Name: a minimally invasive, accurate, and efficient technique for intrathymic injection in mice
Uploaded: 2022-08-23T14:00:00
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Wir danken Raymond H. Thornton für seine aufschlussreichen und umfassenden frühen Arbeiten zu dieser Technik. Diese Studie wurde durch Zuschüsse des National Cancer Institute (NCI 1R37CA250661-01A1), der Children's Leukemia Research Association, der Hackensack Meridian School of Medicine und der HUMC Foundation / Tackle Kids Cancer finanziert.

Alle Eingriffe wurden in Übereinstimmung mit den Tierpflegerichtlinien des Center for Discovery and Innovation (IACUC-Protokoll 290) durchgeführt. Für die vorliegende Studie wurden C57BL/6-Mäuse (weiblich, 4-6 Wochen alt), C57BL/6-Mäuse (weiblich, 6 Monate alt), J:NU-Weibchen, NOD scid gamma (NSG) weibliche Mäuse und B6; CAG-luc, -GFP-Mäuse wurden als junges Mausmodell, gealtertes Mausmodell, athymisches Nacktmodell, immundefizientes Modell und Biolumineszenzzellquelle verwendet. Die Mäuse wurden aus einer kommer...

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	<li>Chinn, I. K., Blackburn, C. C., Manley, N. R., Sempowski, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+primary+lymphoid+organs+with+aging.">Changes in primary lymphoid organs with aging.</a> Seminars in Immunology. 24 (5), 309-320 (2012).</li><li>Gruver, A. L., Sempowski, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines,+leptin,+and+stress-induced+thymic+atrophy.">Cytokines, leptin, and stress-induced thymic atrophy.</a> Journal of Leukocyte Biology. 84 (4), 915-923 (2008).</li><li>Masopust, D., Sivula, C. P., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice,+dirty+mice,+and+men:+Using+mice+to+understand+human+immunology.">Of mice, dirty mice, and men: Using mice to understand human immunology.</a> Journal of Immunology. 199 (2), 383-388 (2017).</li><li>Mukherjee, P., Roy, S., Ghosh, D., Nandi, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+animal+models+in+biomedical+research:+a+review.">Role of animal models in biomedical research: a review.</a> Laboratory Animals Research. 38 (1), 18 (2022).</li><li>McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+tolerance:+What+have+we+learned+from+mice.">Central tolerance: What have we learned from mice.</a> Seminars in Immunopathology. 30 (4), 399-409 (2008).</li><li>Zlotoff, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7+and+CCR9+together+recruit+hematopoietic+progenitors+to+the+adult+thymus.">CCR7 and CCR9 together recruit hematopoietic progenitors to the adult thymus.</a> Blood. 115 (10), 1897-1905 (2010).</li><li>Vukmanovic, S., Grandea, A. G., Faas, S. J., Knowles, B. B., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+selection+of+T-lymphocytes+induced+by+intrathymic+injection+of+a+thymic+epithelial+cell+line.">Positive selection of T-lymphocytes induced by intrathymic injection of a thymic epithelial cell line.</a> Nature. 359 (6397), 729-732 (1992).</li><li>Schwarz, B. A., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+hematopoietic+progenitors+with+T+lineage+potential.">Circulating hematopoietic progenitors with T lineage potential.</a> Nature Immunology. 5 (9), 953-960 (2004).</li><li>Marodon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+antigen-specific+tolerance+by+intrathymic+injection+of+lentiviral+vectors.">Induction of antigen-specific tolerance by intrathymic injection of lentiviral vectors.</a> Blood. 108 (9), 2972-2978 (2006).</li><li>Adjali, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+correction+of+ZAP-70+immunodeficiency+by+intrathymic+gene+transfer.">In vivo correction of ZAP-70 immunodeficiency by intrathymic gene transfer.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (8), 2287-2295 (2005).</li><li>Tuckett, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-guided+intrathymic+injection+of+multipotent+stem+cells+supports+life-long+T+cell+immunity+and+facilitates+targeted+immunotherapy.">Image-guided intrathymic injection of multipotent stem cells supports life-long T cell immunity and facilitates targeted immunotherapy.</a> Blood. 123 (18), 2797-2805 (2014).</li><li>Tuckett, A. Z., Thornton, R. H., O'Reilly, R. J., vanden Brink, M. R. M., Zakrzewski, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathymic+injection+of+hematopoietic+progenitor+cells+establishes+functional+T+cell+development+in+a+mouse+model+of+severe+combined+immunodeficiency.">Intrathymic injection of hematopoietic progenitor cells establishes functional T cell development in a mouse model of severe combined immunodeficiency.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 10 (1), 109 (2017).</li><li>Hogan, B. V., Peter, M. B., Shenoy, H. G., Horgan, K., Hughes, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgery+induced+immunosuppression.">Surgery induced immunosuppression.</a> Surgeon. 9 (1), 38-43 (2011).</li><li>Blair-Handon, R., Mueller, K., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+method+for+intrathymic+injections+in+mice.">An alternative method for intrathymic injections in mice.</a> Laboratory Animals. 39 (8), 248-252 (2010).</li><li>Tuckett, A. Z., Zakrzewski, J. L., Li, D., vanden Brink, M. R., Thornton, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-hand+ultrasound+guidance+permits+safe+and+efficient+minimally+invasive+intrathymic+injections+in+both+young+and+aged+mice.">Free-hand ultrasound guidance permits safe and efficient minimally invasive intrathymic injections in both young and aged mice.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (4), 1105-1111 (2015).</li><li>K&#252;ker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+value+of+necropsy+reports+for+animal+health+surveillance.">The value of necropsy reports for animal health surveillance.</a> BMC Veterinary Research. 14 (1), 191 (2018).</li><li>Sinclair, C., Bains, I., Yates, A. J., Seddon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+thymocyte+death+underlies+the+CD4:CD8+T-cell+ratio+in+the+adaptive+immune+system.">Asymmetric thymocyte death underlies the CD4:CD8 T-cell ratio in the adaptive immune system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2905-2914 (2013).</li><li>Manna, S., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathymic+injection.">Intrathymic injection.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).</li><li>de la Cueva, T., Naranjo, A., de la Cueva, E., Rubio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+intrathymic+injection+in+mice.">Refinement of intrathymic injection in mice.</a> Laboratory Animals. 36 (5), 27-32 (2007).</li></ol>

Eine ultraschallgeführte Freihandinjektion ist eine hochgenaue Technik, um Studienmaterialien effizient und aseptisch an den Thymus zu liefern. Nach der ersten Sterilisation der Haut an der Injektionsstelle bleibt die Sterilität während des Verfahrens durch die Verwendung von sterilen Handschuhen, sterilen Ultraschallsondenabdeckungen und sterilem Ultraschallgel erhalten. Im Gegensatz zum blinden perkutanen Ansatz 10,17 oder dem Einsatz chirurgischer Schnitte zur direkten Visualisierung des Thymus18,...

Der Thymus spielt eine wesentliche Rolle bei der Entwicklung und Immunität von T-Zellen. T-Zell-Mangel, der unter anderem durch Thymusinvolution, genetische Störungen, Infektionen und Krebsbehandlungen verursacht werden kann, führt zu hoher Mortalität und Morbidität 1,2. Mausmodelle sind sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der translationalen Immunologieforschung unverzichtbar und werden seit Jahrzehnten zur Untersuchung der Thymusbiologie und T-Zell-Entwicklung sowie zur Entwicklung von Therapien für Menschen mit Thymusdysfunktion und T-Zell-Mangel eingesetzt 3,4,5.
Ein zentraler Bestandteil der Thymusuntersuchungen war die intrathymische Injektion von biologischem Material wie Zellen, Genen oder Proteinen in Mausmodellen 6,7,8,9,10,11,12. Konventionelle intrathymische Injektionsmethoden verwenden Thorakotomie, gefolgt von intrathymischer Injektion unter direkter Visualisierung oder durch "blinde" perkutane Injektion in das Mediastinum. Der chirurgische Ansatz erhöht unter anderem das Pneumothorax-Risiko signifikant. Darüber hinaus führt der erhöhte Stress während dieser Operation zu einer Immunsuppression, wodurch möglicherweise immunologische Daten beeinträchtigtwerden 13. Erfahrene Forscher können nach einiger Übung die Blindinjektionstechnik durchführen, aber dieser Ansatz ist weniger genau und beschränkt daher Versuchspersonen auf junge Mäuse mit einem großen Thymus.
Die Verwendung der Ultraschallführung wurde als präzise und minimalinvasive Alternative zu herkömmlichen intrathymischen Injektionsansätzen eingeführt14. Dieses Verfahren ist jedoch sehr zeitaufwendig, wenn anstelle der Freihandtechnik das integrierte Schienensystem verwendet wird. Die Durchführung von Injektionen mit der Injektionshalterung erfordert eine sorgfältige Optimierung der Bildgebung und Positionierung des Wandlers mit Hilfe der verschiedenen Befestigungen wie dem Wandlerständer und der Halterung, dem X-, Y- und Z-Positioniersystem sowie eine kompetente Bedienung der Mikromanipulationssteuerungen und Schienensystemerweiterungen. Eine einfache alternative Technik, die ultraschallgesteuerte Thymusinjektion, wird hier von einem Radiologen unter Verwendung eines Freihandansatzes15 vorgestellt, der sowohl eine schnelle als auch genaue minimalinvasive Alternative zu den oben beschriebenen Methoden darstellt. Wichtig ist, dass der aktuelle Ansatz mit jedem hochauflösenden Ultraschall-Bildgebungssystem durchgeführt werden kann, ohne dass eine Injektionshalterung und ein integriertes Schienensystem erforderlich sind. Es ist besonders nützlich für Studien, die die Injektion einer großen Anzahl von Mäusenerfordern 11, für Experimente, bei denen beide Thymuslappen injiziert werden, oder für die genaue Injektion kleiner Thymusen in ältere, bestrahlte oder immungeschwächte Mäuse12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aquasonic 100 Ultrasound Gel</td>
			<td>Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA)</td>
			<td>01-01</td>
			<td>Sterile Ultrasound Transmission Gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;CAG-luc, -GFP mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>025854</td>
			<td>Bioluminescence cell source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin Syringes with needle</td>
			<td>Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td>328431</td>
			<td>Ultra-fine needle - 12.7 mm, 30 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mouse - aged</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>000664</td>
			<td>age 6 months old; aged model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mouse - young</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>000664</td>
			<td>age 4-6 weeks; young model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloraprep One-step 0.67 mL</td>
			<td>CareFusion (El Paso, TX, USA)</td>
			<td>260449</td>
			<td>chlorhexidine gluconate applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curity Cotton Tipped Applicator</td>
			<td>Cardinal Health (Dublin, OH, USA)</td>
			<td>A5000-2</td>
			<td>Sterile, 6&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA)</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein (Melville, NY, USA)</td>
			<td>1182097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina X5</td>
			<td>PerkinElmer (Melville, NY, USA)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>In vivo bioluminescence imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J:NU mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>007850</td>
			<td>Athymic nude model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kendall Hypoallergenic Paper Tape</td>
			<td>Cardinal Health (Dublin, OH, USA)</td>
			<td>1914C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Surgical Nitrile Gloves</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA)</td>
			<td>56892</td>
			<td>Sterile Gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair Hair Remover Lotion</td>
			<td>Church and Dwight (Trenton, NJ, USA)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Depilatory agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD scid gamma (NSG) mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>005557</td>
			<td>Immunodeficient model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x</td>
			<td>Corning (Corning, NY, USA)</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>Med Vet International</td>
			<td>PH-PURALUBE-VET</td>
			<td>Eye ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheathes</td>
			<td>Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA)</td>
			<td>10040</td>
			<td>Sterile Ultrasound Probe Covers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sure-Seal Induction Chamber</td>
			<td>Braintree Scientific (Braintree, MA, USA)</td>
			<td>EZ-17 85</td>
			<td>Anesthesia induction chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer MX550D</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue, 0.4% solution in PBS</td>
			<td>MP Biomedicals (Solon, OH, USA)</td>
			<td>91691049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 3100 Imaging System</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Ultrasound imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 3100 Lab Software</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Version 3.2.7 for imaging and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Compact Dual Anesthesia System</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Tabletop isoflurane-based anesthesia unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Imaging Station</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Procedural platform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a minimally invasive, accurate, and efficient technique for intrathymic injection in mice

Die intrathymische Injektion in Mausmodellen ist eine wichtige Technik zur Untersuchung der Thymus- und Immunfunktion, einschließlich genetischer und erworbener T-Zell-Störungen. Dies erfordert Methoden zur direkten Ablagerung von Reagenzien und/oder Zellen in den Thymus lebender Mäuse. Traditionelle Methoden der intrathymischen Injektion umfassen Thoraxchirurgie oder minimalinvasive perkutane Blindinjektionen, die beide erhebliche Einschränkungen aufweisen. Ultrahochfrequenz-Ultraschallbildgebungsgeräte haben bildgeführte perkutane Injektionen bei Mäusen ermöglicht, wodurch die Injektionsgenauigkeit des perkutanen Injektionsansatzes erheblich verbessert und die Injektion kleinerer Ziele ermöglicht wurde. Bildgeführte Injektionen sind jedoch auf die Verwendung eines integrierten Schienensystems angewiesen, was dies zu einem starren und zeitaufwändigen Verfahren macht. Hier wird eine einzigartige, sichere und effiziente Methode für perkutane intrathymische Injektionen bei Mäusen vorgestellt, wodurch die Abhängigkeit vom Schienensystem für Injektionen entfällt. Die Technik beruht auf der Verwendung einer hochauflösenden Mikroultraschalleinheit, um den Mausthymus nichtinvasiv abzubilden. Mittels Freihandtechnik kann ein Radiologe unter sonographischer Anleitung eine Nadelspitze direkt in den Mausthymus einführen. Mäuse werden vor der Bildgebung gereinigt und betäubt. Für einen erfahrenen Radiologen, der sich mit ultraschallgeführten Verfahren auskennt, ist die Lernzeit für die angegebene Technik recht kurz, typischerweise innerhalb einer Sitzung. Die Methode hat eine niedrige Morbiditäts- und Mortalitätsrate für die Mäuse und ist viel schneller als aktuelle mechanisch unterstützte Techniken zur perkutanen Injektion. Es ermöglicht dem Forscher, präzise und zuverlässige perkutane Injektionen von Thymus jeder Größe (einschließlich sehr kleiner Organe wie dem Thymus von gealterten oder immundefizienten Mäusen) mit minimaler Belastung für das Tier effizient durchzuführen. Diese Methode ermöglicht auf Wunsch die Injektion einzelner Lappen und erleichtert aufgrund der Zeitersparnis des Verfahrens groß angelegte Experimente.

Die erfolgreiche Implementierung dieser Technik hängt von einigen wichtigen Schritten ab, die befolgt werden müssen. Zunächst muss eine zuverlässige Identifizierung der Thymusdrüse selbst sichergestellt werden. Bei jungen Mäusen ist dies aufgrund der Größe der Drüse einfach (Abbildung 3A). Bei älteren Mäusen oder immundefizienten Mäusen kann es schwieriger sein; mit modernen Ultraschallgeräten ist es jedoch immer noch sehr gut machbar (Abbildung 3B,C</strong...

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A Minimally Invasive, Accurate, and Efficient Technique for Intrathymic Injection in Mice

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein interventionelles radiologisches Verfahren, das für die intrathymische Injektion bei Mäusen eingerichtet wurde, um das Risiko einer offenen Operation zu vermeiden und die Genauigkeit blinder perkutaner Injektionen zu verbessern.

Eine minimal-invasive, genaue und effiziente Technik zur intrathymischen Injektion bei Mäusen

Intrathymic injection in mouse models is an important technique for studying thymic and immune function, including genetic and acquired T cell disorders. ...

Das Protokoll bietet eine genaue, sichere und effiziente nicht-chirurgische Alternative zu herkömmlichen chirurgischen und blinden Injektionsmethoden. Es ist auch die genaueste Injektionstechnik für Atrophie-Thymusen bei gealterten oder immundefizienten Mäusen. Der entscheidende Vorteil ist ein minimal belastendes Injektionsverfahren, das sehr sicher und präzise, aber auch schnell ist und so groß angelegte Experimente ohne Datenkompromittierung durch chirurgische stressbedingte Immunsuppression ermöglicht.Die Ausrichtung von Nadel und Schallkopf beizubehalten, während sie durch die Brustwand geschoben werden, erfordert etwas Übung. Wir empfehlen daher, mit einem erfahrenen interventionellen Radiologen zusammenzuarbeiten, um Injektionen durchzuführen oder Schulungen durchzuführen. Shaina Anuncio, eine Technikerin aus meinem Labor, hilft bei der Demonstration des Verfahrens.Tragen Sie zunächst eine dünne Schicht Enthaarungscreme für weniger als eine Minute auf den vorderen Brustbereich der Mäuse auf, um das Fell zu entfernen. Verwenden Sie ein nasses Papiertuch, um die Creme und das lose Fell zu entfernen. Bestätigen Sie die entsprechende Anästhesietiefe, indem Sie nicht auf die Hinterpfote reagieren.Tragen Sie Augensalbe auf beide Augen auf, um das Austrocknen der Hornhaut zu verhindern. Platzieren Sie jeweils eine Maus in Rückenlage auf der beheizten Plattform der Ultraschall-Bildgebungsstation für Kleintiere mit dem Nasenkegel. Befestigen Sie die Maus mit medizinischem Klebeband an den Hinter- und Vorderbeinen auf der Bühne.Desinfizieren Sie die fellfreie obere Thoraxhaut mit einem Chlorhexidingluconat-Applikator. Aktivieren Sie die höchste verfügbare Frequenz-Linearsonde. Typischerweise die Sonde mit der höchsten räumlichen Auflösung für die Größe des abgebildeten Tieres.Aktivieren Sie die Sonde, indem Sie nach dem Startbildschirm auf die entsprechende Schaltfläche tippen. Um die Ultraschalleinstellungen für Bildgebung und Injektion zu optimieren, stellen Sie die Tiefe des Sichtfeldes auf eine für das Zieltier geeignete Größe ein, indem Sie die vertikal ausgerichteten Schieberegler auf der rechten Seite des Bildschirms anpassen. Passen Sie die Graustufenverstärkung an, indem Sie die Schaltfläche entlang des horizontalen Balkens am unteren Bildschirmrand schieben.Stellen Sie dann die Fokuszone auf das erwartete Niveau des Thymus ein. Tragen Sie etwa einen Milliliter Ultraschallgel aufrecht auf die Oberfläche des Schallkopfes auf, entweder im Halter des Ultraschallgeräts oder in den Händen eines Assistenten. Um ein kleines steriles Feld neben der beheizten Plattform vorzubereiten, leeren Sie eine sterile Sondenabdeckung, Gummiband, sterile Handschuhe und steriles Ultraschallgel auf das sterile Feld.Dann ziehen Sie die sterilen Handschuhe an. Legen Sie die sterile Sondenabdeckung vorsichtig über den Ultraschallwandler und das Gel. Um die Sterilität zu erhalten, berühren Sie nur die sterile Abdeckung.Schieben Sie das sterile Gummiband über die Sondenabdeckung, um es an Ort und Stelle zu halten. Geben Sie zwei bis drei Milliliter steriles Ultraschallgel auf den Schallkopf. Platzieren Sie die Ultraschall-Gelsonde vertikal auf dem desinfizierten Teil der vorderen Brustwand der Maus für die erste Bildgebung, während die Sterilität erhalten bleibt.Betrachten und optimieren Sie das Ultraschallbild, wie zuvor gezeigt. Um die vordere Brust der Maus in einer Querebene zu scannen, halten Sie den Schallkopf vertikal und bewegen Sie ihn in einer pinselartigen oder schwungvollen Bewegung vom Hals zum Bauch auf und ab. Wenn das Herz im Sichtfeld zentriert ist, streichen Sie den Schallkopf leicht in Richtung Hals.Beachten Sie die beiden runden gepaarten schwarzen Strukturen auf beiden Seiten der oberen Brust. Lokalisieren Sie mit der Ultraschallsonde den breitesten Teil des Thymus, der normalerweise die ideale Zielstelle für die Injektion ist. Erwarten Sie eine horizontale Nadelbahn an der gewählten Stelle und notieren Sie, wo sich die wichtigsten Blutgefäße an dieser Stelle befinden.Diese Gefäße sollten während der Injektion vermieden werden. Die Blutgefäße werden echoarme pulsatile Strukturen sein. Wenn Sie sich nicht sicher sind, aktivieren Sie den Farbdoppler-Modus, indem Sie auf die Farbtaste auf dem Bildschirm tippen, um den Fluss innerhalb der Gefäße zu überprüfen.Halten Sie den Schallkopf in der einen Hand und eine 30-Gauge-Insulinnadel mit 10 Mikrolitern Injektion in der anderen. Um den Injektionsvorgang zu beginnen, bewegen Sie den Schallkopf seitlich, so dass der Thymus im Ultraschallsichtfeld nicht mittig ist. Stellen Sie sicher, dass die andere Seite des Sichtfeldes hauptsächlich aus Ultraschallgel besteht und sonst nichts.Legen Sie die Nadelspitze in das Gel unter dem Schallkopf und bewegen Sie die Nadel langsam, bis sie neben der Hautoberfläche sichtbar ist. Während Sie die Nadel kontinuierlich unter Ultraschall abbilden, führen Sie die Nadel mit einer perkutanen Flugbahn weg von den Blutgefäßen in die Thymusdrüse ein. Verwenden Sie eine horizontale Flugbahn des Kreuzthymus, um die Nadelspitze im Thymuslappen kontralateral zur Eintrittsstelle zu platzieren.Sobald sich die Nadelspitze im gewünschten Teil des Thymus befindet, injizieren Sie schnell den Inhalt aus der 30-Gauge-Spritze, während Sie die sonographische Visualisierung verwenden. Um die Spritze während des Nadeleinführens und der Injektion zu stabilisieren, halten Sie die Spritze zwischen Daumen und dritten Finger und steuern Sie den Spritzenkolben mit dem Zeigefinger. Entfernen Sie die Nadel, nachdem der gesamte Inhalt abgelegt wurde.Bei jungen Mäusen war die Identifizierung der Thymusdrüse aufgrund der Größe der Drüse einfach. Es war schwieriger bei älteren oder immundefizienten Mäusen. Mit modernen Ultraschallgeräten war es jedoch immer noch sehr gut machbar.Eine erfolgreiche Injektion wurde festgestellt, wenn die Nadel kritische Strukturen wie das Herz, die Aorta oder eine der unteren Hohlvene nicht durchquerte. Die Nadelspitze wurde während der Injektion an ihrer Zielstelle sichtbar gemacht und bestätigte die intrathymische Ablagerung. Die intrathymische Lokalisation der Injektion wurde unter Verwendung von Luciferin als Injektion in transgene Luciferase-Mäuse bestätigt.Diese wurden sofort mit Biolumineszenz-Bildgebung ausgewertet, um die korrekte Position der Injektion zu bestätigen, ohne das Tier zu opfern. Alternativ wurde Trypanblau als visueller Marker der Injektionsstelle und der Injektionsgenauigkeit unter Verwendung von ex vivo mit Nekropsie injiziert. Unsere Gruppe hat diese Technik für mehrere große Studien verwendet, einschließlich der Krebsimmuntherapieforschung, basierend auf der Injektion genetisch veränderter Vorläuferzellen, und zur Verbesserung der Thymusfunktion bei immundefizienten Mäusen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Nicht-invasive Bildgebung von Leukozyten Homing und Migration In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

Ein Verfahren zur Markierung Gefäßsystem in embryonalen Mäuse

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

Nicht-invasive optische Abbildung des lymphatischen Gefäßsystem eines Maus

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Imaging von Multimodalität<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infektionen bei Mäusen

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

Die systemische Injektion von Neural Stem / Progenitor-Zellen in Mäusen mit chronischer EAE

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Eine effiziente und High-Yield-Methode zur Isolierung von Maus über dendritische Zellen Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Eine einfache und effiziente Methode zu konstruieren Mutant Vacciniavirusvektoren

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Ein Nicht-invasive und in technischer Hinsicht nicht intensive Verfahren zur Induktion und Phänotypisierung für experimentelle bakterielle Pneumonie bei Mäusen

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Induktion von Lähmung und visuelles System Verletzungen bei Mäusen durch T-Zellen spezifisch für Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Hocheffiziente Transfektion von primärer Makrophagen mit In Vitro transscribed mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...