrisine Dayalı Hücre Yüzeyi Protein Bağlama Testi

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

Bu protokol, aptamers ile çalışmaya yeni başlayan araştırmacıların bunları projelerinde kullanabilmelerine ve ayrıca protokolü tamamlamak için gereken bireysel küçük adımları anlamalarına yardımcı olacaktır. Aptamerler çok yönlüdür ve bu protokol bir immünofenotipleme testinde ne kadar kolay ve basit olduklarını gösterir. Aptamerler hem tanısal hem de terapötik uygulamalar için kullanılabilir.Bu protokol, özgüllüklerini ve hassasiyetlerini doğrulamak için atılan ilk adımlardır. Bu özel tahlil bir hücre yüzey reseptörünün boyanmasını gösterirken, aptamerler çok parametrik akış sitometrisi için çok kolay bir şekilde kullanılabilir ve yüksek düzeyde fenotipik bilgi sağlar. Aptamerlerle çalışmanın önemli yönleri, kullanımdan önce doğru şekilde katlanmalarını ve ayrıca tampon ve iyonik mukavemet koşullarının seçildikleri zamanki ile aynı olmasını sağlamaktır.Şişedeki ortamı toplayıp attıktan sonra, üç mililitre PBS ekleyin ve hücrelerin üzerine yayın. Her şişeye bir mililitre% 0.25 Tripsin-EDTA ekledikten sonra, 37 santigrat derecede beş ila 10 dakika kuluçkaya yatırın ve hücrelerin mikroskop altında ayrılmasını görselleştirin. Ardından, hücrelere bir mililitre tam ortam ekleyin ve tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak için hücreleri yukarı ve aşağı pipetleyin.Hücreleri uygun bir tüpe pipetle yerleştirin ve beş dakika boyunca 200 G'de santrifüj yapın. Süpernatanı attıktan sonra, hücreleri bir mililitre taze ortamda yeniden askıya alın ve belirli miktarda hücre süspansiyonunu tripan mavisi ile seyrelterek tripan mavisi boyamasını kullanarak hücreleri sayın. Hücreleri saymak için karışımın yaklaşık 15 mikrolitresini bir hemositometre ve bir kapak camı arasına dağıtın.Test örneği başına yüz bin hücreye sahip olduğunuzdan emin olarak gerekli sayıda hücreyi toplayın. Daha sonra, enzimatik ayrılmayı takiben hücre zarı üzerindeki ilgili proteinin stabilizasyonuna izin vermek için hücreleri iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İki saatlik inkübasyonun ardından, hücreleri beş dakika boyunca 500 G'de santrifüj edin.Süper natantı attıktan sonra, hücreleri 500 mikrolitre bloke edici tamponda yeniden askıya alın. Hücreleri aralıklı karıştırma ile 30 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Bu 30 dakikalık inkübasyon sırasında, makalede açıklandığı gibi aptamer konsantrasyonlarının iki katını hazırlayarak aptamer katlama işlemini gerçekleştirin.Daha sonra aptamerleri termosikler makinesi ile gerekli katlama koşullarına göre karıştırın ve inkübe edin ve aptamerlerin ışıktan korunmasını sağlayın. 30 dakikalık inkübasyonun ardından, hücreleri daha önce gösterildiği gibi santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. Ardından bir mililitre yıkama tamponu ekleyin ve hücreleri tekrar santrifüj edin.Süpernatanı çıkardıktan sonra, hücreleri bağlayıcı tamponun uygun bir hacminde yeniden askıya alın. Daha sonra, yeniden askıya alınan hücrelerin 50 mikrolitresini buz gibi soğuk 96 kuyucuklu siyah bir plakanın her bir kuyucuğuna pipetleyin. Daha sonra 50 mikrolitre aptamers pipeti, 50 mikrolitrelik bir hücre hacmine yerleştirin, 30 dakika boyunca karanlıkta dört santigrat derecede karıştırın ve inkübe edin.Santrifüj yaptıktan ve süpernatanı çıkardıktan sonra, peleti yıkama tamponunda dikkatlice yeniden askıya alın ve beş dakika boyunca 500 G'de tekrar santrifüj yapın. Ardından, yıkama adımını iki kez tekrarlarken akış sitometrik analizi için 100 mikrolitre yıkama tamponunda yeniden askıya alın. İlk önce akış sitometresini ve ardından bilgisayarı açın.Ardından, akış sitometrisi analiz yazılımını açın, programa giriş yapın ve sitometre sekmesinin altında sıvı başlangıcını çalıştırın. Yeni bir deneme oluşturmak için, deneme sekmesinin altında yeni klasör'ü tıklatın ve klasör eğik çizgi denemesini uygun şekilde adlandırın. Vurgulamak için yeni klasöre tıklayın.Ardından, deneme sekmesinin altında tekrar yeni deneme'yi tıklayın ve denemeyi uygun şekilde adlandırın. İlk örnek eğik çizgi örneğini eklemek için, deneme sekmesinin altında yeni örnek'i tıklatın ve örneği uygun şekilde adlandırın. Bir tüp örneği eklemek için, numuneyi vurgulayın ve deneme sekmesinin altında yeni tüp'ü tıklayın.Ardından uygun sayıda tüp ve isim ekleyin. Gerekli grafikleri hazırlamak için, çalışma sayfası sekmesi altında yeni bir çalışma sayfası açın. Yeni çalışma sayfası penceresi açıldığında, ilgilenilen popülasyonu seçmek için yan dağılım ile ileri dağılım arasında bir nokta lekesi grafiği hazırlayın.Tek hücreli popülasyonu seçmek için ileri dağılım yüksekliği ile ileri dağılım alanının nokta lekesi grafiğini hazırlayın. Ardından, ilgilenilen florofora karşı olayların sayısının bir histogramını hazırlayın. Akış sitometrisine başlamadan önce voltaj parametrelerini ayarlamak için numune alımını, denetçiyi ve sitometreyi kontrol etmek için alım panosunun ve tüm grafiklerin bulunduğu çalışma sayfasının açık olduğundan emin olun.İlk olarak, tedavi edilmemiş hücreleri çalıştırın. Tüpe işaret eden okun yeşil olduğundan emin olun. Bu ok yeşil değilse, yeşil yapmak için oka tıklayın.Pipet kullanarak, her numuneyi 96 kuyucuklu siyah plakadan bir akış sitometri tüpüne aktarın. Edinme panosunda, kaydedilecek uygun sayıda olay seçin, akış hızını düşük olarak değiştirin ve Veri Al'a tıklayın. FSC ve SCC parametreleri için voltajı ayarlayarak, hücre popülasyonunun nokta grafiği içinde merkezileştirildiğinden ve ilgilenilen hücreleri kaybetmemek için hiçbir hücrenin grafiğin her iki eksenine de dokunmadığından emin olun.İlk kapıyı, en düşük ileri saçılma sinyaline sahip popülasyonu oluşturan enkazı hariç tutarken, ileri ve yan dağınık yoğunluk grafiğindeki ilgili popülasyonu tanımlayarak ve seçerek tanımlayın. Çifte hücre popülasyonlarını hariç tutarak ikinci kapıyı tanımlayın, çünkü çift hücreler sonuçları ve sonuçları önemli ölçüde etkiler. Örnekleri daha hızlı analiz etmek için edinme hızını orta veya yüksek seviyeye yükseltin, ancak saniyede 200 ila 300 olaydan fazlasını aşmayın.Ardından verileri kaydet'i tıklayın. Voltajı ayarladıktan ve verileri kapatıp kaydettikten sonra, örneği çıkarın ve Sonraki Tüp'e tıklayın. Bir sonraki numuneyi ekleyin ve tüm kontrol ve test numuneleri için kayıt verilerini tekrarlayın.Tüm veriler toplandıktan sonra, akış sitometresini, her biri beş dakika boyunca yüksek bir akış hızında üç tüp ağartıcı, FACSRinse ve ultra saf su çalıştırarak yıkayın. Ardından sitometre açılır menüsünden akışkanlar kapatıldı'yı tıklayın. Sonucu, aktarılacak fsc dosyaları olarak bir USB sürücüsüne aktarın.Analizi işlemek üzere yeni bir belge ve pencere oluşturmak için yeni düğmeye basarak analiz yazılımını kullanarak bunları analiz edin ve örnek dosyaları yeni pencereye sürükleyin. Lekesiz örneği açmak için çift tıklayın. Tek hücreli popülasyonu geçmek için, P1 popülasyonunu seçin ve FSCH versus FSCA grafiği oluşturmak için P1 popülasyonuna çift tıklayın.Kullanılan florokroma karşı olayların histogramını oluşturmak için kapılı tek hücrelere çift tıklayın. Orijinal pencerede P1 ve tek hücreleri seçin ve tüm örneklerin artık aynı geçidi içermesi için bunları tüm örneklere sürükleyin. Ardından, mizanpajlar penceresini açmak için düzen düzenleyici düğmesine tıklayın ve bindirme histogramı oluşturmak için iki örneği birbirinin üzerine sürükleyin.EpCAM pozitif MDA-MB-231 hücrelerinde, TEPP ve TENN ile tedavi edilen hücreleri temsil eden histogramların üst üste binmesi, TEPP ile tedavi edilen hücrelerin, TEPP aptamerinin bağlanmasının ilgili proteine bağlandığını gösteren TENN ile tedavi edilen hücrelere kıyasla sağa kaydırıldığını göstermektedir. Negatif kontrolde, TEPP ve TERN'in histogramlarını kaplayan HEK 293T hücreleri, EpCAM eksprese eden hücrelerde TEPP'nin reseptörüne bağlı EpCAM aptamer olduğunu gösteren herhangi bir kaymayı yansıtmaz. Ayrıca, EpCAM negatif hücrelerinde, geliştirilen aptamerin seçiciliğini ve özgüllüğünü doğrulayan bir bağlanma gözlenmemiştir.Aptamerlerin ışıktan korunduğundan, aptamerlerin ve hücrelerin plaka üzerinde karıştırıldığından ve akış sitometresinde doğru voltajların ayarlandığından emin olun. Bu, aptamers için gelecekteki uygulamalara büyük ölçüde bağlıdır. Örneğin, ilaç dağıtımına odaklandık.Bu yüzden bizim için bir sonraki adım, aptamerlerin floresan mikroskopi kullanılarak içselleştirilip içselleştirilmediğini değerlendirmek olacaktır. Bu protokol, immünofenotipleme tahlillerinde aptamerlerin monoklonal ve poliklonal antikorların yerini almasının ne kadar kolay olduğunu göstermiştir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization

Cam Yüzey fonksiyonlandırmalar aracılığıyla Hedefli Hücre İzolasyonu Bir Yöntem

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual ...

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Pankreas Kanseri Floresan Ortotopik Fare Modeli

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

Akciğer Kanseri Hedefli Nanopartiküller ile Fotodinamik Tedavi antikanser Etkinliği

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Akış Sitometresi tabanlı uyuşturucu Glioblastoma kök hücre hücresel farklılaşma teşvik küçük moleküller tanımlanması için eleme sistemi

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

İnsan hipofiz adenom doku Proteom analizi için kütle spektrometresi yöntemleri ile birleştiğinde iki boyutlu Jel Elektroforez

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Orthotopic Homogref (Syngeneic) fare birincil KPC pankreas duktal adenokarsinom, akış sitometresi tarafından Immunophenotyping

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Fosfo akış sitometresi ile floresan hücre barkodlama tek hücre Analizi ve biyomarker keşif sinyal

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Gerçek zamanlı hafiye-in Vitro tümör hücre Apoptosis içinde CD8 tarafından indüklenen+ T hücreleri Myeloid hücrelerin tümör infiltre bağışıklık baskılayıcı işlevlerini çalışmaya

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Otomatik bir canlı hücre Imager kullanarak basit geçiş/işgali iş akışı

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Hücre viability ve ölüm kanser hücrelerinin 3D Küroid kültürlerde değerlendirilmesi

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...