Name: a minimally invasive, accurate, and efficient technique for intrathymic injection in mice
Uploaded: 2022-08-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Minimally Invasive, Accurate, and Efficient Technique for Intrathymic Injection in Mice at JoVE.com

We willen Raymond H. Thornton bedanken voor zijn inzichtelijke en uitgebreide vroege werk aan deze techniek. Deze studie werd gefinancierd door subsidiesteun van het National Cancer Institute (NCI 1R37CA250661-01A1), de Children's Leukemia Research Association, de Hackensack Meridian School of Medicine en de HUMC Foundation / Tackle Kids Cancer.

Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor dierverzorging in het Center for Discovery and Innovation (IACUC-protocol 290). Voor de huidige studie, C57BL / 6 muizen (vrouwelijk, 4-6 weken oud), C57BL / 6 muizen (vrouwelijk, 6 maanden oud), J: NU vrouwelijke muizen, NOD scid gamma (NSG) vrouwelijke muizen en B6; CAG-luc, -GFP-muizen werden gebruikt als respectievelijk het jonge muismodel, het verouderde muismodel, het athymische naaktmodel, het immunodeficiënte model en de bioluminescenti...

<ol>
	<li>Chinn, I. K., Blackburn, C. C., Manley, N. R., Sempowski, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+primary+lymphoid+organs+with+aging.">Changes in primary lymphoid organs with aging.</a> Seminars in Immunology. 24 (5), 309-320 (2012).</li><li>Gruver, A. L., Sempowski, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines,+leptin,+and+stress-induced+thymic+atrophy.">Cytokines, leptin, and stress-induced thymic atrophy.</a> Journal of Leukocyte Biology. 84 (4), 915-923 (2008).</li><li>Masopust, D., Sivula, C. P., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice,+dirty+mice,+and+men:+Using+mice+to+understand+human+immunology.">Of mice, dirty mice, and men: Using mice to understand human immunology.</a> Journal of Immunology. 199 (2), 383-388 (2017).</li><li>Mukherjee, P., Roy, S., Ghosh, D., Nandi, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+animal+models+in+biomedical+research:+a+review.">Role of animal models in biomedical research: a review.</a> Laboratory Animals Research. 38 (1), 18 (2022).</li><li>McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+tolerance:+What+have+we+learned+from+mice.">Central tolerance: What have we learned from mice.</a> Seminars in Immunopathology. 30 (4), 399-409 (2008).</li><li>Zlotoff, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7+and+CCR9+together+recruit+hematopoietic+progenitors+to+the+adult+thymus.">CCR7 and CCR9 together recruit hematopoietic progenitors to the adult thymus.</a> Blood. 115 (10), 1897-1905 (2010).</li><li>Vukmanovic, S., Grandea, A. G., Faas, S. J., Knowles, B. B., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+selection+of+T-lymphocytes+induced+by+intrathymic+injection+of+a+thymic+epithelial+cell+line.">Positive selection of T-lymphocytes induced by intrathymic injection of a thymic epithelial cell line.</a> Nature. 359 (6397), 729-732 (1992).</li><li>Schwarz, B. A., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+hematopoietic+progenitors+with+T+lineage+potential.">Circulating hematopoietic progenitors with T lineage potential.</a> Nature Immunology. 5 (9), 953-960 (2004).</li><li>Marodon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+antigen-specific+tolerance+by+intrathymic+injection+of+lentiviral+vectors.">Induction of antigen-specific tolerance by intrathymic injection of lentiviral vectors.</a> Blood. 108 (9), 2972-2978 (2006).</li><li>Adjali, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+correction+of+ZAP-70+immunodeficiency+by+intrathymic+gene+transfer.">In vivo correction of ZAP-70 immunodeficiency by intrathymic gene transfer.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (8), 2287-2295 (2005).</li><li>Tuckett, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-guided+intrathymic+injection+of+multipotent+stem+cells+supports+life-long+T+cell+immunity+and+facilitates+targeted+immunotherapy.">Image-guided intrathymic injection of multipotent stem cells supports life-long T cell immunity and facilitates targeted immunotherapy.</a> Blood. 123 (18), 2797-2805 (2014).</li><li>Tuckett, A. Z., Thornton, R. H., O'Reilly, R. J., vanden Brink, M. R. M., Zakrzewski, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathymic+injection+of+hematopoietic+progenitor+cells+establishes+functional+T+cell+development+in+a+mouse+model+of+severe+combined+immunodeficiency.">Intrathymic injection of hematopoietic progenitor cells establishes functional T cell development in a mouse model of severe combined immunodeficiency.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 10 (1), 109 (2017).</li><li>Hogan, B. V., Peter, M. B., Shenoy, H. G., Horgan, K., Hughes, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgery+induced+immunosuppression.">Surgery induced immunosuppression.</a> Surgeon. 9 (1), 38-43 (2011).</li><li>Blair-Handon, R., Mueller, K., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+method+for+intrathymic+injections+in+mice.">An alternative method for intrathymic injections in mice.</a> Laboratory Animals. 39 (8), 248-252 (2010).</li><li>Tuckett, A. Z., Zakrzewski, J. L., Li, D., vanden Brink, M. R., Thornton, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-hand+ultrasound+guidance+permits+safe+and+efficient+minimally+invasive+intrathymic+injections+in+both+young+and+aged+mice.">Free-hand ultrasound guidance permits safe and efficient minimally invasive intrathymic injections in both young and aged mice.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (4), 1105-1111 (2015).</li><li>K&#252;ker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+value+of+necropsy+reports+for+animal+health+surveillance.">The value of necropsy reports for animal health surveillance.</a> BMC Veterinary Research. 14 (1), 191 (2018).</li><li>Sinclair, C., Bains, I., Yates, A. J., Seddon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+thymocyte+death+underlies+the+CD4:CD8+T-cell+ratio+in+the+adaptive+immune+system.">Asymmetric thymocyte death underlies the CD4:CD8 T-cell ratio in the adaptive immune system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2905-2914 (2013).</li><li>Manna, S., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathymic+injection.">Intrathymic injection.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).</li><li>de la Cueva, T., Naranjo, A., de la Cueva, E., Rubio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+intrathymic+injection+in+mice.">Refinement of intrathymic injection in mice.</a> Laboratory Animals. 36 (5), 27-32 (2007).</li></ol>

Een echogeleide injectie met vrije hand is een zeer nauwkeurige techniek om studiemateriaal op een efficiënte en aseptische manier aan de thymus te leveren. Na de initiële sterilisatie van de huid op de injectieplaats, wordt de steriliteit tijdens de procedure gehandhaafd als gevolg van het gebruik van steriele handschoenen, steriele ultrasone sondehoezen en steriele ultrasone gel. In tegenstelling tot de blinde percutane benadering 10,17 of vertrouwen op chiru...

De thymus heeft een essentiële rol in de ontwikkeling en immuniteit van T-cellen. T-celdeficiëntie, die kan worden veroorzaakt door thymusinvolutie, genetische aandoeningen, infecties en kankerbehandelingen, leidt onder andere tot hoge mortaliteit en morbiditeit 1,2. Muismodellen zijn onmisbaar in zowel fundamenteel als translationeel immunologisch onderzoek en worden al tientallen jaren gebruikt om thymusbiologie en T-celontwikkeling te bestuderen, evenals om behandelingen te ontwikkelen voor mensen die lijden aan thymusdisfunctie en T-celdeficiëntie 3,4,5.
Een centraal onderdeel van thymusonderzoek is de intrathymische injectie van biologische materialen zoals cellen, genen of eiwitten in muismodellen 6,7,8,9,10,11,12. Conventionele intrathymische injectiemethoden gebruiken thoracotomie gevolgd door intrathymische injectie onder directe visualisatie of door "blinde" percutane injectie in het mediastinum. De chirurgische aanpak verhoogt onder andere het pneumothoraxrisico aanzienlijk. Bovendien resulteert de verhoogde stress tijdens deze operatie in immunosuppressie, waardoor immunologische gegevens mogelijk in gevaar komen13. Ervaren onderzoekers kunnen, na enige oefening, de blinde injectietechniek uitvoeren, maar deze aanpak is minder nauwkeurig en beperkt daarom experimentele proefpersonen tot jonge muizen met een grote thymus.
Het gebruik van ultrasone begeleiding is geïntroduceerd als een nauwkeurig en minimaal invasief alternatief voor traditionele intrathymische injectiebenaderingen14. Deze procedure is echter zeer tijdrovend bij het gebruik van het geïntegreerde railsysteem in plaats van de techniek met de vrije hand. Het uitvoeren van injecties met de injectiebevestiging vereist zorgvuldige beeldvormingsoptimalisatie en positionering van de transducer met behulp van de verschillende hulpstukken, zoals de transducerstandaard en -houder, het X-, Y- en Z-positioneringssysteem, evenals een bekwame bediening van de micromanipulatieregelaars en railsysteemuitbreidingen. Een eenvoudige alternatieve techniek, echogeleide thymusinjectie, wordt hier gepresenteerd door een radioloog met behulp van een benadering uit de vrije hand15, wat zowel een snel als nauwkeurig minimaal invasief alternatief is voor de hierboven beschreven methoden. Belangrijk is dat de huidige aanpak kan worden uitgevoerd met elk ultrasoon beeldvormingssysteem met hoge resolutie zonder dat een injectiebevestiging en een geïntegreerd railsysteem nodig zijn. Het is vooral nuttig voor studies die de injectie van grote aantallen muizenvereisen 11, voor experimenten met de injectie van beide thymuslobben, of voor de nauwkeurige injectie van kleine thymus bij verouderde, bestraalde of immuungecompromitteerde muizen12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aquasonic 100 Ultrasound Gel</td>
			<td>Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA)</td>
			<td>01-01</td>
			<td>Sterile Ultrasound Transmission Gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;CAG-luc, -GFP mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>025854</td>
			<td>Bioluminescence cell source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin Syringes with needle</td>
			<td>Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td>328431</td>
			<td>Ultra-fine needle - 12.7 mm, 30 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mouse - aged</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>000664</td>
			<td>age 6 months old; aged model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mouse - young</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>000664</td>
			<td>age 4-6 weeks; young model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloraprep One-step 0.67 mL</td>
			<td>CareFusion (El Paso, TX, USA)</td>
			<td>260449</td>
			<td>chlorhexidine gluconate applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curity Cotton Tipped Applicator</td>
			<td>Cardinal Health (Dublin, OH, USA)</td>
			<td>A5000-2</td>
			<td>Sterile, 6&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA)</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein (Melville, NY, USA)</td>
			<td>1182097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina X5</td>
			<td>PerkinElmer (Melville, NY, USA)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>In vivo bioluminescence imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J:NU mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>007850</td>
			<td>Athymic nude model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kendall Hypoallergenic Paper Tape</td>
			<td>Cardinal Health (Dublin, OH, USA)</td>
			<td>1914C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Surgical Nitrile Gloves</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA)</td>
			<td>56892</td>
			<td>Sterile Gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair Hair Remover Lotion</td>
			<td>Church and Dwight (Trenton, NJ, USA)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Depilatory agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD scid gamma (NSG) mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>005557</td>
			<td>Immunodeficient model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x</td>
			<td>Corning (Corning, NY, USA)</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>Med Vet International</td>
			<td>PH-PURALUBE-VET</td>
			<td>Eye ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheathes</td>
			<td>Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA)</td>
			<td>10040</td>
			<td>Sterile Ultrasound Probe Covers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sure-Seal Induction Chamber</td>
			<td>Braintree Scientific (Braintree, MA, USA)</td>
			<td>EZ-17 85</td>
			<td>Anesthesia induction chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer MX550D</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue, 0.4% solution in PBS</td>
			<td>MP Biomedicals (Solon, OH, USA)</td>
			<td>91691049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 3100 Imaging System</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Ultrasound imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 3100 Lab Software</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Version 3.2.7 for imaging and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Compact Dual Anesthesia System</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Tabletop isoflurane-based anesthesia unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Imaging Station</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Procedural platform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a minimally invasive, accurate, and efficient technique for intrathymic injection in mice

Intrathymische injectie in muismodellen is een belangrijke techniek voor het bestuderen van thymus- en immuunfunctie, inclusief genetische en verworven T-celaandoeningen. Dit vereist methoden voor de directe afzetting van reagentia en/of cellen in de thymus van levende muizen. Traditionele methoden van intrathymische injectie omvatten thoracale chirurgie of minimaal invasieve percutane blinde injecties, die beide aanzienlijke beperkingen hebben. Ultra-hoogfrequente ultrasone beeldvormingsapparaten hebben beeldgeleide percutane injecties mogelijk gemaakt bij muizen, waardoor de injectienauwkeurigheid van de percutane injectiebenadering aanzienlijk is verbeterd en de injectie van kleinere doelen mogelijk is geworden. Beeldgeleide injecties zijn echter afhankelijk van het gebruik van een geïntegreerd railsysteem, waardoor dit een rigide en tijdrovende procedure is. Een unieke, veilige en efficiënte methode voor percutane intrathymische injecties bij muizen wordt hier gepresenteerd, waardoor de afhankelijkheid van het railsysteem voor injecties wordt geëlimineerd. De techniek is gebaseerd op het gebruik van een micro-echografie-eenheid met hoge resolutie om de thymus van de muis niet-invasief in beeld te brengen. Met behulp van een techniek met de vrije hand kan een radioloog onder echografische begeleiding een naaldpunt rechtstreeks in de thymus van de muis plaatsen. Muizen worden gereinigd en verdoofd voordat ze in beeld worden gebracht. Voor een ervaren radioloog die bedreven is in echogeleide procedures, is de leerperiode voor de vermelde techniek vrij kort, meestal binnen één sessie. De methode heeft een lage morbiditeit en mortaliteit voor de muizen en is veel sneller dan de huidige mechanisch ondersteunde technieken voor percutane injectie. Het stelt de onderzoeker in staat om efficiënt nauwkeurige en betrouwbare percutane injecties van thymuses van elke grootte uit te voeren (inclusief zeer kleine organen zoals de thymus van verouderde of immunodeficiënte muizen) met minimale stress voor het dier. Deze methode maakt de injectie van individuele lobben indien gewenst mogelijk en vergemakkelijkt grootschalige experimenten vanwege het tijdbesparende karakter van de procedure.

De succesvolle implementatie van deze techniek is afhankelijk van een paar belangrijke stappen die moeten worden gevolgd. Ten eerste moet een betrouwbare identificatie van de thymus zelf worden gewaarborgd. Bij jonge muizen is dit eenvoudig vanwege de grote omvang van de klier (figuur 3A). Bij oudere muizen of immunodeficiënte muizen kan het uitdagender zijn; het is echter nog steeds zeer goed mogelijk met moderne ultrasone apparatuur (figuur 3B, C</str...

Watch this Scientific Journal Video about A Minimally Invasive, Accurate, and Efficient Technique for Intrathymic Injection in Mice at JoVE.com

A Minimally Invasive, Accurate, and Efficient Technique for Intrathymic Injection in Mice

Het huidige protocol beschrijft een interventionele radiologieprocedure die is vastgesteld voor intrathymische injectie bij muizen om het risico van open chirurgie te vermijden en de nauwkeurigheid van blinde percutane injecties te verbeteren.

Een minimaal invasieve, nauwkeurige en efficiënte techniek voor intrathymische injectie bij muizen

Intrathymic injection in mouse models is an important technique for studying thymic and immune function, including genetic and acquired T cell disorders. ...

Het protocol biedt een nauwkeurig, veilig en efficiënt niet-chirurgisch alternatief voor traditionele chirurgische en blinde injectiemethoden. Het is ook de meest nauwkeurige injectietechniek voor atrofie thymus bij oudere of immunodeficiënte muizen. Het belangrijkste voordeel is een minimaal stressvolle injectieprocedure die zeer veilig en nauwkeurig is, maar ook snel, waardoor grootschalige experimenten mogelijk zijn zonder gegevenscompromittering door chirurgische stressgerelateerde immunosuppressie.Het handhaven van de uitlijning van de naald en transducer terwijl deze door de borstwand wordt geschoven, vergt enige oefening. We raden daarom aan om samen te werken met een ervaren interventieradioloog om injecties uit te voeren of training te geven. Shaina Anuncio, een technicus van mijn laboratorium, zal helpen om de procedure te demonstreren.Breng om te beginnen een dunne laag ontharingscrème aan op het voorste borstgebied van de muizen gedurende minder dan een minuut om de vacht te verwijderen. Gebruik een natte papieren handdoek om de crème en losse vacht te verwijderen. Bevestig de juiste verdovingsdiepte door niet te reageren op de achterpootknel.Breng oogheelkundige zalf aan op beide ogen om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen. Plaats één muis tegelijk in rugligging op het verwarmde platform van het echografiestation voor kleine dieren met de neuskegel op zijn plaats. Bevestig de muis aan het podium met medische plakband aan de achter- en voorpoten.Desinfecteer de bontvrije bovenste thoraxhuid met behulp van een chloorhexidinegluconaatapplicator. Activeer de lineaire sonde met de hoogste frequentie die beschikbaar is. Meestal is de sonde met de hoogste ruimtelijke resolutie voor de grootte van het dier dat wordt afgebeeld.Activeer de sonde door op de bijbehorende knop te tikken na het opstartscherm. Om de ultrasone instellingen voor beeldvorming en injectie te optimaliseren, past u de diepte van het gezichtsveld aan op een geschikte grootte voor het doeldier door de verticaal georiënteerde schuifregelaars aan de rechterkant van het scherm aan te passen. Pas de grijsschaalversterking aan door de knop langs de horizontale balk aan de onderkant van het scherm te schuiven.Pas vervolgens de focuszone aan het verwachte niveau van de thymus aan. Breng ongeveer één milliliter ultrasone gel aan op het oppervlak van de transducer terwijl deze rechtop staat, rustend in de houder van het echoapparaat of in de handen van een assistent. Om een klein steriel veld naast het verwarmde platform te bereiden, leegt u een steriele sondedeksel, elastiek, steriele handschoenen en steriele ultrasone gel op het steriele veld.Trek vervolgens de steriele handschoenen aan. Plaats de steriele sondeklep voorzichtig over de ultrasone transducer en gel. Om de steriliteit te behouden, raakt u alleen de steriele hoes aan.Schuif de steriele rubberen band over het sondedeksel om deze op zijn plaats te houden. Plaats twee tot drie milliliter steriele ultrasone gel op de transducer. Plaats de ultrasone gel-topped probe verticaal op het gedesinfecteerde deel van de voorste borstwand van de muis voor de eerste beeldvorming, met behoud van steriliteit.Bekijk en optimaliseer het echografiebeeld zoals eerder gedemonstreerd. Om de voorste borst van de muis in een dwarsvlak te scannen, houdt u de transducer verticaal en beweegt u deze op en neer van de nek naar de buik in een penseelachtige of veegbeweging. Met het hart gecentreerd in het gezichtsveld, veegt u de transducer iets naar de nek.Let op de twee ronde gepaarde zwarte structuren aan weerszijden van de bovenste borst. Lokaliseer met behulp van de ultrasone sonde het breedste deel van de thymus, wat meestal de ideale doelplaats voor injectie is. Anticipeer op een horizontaal naaldtraject op de gekozen locatie en noteer waar de belangrijkste bloedvaten zich op deze locatie bevinden.Deze vaten moeten tijdens de injectie worden vermeden. De bloedvaten zullen hypoechoïsche pulsatiele structuren zijn. Als u het niet zeker weet, activeert u de dopplermodus in kleur door op de kleurknop op het scherm te tikken om te controleren op stroming in de vaten.Houd de transducer in de ene hand en een 30-gauge insulinenaald met 10 microliter injectaat in de andere. Om het injectieproces te starten, verplaatst u de transducer lateraal, zodat de thymus uit het midden in het ultrasone gezichtsveld ligt. Zorg ervoor dat de andere kant van het gezichtsveld voornamelijk bestaat uit ultrasone gel en niets anders.Plaats de punt van de naald in de gel onder de transducer en beweeg de naald langzaam totdat deze naast het huidoppervlak wordt gevisualiseerd. Terwijl u de naald continu in beeld brengt onder echografie, steekt u de naald in de thymusklier met een percutaan traject weg van de bloedvaten. Gebruik een kruis thymus horizontaal traject om de naaldpunt in de thymuskwab te plaatsen die contralateraal is voor de ingangsplaats.Zodra de naaldpunt zich in het gewenste deel van de thymus bevindt, injecteert u snel de inhoud van de 30-gauge spuit met behulp van echografische visualisatie. Om de spuit te stabiliseren tijdens het inbrengen en injecteren van de naald, houdt u de spuit tussen de duim en de derde vinger en bedient u de zuiger van de spuit met de wijsvinger. Verwijder de naald nadat alle inhoud is gedeponeerd.Bij jonge muizen was het identificeren van de thymusklier eenvoudig vanwege de grote omvang van de klier. Het was uitdagender bij oudere of immunodeficiënte muizen. Het was echter nog steeds zeer haalbaar met moderne echoapparatuur.Succesvolle injectie werd opgemerkt wanneer de naald geen kritieke structuren doorkruiste, zoals het hart, de aorta of een van de inferieure vena cavae. De naaldpunt werd tijdens de injectie op de doellocatie gevisualiseerd, wat de intrathymische afzetting bevestigde. De intrathymische locatie van de injectie werd bevestigd met Luciferine als injectaat in luciferase transgene muizen.Deze werden onmiddellijk geëvalueerd met bioluminescentiebeeldvorming, die de juiste locatie van de injectie bevestigde zonder het dier op te offeren. Als alternatief werd Trypan Blue geïnjecteerd als een visuele marker van de injectieplaats en de nauwkeurigheid van de injectie met behulp van ex vivo met obductie. Onze groep heeft deze techniek gebruikt voor verschillende grote studies, waaronder onderzoek naar kankerimmunotherapie, gebaseerd op de injectie van genetisch gemodificeerde voorlopercellen, en om de thymusfunctie bij immunodeficiënte muizen te verbeteren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Niet-invasieve beeldvorming van Leukocyte Homing en migratie In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

Een methode voor het labelen van bloedvaten in Embryonic Muizen

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

Niet-invasieve optische beeldvorming van de lymfatische vasculatuur van een muis

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D multimodale beeldvorming van<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infecties in Muizen

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

Systemische Injectie van neurale stamcellen / progenitorcellen in Muizen met chronische EAE

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Een efficiënte en High Yield methode voor het isoleren van de muis dendritische cel subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Een eenvoudige en efficiënte aanpak Mutant Vaccinia Virus vectoren Construct

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Een niet-invasieve en Technisch Niet-intensieve methode voor Inductie en fenotypering van experimentele bacteriële longontsteking in Muizen

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Inductie van verlamming en visuele systeem schade in muizen door T cellen specifiek voor Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Zeer efficiënte transfectie van primaire macrofagen met in vitro getranscribeerd mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...