Name: a minimally invasive, accurate, and efficient technique for intrathymic injection in mice
Uploaded: 2022-08-23T14:00:00
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Nous tenons à remercier Raymond H. Thornton pour ses premiers travaux perspicaces et complets sur cette technique. Cette étude a été financée par des subventions du National Cancer Institute (NCI 1R37CA250661-01A1), de la Children’s Leukemia Research Association, de la Hackensack Meridian School of Medicine et de la HUMC Foundation / Tackle Kids Cancer.

Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux directives de soins aux animaux du Center for Discovery and Innovation (protocole IACUC 290). Pour la présente étude, souris C57BL/6 (femelles, 4-6 semaines), souris C57BL/6 (femelles, 6 mois), souris femelles J:NU, souris femelles NOD scid gamma (NSG) et B6; Les souris CAG-luc, -GFP ont été utilisées comme modèle de jeune souris, modèle de souris âgée, modèle nu athymique, modèle immunodéficient et source cellulaire de bioluminescence, respective...

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Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-guided+intrathymic+injection+of+multipotent+stem+cells+supports+life-long+T+cell+immunity+and+facilitates+targeted+immunotherapy.">Image-guided intrathymic injection of multipotent stem cells supports life-long T cell immunity and facilitates targeted immunotherapy.</a> Blood. 123 (18), 2797-2805 (2014).</li><li>Tuckett, A. Z., Thornton, R. H., O'Reilly, R. J., vanden Brink, M. R. M., Zakrzewski, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathymic+injection+of+hematopoietic+progenitor+cells+establishes+functional+T+cell+development+in+a+mouse+model+of+severe+combined+immunodeficiency.">Intrathymic injection of hematopoietic progenitor cells establishes functional T cell development in a mouse model of severe combined immunodeficiency.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 10 (1), 109 (2017).</li><li>Hogan, B. V., Peter, M. B., Shenoy, H. G., Horgan, K., Hughes, T. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-hand+ultrasound+guidance+permits+safe+and+efficient+minimally+invasive+intrathymic+injections+in+both+young+and+aged+mice.">Free-hand ultrasound guidance permits safe and efficient minimally invasive intrathymic injections in both young and aged mice.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (4), 1105-1111 (2015).</li><li>K&#252;ker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+value+of+necropsy+reports+for+animal+health+surveillance.">The value of necropsy reports for animal health surveillance.</a> BMC Veterinary Research. 14 (1), 191 (2018).</li><li>Sinclair, C., Bains, I., Yates, A. J., Seddon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+thymocyte+death+underlies+the+CD4:CD8+T-cell+ratio+in+the+adaptive+immune+system.">Asymmetric thymocyte death underlies the CD4:CD8 T-cell ratio in the adaptive immune system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2905-2914 (2013).</li><li>Manna, S., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathymic+injection.">Intrathymic injection.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).</li><li>de la Cueva, T., Naranjo, A., de la Cueva, E., Rubio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+intrathymic+injection+in+mice.">Refinement of intrathymic injection in mice.</a> Laboratory Animals. 36 (5), 27-32 (2007).</li></ol>

Une injection à main levée guidée par ultrasons est une technique très précise pour administrer du matériel d’étude au thymus de manière efficace et aseptique. Après la stérilisation initiale de la peau au site d’injection, la stérilité est maintenue pendant la procédure grâce à l’utilisation de gants stériles, de couvercles de sonde à ultrasons stériles et de gel à ultrasons stérile. Contrairement à l’approche percutanée aveugle 10,17 ou au recours à des incisions chirurgicales pour la vis...

Le thymus joue un rôle essentiel dans le développement et l’immunité des lymphocytes T. La carence en lymphocytes T, qui peut être causée par l’involution thymique, les troubles génétiques, les infections et les traitements contre le cancer, entre autres facteurs, entraîne une mortalité et une morbidité élevées 1,2. Les modèles murins sont indispensables dans la recherche en immunologie fondamentale et translationnelle et sont utilisés depuis des décennies pour étudier la biologie thymique et le développement des lymphocytes T, ainsi que pour développer des traitements pour les personnes souffrant de dysfonction thymique et de déficit en lymphocytes T 3,4,5.
Une partie centrale des recherches thymiques a été l’injection intrathymique de matériel biologique tel que des cellules, des gènes ou des protéines dans les modèles murins 6,7,8,9,10,11,12. Les méthodes conventionnelles d’injection intrathymique utilisent la thoracotomie suivie d’une injection intrathymique sous visualisation directe ou d’une injection percutanée « aveugle » dans le médiastin. L’approche chirurgicale augmente considérablement le risque de pneumothorax, entre autres. De plus, le stress élevé pendant cette chirurgie entraîne une immunosuppression, compromettant ainsi potentiellement les données immunologiques13. Des chercheurs expérimentés, après un peu de pratique, peuvent effectuer la technique d’injection à l’aveugle, mais cette approche est moins précise et limite donc les sujets expérimentaux aux jeunes souris avec un gros thymus.
L’utilisation du guidage échographique a été introduite comme une alternative précise et peu invasive aux approches traditionnelles d’injection intrathymique14. Cependant, cette procédure prend beaucoup de temps lors de l’utilisation du système ferroviaire intégré au lieu de la technique à main levée. L’exécution d’injections avec le support d’injection nécessite une optimisation minutieuse de l’imagerie et le positionnement du transducteur à l’aide des différents accessoires tels que le support et le support du transducteur, le système de positionnement X, Y et Z, ainsi qu’un fonctionnement efficace des commandes de micro-manipulation et des extensions du système de rail. Une technique alternative simple, l’injection thymique guidée par ultrasons, est présentée ici par un radiologue utilisant une approche à main levée15, qui est à la fois une alternative mini-invasive rapide et précise aux méthodes décrites ci-dessus. Il est important de noter que l’approche actuelle peut être réalisée avec n’importe quel système d’imagerie par ultrasons haute résolution sans avoir besoin d’un support d’injection et d’un système de rail intégré. Il est particulièrement utile pour les études nécessitant l’injection d’un grand nombre de souris11, pour les expériences impliquant l’injection des deux lobes thymiques ou pour l’injection précise de petits thymus chez des souris âgées, irradiées ou immunodéprimées12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aquasonic 100 Ultrasound Gel</td>
			<td>Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA)</td>
			<td>01-01</td>
			<td>Sterile Ultrasound Transmission Gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;CAG-luc, -GFP mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>025854</td>
			<td>Bioluminescence cell source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin Syringes with needle</td>
			<td>Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td>328431</td>
			<td>Ultra-fine needle - 12.7 mm, 30 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mouse - aged</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>000664</td>
			<td>age 6 months old; aged model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mouse - young</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>000664</td>
			<td>age 4-6 weeks; young model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloraprep One-step 0.67 mL</td>
			<td>CareFusion (El Paso, TX, USA)</td>
			<td>260449</td>
			<td>chlorhexidine gluconate applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curity Cotton Tipped Applicator</td>
			<td>Cardinal Health (Dublin, OH, USA)</td>
			<td>A5000-2</td>
			<td>Sterile, 6&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA)</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein (Melville, NY, USA)</td>
			<td>1182097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina X5</td>
			<td>PerkinElmer (Melville, NY, USA)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>In vivo bioluminescence imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J:NU mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>007850</td>
			<td>Athymic nude model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kendall Hypoallergenic Paper Tape</td>
			<td>Cardinal Health (Dublin, OH, USA)</td>
			<td>1914C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Surgical Nitrile Gloves</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA)</td>
			<td>56892</td>
			<td>Sterile Gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair Hair Remover Lotion</td>
			<td>Church and Dwight (Trenton, NJ, USA)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Depilatory agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD scid gamma (NSG) mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>005557</td>
			<td>Immunodeficient model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x</td>
			<td>Corning (Corning, NY, USA)</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>Med Vet International</td>
			<td>PH-PURALUBE-VET</td>
			<td>Eye ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheathes</td>
			<td>Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA)</td>
			<td>10040</td>
			<td>Sterile Ultrasound Probe Covers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sure-Seal Induction Chamber</td>
			<td>Braintree Scientific (Braintree, MA, USA)</td>
			<td>EZ-17 85</td>
			<td>Anesthesia induction chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer MX550D</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue, 0.4% solution in PBS</td>
			<td>MP Biomedicals (Solon, OH, USA)</td>
			<td>91691049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 3100 Imaging System</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Ultrasound imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 3100 Lab Software</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Version 3.2.7 for imaging and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Compact Dual Anesthesia System</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Tabletop isoflurane-based anesthesia unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Imaging Station</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Procedural platform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a minimally invasive, accurate, and efficient technique for intrathymic injection in mice

L’injection intrathymique dans des modèles murins est une technique importante pour étudier la fonction thymique et immunitaire, y compris les troubles génétiques et les troubles des lymphocytes T acquis. Cela nécessite des méthodes pour le dépôt direct de réactifs et / ou de cellules dans le thymus de souris vivantes. Les méthodes traditionnelles d’injection intrathymique comprennent la chirurgie thoracique ou les injections percutanées à l’aveugle mini-invasives, qui ont toutes deux des limites importantes. Les appareils d’imagerie par ultrasons à ultra-haute fréquence ont rendu possibles les injections percutanées guidées par l’image chez la souris, améliorant considérablement la précision d’injection de l’approche d’injection percutanée et permettant l’injection de cibles plus petites. Cependant, les injections guidées par l’image reposent sur l’utilisation d’un système ferroviaire intégré, ce qui en fait une procédure rigide et longue. Une méthode unique, sûre et efficace pour les injections intrathymiques percutanées chez la souris est présentée ici, éliminant ainsi la dépendance au système de rail pour les injections. La technique repose sur l’utilisation d’une unité de micro-échographie à haute résolution pour imager le thymus de la souris de manière non invasive. En utilisant une technique à main levée, un radiologue peut placer une pointe d’aiguille directement dans le thymus de la souris sous guidage échographique. Les souris sont nettoyées et anesthésiées avant l’imagerie. Pour un radiologue expérimenté adepte des procédures guidées par ultrasons, la période d’apprentissage de la technique énoncée est assez courte, généralement en une séance. La méthode a un faible taux de morbidité et de mortalité pour les souris et est beaucoup plus rapide que les techniques assistées mécaniques actuelles pour l’injection percutanée. Il permet à l’investigateur d’effectuer efficacement des injections percutanées précises et fiables de thymus de toute taille (y compris de très petits organes tels que le thymus de souris âgées ou immunodéficientes) avec un stress minimal sur l’animal. Cette méthode permet l’injection de lobes individuels si désiré et facilite les expériences à grande échelle en raison de la nature rapide de la procédure.

La mise en œuvre réussie de cette technique repose sur quelques étapes clés à suivre. Tout d’abord, une identification fiable du thymus lui-même doit être assurée. Chez les jeunes souris, cela est simple en raison de la grande taille de la glande (Figure 3A). Chez les souris plus âgées ou immunodéficientes, cela peut être plus difficile; cependant, il est encore très faisable avec un équipement à ultrasons moderne (figure 3B, C)...

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A Minimally Invasive, Accurate, and Efficient Technique for Intrathymic Injection in Mice

Le présent protocole décrit une procédure de radiologie interventionnelle établie pour l’injection intrathymique chez la souris afin d’éviter le risque de chirurgie ouverte et d’améliorer la précision des injections percutanées à l’aveugle.

Une technique mini-invasive, précise et efficace pour l’injection intrathymique chez la souris

Intrathymic injection in mouse models is an important technique for studying thymic and immune function, including genetic and acquired T cell disorders. ...

Le protocole offre une alternative non chirurgicale précise, sûre et efficace aux méthodes d’injection chirurgicales et aveugles traditionnelles. C’est aussi la technique d’injection la plus précise pour les thymus atrophiques chez les souris âgées ou immunodéficientes. Le principal avantage est une procédure d’injection peu stressante, très sûre et précise, mais aussi rapide, permettant ainsi des expériences à grande échelle sans compromettre les données de l’immunosuppression chirurgicale liée au stress.Maintenir l’alignement de l’aiguille et du transducteur tout en l’avançant à travers la paroi thoracique demande un peu de pratique. Nous recommandons donc de collaborer avec un radiologue interventionnel expérimenté pour effectuer des injections ou fournir une formation. Shaina Anuncio, une technicienne de mon laboratoire, aidera à démontrer la procédure.Pour commencer, appliquez une fine couche de crème dépilatoire sur la région antérieure de la poitrine des souris pendant moins d’une minute pour enlever la fourrure. Utilisez une serviette en papier humide pour enlever la crème et la fourrure lâche. Confirmer la profondeur anesthésique appropriée en ne répondant pas au pincement de la patte postérieure.Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux pour prévenir le dessèchement de la cornée. Placez une souris à la fois en décubitus dorsal sur la plate-forme chauffée de la station d’imagerie par ultrasons pour petits animaux avec le cône nasal en place. Fixez la souris à la scène avec du ruban adhésif médical au niveau des membres postérieurs et antérieurs.Désinfectez la peau supérieure du thorax sans fourrure à l’aide d’un applicateur de gluconate de chlorhexidine. Activez la sonde linéaire la plus haute fréquence disponible. En règle générale, la sonde avec la résolution spatiale la plus élevée pour la taille de l’animal à imager.Activez la sonde en appuyant sur le bouton correspondant après l’écran de démarrage. Pour optimiser les paramètres d’échographie pour l’imagerie et l’injection, ajustez la profondeur du champ de vision à une taille appropriée pour l’animal cible en ajustant les curseurs orientés verticalement sur le côté droit de l’écran. Ajustez le gain de l’échelle de gris en faisant glisser le bouton le long de la barre horizontale en bas de l’écran.Ensuite, ajustez la zone focale au niveau anticipé du thymus. Appliquez environ un millilitre de gel à ultrasons sur la surface du transducteur pendant qu’il est debout, soit dans le support de l’appareil à ultrasons, soit dans les mains d’un assistant. Pour préparer un petit champ stérile à côté de la plate-forme chauffée, videz un couvercle de sonde stérile, un élastique, des gants stériles et un gel à ultrasons stérile sur le champ stérile.Ensuite, mettez les gants stériles. Placez soigneusement le couvercle de la sonde stérile sur le transducteur à ultrasons et le gel. Pour maintenir la stérilité, ne touchez que le couvercle stérile.Faites glisser l’élastique stérile sur le couvercle de la sonde pour le maintenir en place. Placez deux à trois millilitres de gel à ultrasons stérile sur le transducteur. Placez la sonde surmontée d’un gel à ultrasons verticalement sur la partie désinfectée de la paroi thoracique antérieure de la souris pour l’imagerie initiale, tout en maintenant la stérilité.Visualisez et optimisez l’image échographique comme démontré précédemment. Pour scanner la poitrine antérieure de la souris dans un plan transversal, tenez le transducteur verticalement et déplacez-le de haut en bas du cou à l’abdomen dans un mouvement de pinceau ou de balayage. Avec le cœur centré dans le champ de vision, balayez légèrement le transducteur vers le cou.Notez les deux structures noires rondes appariées de chaque côté de la partie supérieure de la poitrine. À l’aide de la sonde à ultrasons, localisez la partie la plus large du thymus, qui est généralement le site cible idéal pour l’injection. Anticipez une trajectoire horizontale de l’aiguille à l’endroit choisi et notez où se trouvent les principaux vaisseaux sanguins à cet endroit.Ces vaisseaux doivent être évités pendant l’injection. Les vaisseaux sanguins seront des structures pulsatiles hypoéchogènes. En cas de doute, activez le mode Doppler couleur en appuyant sur le bouton de couleur à l’écran pour vérifier le débit dans les vaisseaux.Tenez le transducteur dans une main et une aiguille à insuline de calibre 30 avec 10 microlitres d’injecter dans l’autre. Pour commencer le processus d’injection, déplacez le transducteur latéralement de sorte que le thymus soit décentré dans le champ de vision de l’échographie. Assurez-vous que l’autre côté du champ de vision se compose principalement de gel à ultrasons et de rien d’autre.Placez la pointe de l’aiguille dans le gel sous le transducteur et déplacez lentement l’aiguille jusqu’à ce qu’elle soit visualisée à côté de la surface de la peau. Tout en visualisant continuellement l’aiguille sous échographie, insérez l’aiguille dans le thymus avec une trajectoire percutanée loin des vaisseaux sanguins. Utilisez une trajectoire horizontale transversale du thymus pour placer l’extrémité de l’aiguille dans le lobe thymique controlatéral au site d’entrée.Une fois que l’extrémité de l’aiguille est à l’intérieur de la partie souhaitée du thymus, injectez rapidement le contenu de la seringue de calibre 30 tout en utilisant la visualisation échographique. Pour stabiliser la seringue pendant l’insertion et l’injection de l’aiguille, tenez la seringue entre le pouce et le troisième doigt et contrôlez le piston de la seringue avec l’index. Retirez l’aiguille une fois que tout le contenu a été déposé.Chez les jeunes souris, l’identification du thymus était simple en raison de la grande taille de la glande. C’était plus difficile chez les souris plus âgées ou immunodéficientes. Cependant, c’était encore très faisable avec un équipement à ultrasons moderne.Une injection réussie a été notée lorsque l’aiguille n’a pas traversé des structures critiques, telles que le cœur, l’aorte ou l’une des veines caves inférieures. La pointe de l’aiguille a été visualisée à son emplacement cible pendant l’injection, confirmant le dépôt intrathymique. L’emplacement intrathymique de l’injection a été confirmé en utilisant Luciferin comme injecter dans des souris transgéniques luciférase.Ceux-ci ont été évalués immédiatement par imagerie par bioluminescence, confirmant l’emplacement correct de l’injection sans sacrifier l’animal. Alternativement, le bleu de trypan a été injecté comme marqueur visuel du site d’injection et de la précision de l’injection en utilisant ex vivo avec nécropsie. Notre groupe a utilisé cette technique pour plusieurs grandes études, y compris la recherche sur l’immunothérapie du cancer, basée sur l’injection de cellules progénitrices génétiquement modifiées, et pour améliorer la fonction thymique chez les souris immunodéficientes.

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Une méthode de rendement efficace et haute pour l&#39;isolement des souris dendritiques sous-ensembles cellulaires

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Une approche simple et efficace de construire Mutant Vaccinia vecteurs de virus

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Une méthode non-invasive et technique non-intensif pour Induction et phénotypage of Experimental pneumonie bactérienne chez les souris

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Induction de paralysie et de lésion du système visuel chez la souris par le particulier de cellules T pour Neuromyélite optique autoantigènes Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Transfection très efficace des macrophages primaires avec ARNm transcrit in vitro

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...