Name: a minimally invasive, accurate, and efficient technique for intrathymic injection in mice
Uploaded: 2022-08-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Minimally Invasive, Accurate, and Efficient Technique for Intrathymic Injection in Mice at JoVE.com

Vi vil gerne takke Raymond H. Thornton for hans indsigtsfulde og omfattende tidlige arbejde med denne teknik. Denne undersøgelse blev finansieret af tilskud fra National Cancer Institute (NCI 1R37CA250661-01A1), Children's Leukemia Research Association, Hackensack Meridian School of Medicine og HUMC Foundation / Tackle Kids Cancer.

Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med retningslinjer for dyrepleje på Center for Discovery and Innovation (IACUC protokol 290). Til denne undersøgelse, C57BL/6 mus (hun, 4-6 uger gamle), C57BL/6 mus (hunmus, 6 måneder gamle), J:NU hunmus, NOD scid gamma (NSG) hunmus og B6; CAG-luc, -GFP-mus blev brugt som henholdsvis ung musemodel, alderen musemodel, athymisk nøgenmodel, immunomangelfuld model og bioluminescenscellekilde. Musene blev hentet fra en kommerciel kilde (se Materialetabel). D...

<ol>
	<li>Chinn, I. K., Blackburn, C. C., Manley, N. R., Sempowski, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+primary+lymphoid+organs+with+aging.">Changes in primary lymphoid organs with aging.</a> Seminars in Immunology. 24 (5), 309-320 (2012).</li><li>Gruver, A. L., Sempowski, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines,+leptin,+and+stress-induced+thymic+atrophy.">Cytokines, leptin, and stress-induced thymic atrophy.</a> Journal of Leukocyte Biology. 84 (4), 915-923 (2008).</li><li>Masopust, D., Sivula, C. P., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice,+dirty+mice,+and+men:+Using+mice+to+understand+human+immunology.">Of mice, dirty mice, and men: Using mice to understand human immunology.</a> Journal of Immunology. 199 (2), 383-388 (2017).</li><li>Mukherjee, P., Roy, S., Ghosh, D., Nandi, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+animal+models+in+biomedical+research:+a+review.">Role of animal models in biomedical research: a review.</a> Laboratory Animals Research. 38 (1), 18 (2022).</li><li>McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+tolerance:+What+have+we+learned+from+mice.">Central tolerance: What have we learned from mice.</a> Seminars in Immunopathology. 30 (4), 399-409 (2008).</li><li>Zlotoff, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7+and+CCR9+together+recruit+hematopoietic+progenitors+to+the+adult+thymus.">CCR7 and CCR9 together recruit hematopoietic progenitors to the adult thymus.</a> Blood. 115 (10), 1897-1905 (2010).</li><li>Vukmanovic, S., Grandea, A. G., Faas, S. J., Knowles, B. B., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+selection+of+T-lymphocytes+induced+by+intrathymic+injection+of+a+thymic+epithelial+cell+line.">Positive selection of T-lymphocytes induced by intrathymic injection of a thymic epithelial cell line.</a> Nature. 359 (6397), 729-732 (1992).</li><li>Schwarz, B. A., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+hematopoietic+progenitors+with+T+lineage+potential.">Circulating hematopoietic progenitors with T lineage potential.</a> Nature Immunology. 5 (9), 953-960 (2004).</li><li>Marodon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+antigen-specific+tolerance+by+intrathymic+injection+of+lentiviral+vectors.">Induction of antigen-specific tolerance by intrathymic injection of lentiviral vectors.</a> Blood. 108 (9), 2972-2978 (2006).</li><li>Adjali, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+correction+of+ZAP-70+immunodeficiency+by+intrathymic+gene+transfer.">In vivo correction of ZAP-70 immunodeficiency by intrathymic gene transfer.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (8), 2287-2295 (2005).</li><li>Tuckett, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-guided+intrathymic+injection+of+multipotent+stem+cells+supports+life-long+T+cell+immunity+and+facilitates+targeted+immunotherapy.">Image-guided intrathymic injection of multipotent stem cells supports life-long T cell immunity and facilitates targeted immunotherapy.</a> Blood. 123 (18), 2797-2805 (2014).</li><li>Tuckett, A. Z., Thornton, R. H., O'Reilly, R. J., vanden Brink, M. R. M., Zakrzewski, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathymic+injection+of+hematopoietic+progenitor+cells+establishes+functional+T+cell+development+in+a+mouse+model+of+severe+combined+immunodeficiency.">Intrathymic injection of hematopoietic progenitor cells establishes functional T cell development in a mouse model of severe combined immunodeficiency.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 10 (1), 109 (2017).</li><li>Hogan, B. V., Peter, M. B., Shenoy, H. G., Horgan, K., Hughes, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgery+induced+immunosuppression.">Surgery induced immunosuppression.</a> Surgeon. 9 (1), 38-43 (2011).</li><li>Blair-Handon, R., Mueller, K., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+method+for+intrathymic+injections+in+mice.">An alternative method for intrathymic injections in mice.</a> Laboratory Animals. 39 (8), 248-252 (2010).</li><li>Tuckett, A. Z., Zakrzewski, J. L., Li, D., vanden Brink, M. R., Thornton, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-hand+ultrasound+guidance+permits+safe+and+efficient+minimally+invasive+intrathymic+injections+in+both+young+and+aged+mice.">Free-hand ultrasound guidance permits safe and efficient minimally invasive intrathymic injections in both young and aged mice.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (4), 1105-1111 (2015).</li><li>K&#252;ker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+value+of+necropsy+reports+for+animal+health+surveillance.">The value of necropsy reports for animal health surveillance.</a> BMC Veterinary Research. 14 (1), 191 (2018).</li><li>Sinclair, C., Bains, I., Yates, A. J., Seddon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+thymocyte+death+underlies+the+CD4:CD8+T-cell+ratio+in+the+adaptive+immune+system.">Asymmetric thymocyte death underlies the CD4:CD8 T-cell ratio in the adaptive immune system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2905-2914 (2013).</li><li>Manna, S., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathymic+injection.">Intrathymic injection.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).</li><li>de la Cueva, T., Naranjo, A., de la Cueva, E., Rubio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+intrathymic+injection+in+mice.">Refinement of intrathymic injection in mice.</a> Laboratory Animals. 36 (5), 27-32 (2007).</li></ol>

En ultralydstyret frihåndsinjektion er en meget nøjagtig teknik til levering af studiematerialer til thymus på en effektiv og aseptisk måde. Efter den indledende sterilisering af huden på injektionsstedet opretholdes steriliteten under proceduren på grund af brugen af sterile handsker, sterile ultralydssondedæksler og steril ultralydsgel. I modsætning til den blinde perkutane tilgang 10,17 eller afhængig af kirurgiske snit til direkte visualisering af thymus18,19, som er de almindeligt an...

Thymus har en væsentlig rolle i T-celleudvikling og immunitet. T-cellemangel, som blandt andet kan være forårsaget af thymisk involution, genetiske lidelser, infektioner og kræftbehandlinger, fører til høj dødelighed og sygelighed 1,2. Musemodeller er uundværlige i både grundlæggende og translationel immunologiforskning og er blevet brugt i årtier til at studere thymisk biologi og T-celleudvikling samt til at udvikle behandlinger til dem, der lider af thymisk dysfunktion og T-cellemangel 3,4,5.
En central del af thymiske undersøgelser har været intrathymisk injektion af biologiske materialer såsom celler, gener eller proteiner i musemodeller 6,7,8,9,10,11,12. Konventionelle intrathymiske injektionsmetoder bruger thorakotomi efterfulgt af intrathymisk injektion under direkte visualisering eller ved "blind" perkutan injektion i mediastinum. Den kirurgiske tilgang øger blandt andet pneumothorax-risikoen betydeligt. Desuden resulterer den forhøjede stress under denne operation i immunsuppression, hvilket potentielt kompromitterer immunologiske data13. Erfarne forskere kan efter nogen øvelse udføre den blinde injektionsteknik, men denne tilgang er mindre præcis og begrænser derfor forsøgspersoner til unge mus med en stor thymus.
Anvendelsen af ultralydsvejledning er blevet introduceret som et præcist og minimalt invasivt alternativ til traditionelle intrathymiske injektionsmetoder14. Denne procedure er imidlertid meget tidskrævende, når man bruger det integrerede skinnesystem i stedet for frihåndsteknikken. Udførelse af injektioner med injektionsbeslaget kræver omhyggelig billedoptimering og positionering af transduceren ved hjælp af de forskellige vedhæftede filer såsom transducerstativet og -holderen, X-, Y- og Z-positioneringssystemet samt dygtig betjening af mikromanipulationskontrollerne og skinnesystemudvidelserne. En simpel alternativ teknik, ultralydstyret thymisk injektion, præsenteres her udført af en radiolog ved hjælp af en frihåndstilgang15, som både er et hurtigt og præcist minimalt invasivt alternativ til de ovenfor beskrevne metoder. Det er vigtigt, at den nuværende tilgang kan udføres med ethvert ultralydsbilleddannelsessystem med høj opløsning uden behov for en injektionsmontering og integreret skinnesystem. Det er især nyttigt til undersøgelser, der kræver injektion af et stort antal mus11, til forsøg, der involverer injektion af begge thymiske lapper, eller til nøjagtig injektion af små thymuser i ældre, bestrålede eller immunkompromitterede mus12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aquasonic 100 Ultrasound Gel</td>
			<td>Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA)</td>
			<td>01-01</td>
			<td>Sterile Ultrasound Transmission Gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;CAG-luc, -GFP mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>025854</td>
			<td>Bioluminescence cell source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin Syringes with needle</td>
			<td>Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td>328431</td>
			<td>Ultra-fine needle - 12.7 mm, 30 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mouse - aged</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>000664</td>
			<td>age 6 months old; aged model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mouse - young</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>000664</td>
			<td>age 4-6 weeks; young model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloraprep One-step 0.67 mL</td>
			<td>CareFusion (El Paso, TX, USA)</td>
			<td>260449</td>
			<td>chlorhexidine gluconate applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curity Cotton Tipped Applicator</td>
			<td>Cardinal Health (Dublin, OH, USA)</td>
			<td>A5000-2</td>
			<td>Sterile, 6&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA)</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein (Melville, NY, USA)</td>
			<td>1182097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina X5</td>
			<td>PerkinElmer (Melville, NY, USA)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>In vivo bioluminescence imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J:NU mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>007850</td>
			<td>Athymic nude model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kendall Hypoallergenic Paper Tape</td>
			<td>Cardinal Health (Dublin, OH, USA)</td>
			<td>1914C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Surgical Nitrile Gloves</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA)</td>
			<td>56892</td>
			<td>Sterile Gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair Hair Remover Lotion</td>
			<td>Church and Dwight (Trenton, NJ, USA)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Depilatory agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD scid gamma (NSG) mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>005557</td>
			<td>Immunodeficient model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x</td>
			<td>Corning (Corning, NY, USA)</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>Med Vet International</td>
			<td>PH-PURALUBE-VET</td>
			<td>Eye ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheathes</td>
			<td>Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA)</td>
			<td>10040</td>
			<td>Sterile Ultrasound Probe Covers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sure-Seal Induction Chamber</td>
			<td>Braintree Scientific (Braintree, MA, USA)</td>
			<td>EZ-17 85</td>
			<td>Anesthesia induction chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer MX550D</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue, 0.4% solution in PBS</td>
			<td>MP Biomedicals (Solon, OH, USA)</td>
			<td>91691049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 3100 Imaging System</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Ultrasound imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 3100 Lab Software</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Version 3.2.7 for imaging and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Compact Dual Anesthesia System</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Tabletop isoflurane-based anesthesia unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Imaging Station</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Procedural platform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a minimally invasive, accurate, and efficient technique for intrathymic injection in mice

Intrathymisk injektion i musemodeller er en vigtig teknik til undersøgelse af thymisk og immunfunktion, herunder genetiske og erhvervede T-celleforstyrrelser. Dette kræver metoder til direkte aflejring af reagenser og/eller celler i thymus hos levende mus. Traditionelle metoder til intrathymisk injektion omfatter thoraxkirurgi eller minimalt invasive perkutane blinde injektioner, som begge har betydelige begrænsninger. Ultrahøjfrekvente ultralydsbilleddannelsesenheder har gjort billedstyrede perkutane injektioner mulige hos mus, hvilket i høj grad forbedrer injektionsnøjagtigheden af den perkutane injektionsmetode og muliggør injektion af mindre mål. Imidlertid er billedstyrede injektioner afhængige af brugen af et integreret skinnesystem, hvilket gør dette til en stiv og tidskrævende procedure. En unik, sikker og effektiv metode til perkutane intrathymiske injektioner i mus præsenteres her, hvilket eliminerer afhængigheden af jernbanesystemet til injektioner. Teknikken er afhængig af at bruge en mikro-ultralydsenhed med høj opløsning til at afbilde musen thymus ikke-invasivt. Ved hjælp af en frihåndsteknik kan en radiolog placere en nålespids direkte i musens thymus under sonografisk vejledning. Mus rengøres og bedøves inden billeddannelse. For en erfaren radiolog, der er dygtig til ultralydsstyrede procedurer, er læringsperioden for den angivne teknik ret kort, typisk inden for en session. Metoden har en lav sygelighed og dødelighed for musene og er meget hurtigere end de nuværende mekanisk assisterede teknikker til perkutan injektion. Det giver investigator mulighed for effektivt at udføre præcise og pålidelige perkutane injektioner af thymuses af enhver størrelse (herunder meget små organer såsom thymus af ældre eller immundefekte mus) med minimal belastning på dyret. Denne metode muliggør injektion af individuelle lapper, hvis det ønskes, og letter store eksperimenter på grund af procedurens tidsbesparende karakter.

Den vellykkede implementering af denne teknik afhænger af et par vigtige trin, der skal følges. For det første skal der sikres pålidelig identifikation af selve thymuskirtlen. Hos unge mus er dette ligetil på grund af kirtlens store størrelse (figur 3A). Hos ældre mus eller immundefekte mus kan det være mere udfordrende; det er dog stadig meget muligt med moderne ultralydsudstyr (figur 3B, C). For det andet er det kritisk vigtigt at inds...

Watch this Scientific Journal Video about A Minimally Invasive, Accurate, and Efficient Technique for Intrathymic Injection in Mice at JoVE.com

A Minimally Invasive, Accurate, and Efficient Technique for Intrathymic Injection in Mice

Den nuværende protokol beskriver en interventionel radiologiprocedure, der er etableret til intrathymisk injektion i mus for at undgå risikoen for åben kirurgi og forbedre nøjagtigheden af blinde perkutane injektioner.

En minimalt invasiv, nøjagtig og effektiv teknik til intrathymisk injektion i mus

Intrathymic injection in mouse models is an important technique for studying thymic and immune function, including genetic and acquired T cell disorders. ...

Protokollen giver et nøjagtigt, sikkert og effektivt ikke-kirurgisk alternativ til traditionelle kirurgiske og blinde injektionsmetoder. Det er også den mest nøjagtige injektionsteknik til atrofi thymuses hos gamle eller immundefekte mus. Den vigtigste fordel er en minimalt stressende injektionsprocedure, der er meget sikker og præcis, men også hurtig, hvilket muliggør store eksperimenter uden datakompromis fra kirurgisk stressrelateret immunsuppression.Det kræver lidt øvelse at opretholde justeringen af nålen og transduceren, mens den føres gennem brystvæggen. Vi anbefaler derfor at samarbejde med en erfaren interventionel radiolog for at udføre injektioner eller give træning. Shaina Anuncio, en tekniker fra mit laboratorium, hjælper med at demonstrere proceduren.Til at begynde med påføres et tyndt lag hårfjerningscreme på musenes forreste brystområde i mindre end et minut for at fjerne pelsen. Brug et vådt køkkenrulle til at fjerne cremen og den løse pels. Bekræft den passende bedøvelsesdybde ved ikke at reagere på bagpoteklemmen.Påfør oftalmisk salve på begge øjne for at forhindre hornhindetørring. Placer en mus ad gangen i liggende stilling på den opvarmede platform på ultralydsbilledstationen til små dyr med næsekeglen på plads. Fastgør musen til scenen med medicinsk tape ved bag- og forbenene.Desinficer den pelsfri øvre thoraxhud ved hjælp af en chlorhexidingluconatapplikator. Aktiver den højeste tilgængelige lineære sonde. Typisk sonden med den højeste rumlige opløsning for størrelsen af det dyr, der afbildes.Aktivér sonden ved at trykke på den tilsvarende knap efter startskærmen. For at optimere ultralydsindstillingerne til billeddannelse og injektion skal du justere synsdybden til en passende størrelse for måldyret ved at justere de lodret orienterede skydere på højre side af skærmen. Juster gråskalaforstærkningen ved at skubbe knappen langs den vandrette bjælke nederst på skærmen.Juster derefter fokuszonen til det forventede niveau af thymus. Påfør ca. en milliliter ultralydsgel på transduceroverfladen, mens den er oprejst, enten hvilende i ultralydsmaskinholderen eller i hænderne på en assistent. For at forberede et lille sterilt felt ved siden af den opvarmede platform skal du tømme et sterilt sondedæksel, elastik, sterile handsker og steril ultralydsgel på det sterile felt.Tag derefter de sterile handsker på. Placer forsigtigt det sterile sondedæksel over ultralydstransduceren og gelen. For at opretholde sterilitet skal du kun røre ved det sterile dæksel.Skub det sterile gummibånd over sondedækslet for at holde det på plads. Placer to til tre milliliter steril ultralydsgel på transduceren. Placer ultralydssonden lodret på den desinficerede del af musens forreste brystvæg til indledende billeddannelse, samtidig med at steriliteten opretholdes.Se og optimer ultralydsbilledet som vist tidligere. For at scanne musens forreste bryst i et tværgående plan skal du holde transduceren lodret og bevæge den op og ned fra halsen til maven i en pensellignende eller fejende bevægelse. Med hjertet centreret i synsfeltet skal du feje transduceren lidt mod nakken.Bemærk de to runde parrede sorte strukturer på hver side af det øverste bryst. Brug ultralydssonden til at lokalisere den bredeste del af thymus, som normalt er det ideelle målsted for injektion. Forvent en vandret nålebane på det valgte sted, og bemærk, hvor de store blodkar er placeret på dette sted.Disse beholdere bør undgås under injektionen. Blodkarrene vil være hypoechoiske pulsatile strukturer. Hvis du er usikker, skal du aktivere farvedopplertilstanden ved at trykke på farveknappen på skærmen for at kontrollere, om der er flow i karrene.Hold transduceren i den ene hånd og en 30-gauge insulinnål med 10 mikroliter injektion i den anden. For at starte injektionsprocessen skal du flytte transduceren sideværts, så thymus er off-center i ultralydsfeltet. Sørg for, at den anden side af synsfeltet består af for det meste ultralydsgel og intet andet.Placer spidsen af nålen i gelen under transduceren, og flyt langsomt nålen, indtil den visualiseres ved siden af hudoverfladen. Mens du kontinuerligt billeddanner nålen under ultralyd, skal du indsætte nålen i thymuskirtlen med en perkutan bane væk fra blodkarrene. Brug en kryds thymus vandret bane til at placere nålespidsen i den thymiske lap kontralateralt til indgangsstedet.Når nålespidsen er inde i den ønskede del af thymusen, injiceres indholdet hurtigt fra 30-gauge sprøjten, mens du bruger sonografisk visualisering. For at stabilisere sprøjten under nåleindsættelse og injektion skal du holde sprøjten mellem tommelfingeren og den tredje finger og styre sprøjtestemplet med pegefingeren. Fjern nålen, når alt indholdet er deponeret.Hos unge mus var det ligetil at identificere thymuskirtlen på grund af kirtlens store størrelse. Det var mere udfordrende hos ældre eller immundefekte mus. Det var dog stadig meget muligt med moderne ultralydsudstyr.Vellykket injektion blev bemærket, når nålen ikke krydsede kritiske strukturer, såsom hjertet, aorta eller en af de ringere vena cavae. Nålespidsen blev visualiseret i sin målplacering under injektionen, hvilket bekræftede den intrathymiske aflejring. Den intrathymiske placering af injektionen blev bekræftet ved anvendelse af Luciferin som et injektionsmiddel i luciferase transgene mus.Disse blev straks evalueret med bioluminescensbilleddannelse, hvilket bekræftede injektionens korrekte placering uden at ofre dyret. Alternativt blev Trypan Blue injiceret som en visuel markør for injektionsstedet og injektionsnøjagtigheden ved hjælp af ex vivo med obduktion. Vores gruppe har brugt denne teknik til flere store undersøgelser, herunder forskning i kræftimmunterapi, baseret på injektion af genetisk modificerede stamceller og til forbedring af thymisk funktion hos immundefekte mus.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

Ikke-invasiv optisk billeddannelse af lymfatisk vaskulatur på en mus

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodalitet Imaging af<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infektioner i mus

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

Systemisk injektion af neurale stam / stamceller i mus med kronisk EAE

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

En effektiv og High Yield Metode til Isolering af Mouse Dendritiske celle-undergrupper

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

En simpel og effektiv tilgang til Construct Mutant vacciniavirus Vektorer

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

En ikke-invasiv og Teknisk Ikke-intensive Metode til induktion og fænotype for Eksperimentel bakteriel lungebetændelse i mus

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Induktion af lammelse og visuelle System skade i mus af T celler specifik for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Højeffektiv Transfection af primær makrofager med in vitro transkriberet mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...