Name: a minimally invasive, accurate, and efficient technique for intrathymic injection in mice
Uploaded: 2022-08-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Minimally Invasive, Accurate, and Efficient Technique for Intrathymic Injection in Mice at JoVE.com

Vi vil takke Raymond H. Thornton for hans innsiktsfulle og omfattende tidlige arbeid med denne teknikken. Denne studien ble finansiert av tilskuddsstøtte fra National Cancer Institute (NCI 1R37CA250661-01A1), Children's Leukemia Research Association, Hackensack Meridian School of Medicine og HUMC Foundation / Tackle Kids Cancer.

Alle prosedyrer ble utført i samsvar med retningslinjer for dyrepleie ved Center for Discovery and Innovation (IACUC protokoll 290). For denne studien, C57BL / 6 mus (kvinne, 4-6 uker gammel), C57BL / 6 mus (kvinne, 6 måneder gammel), J: NU kvinnelige mus, NOD scid gamma (NSG) kvinnelige mus og B6; CAG-luc, -GFP-mus ble brukt som henholdsvis ung musemodell, alderen musemodell, akymisk nakenmodell, immunsviktmodell og bioluminescenscellekilde. Musene ble hentet fra en kommersiell kilde (se materialtabell</strong...

<ol>
	<li>Chinn, I. K., Blackburn, C. C., Manley, N. R., Sempowski, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+primary+lymphoid+organs+with+aging.">Changes in primary lymphoid organs with aging.</a> Seminars in Immunology. 24 (5), 309-320 (2012).</li><li>Gruver, A. L., Sempowski, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines,+leptin,+and+stress-induced+thymic+atrophy.">Cytokines, leptin, and stress-induced thymic atrophy.</a> Journal of Leukocyte Biology. 84 (4), 915-923 (2008).</li><li>Masopust, D., Sivula, C. P., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice,+dirty+mice,+and+men:+Using+mice+to+understand+human+immunology.">Of mice, dirty mice, and men: Using mice to understand human immunology.</a> Journal of Immunology. 199 (2), 383-388 (2017).</li><li>Mukherjee, P., Roy, S., Ghosh, D., Nandi, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+animal+models+in+biomedical+research:+a+review.">Role of animal models in biomedical research: a review.</a> Laboratory Animals Research. 38 (1), 18 (2022).</li><li>McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+tolerance:+What+have+we+learned+from+mice.">Central tolerance: What have we learned from mice.</a> Seminars in Immunopathology. 30 (4), 399-409 (2008).</li><li>Zlotoff, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7+and+CCR9+together+recruit+hematopoietic+progenitors+to+the+adult+thymus.">CCR7 and CCR9 together recruit hematopoietic progenitors to the adult thymus.</a> Blood. 115 (10), 1897-1905 (2010).</li><li>Vukmanovic, S., Grandea, A. G., Faas, S. J., Knowles, B. B., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+selection+of+T-lymphocytes+induced+by+intrathymic+injection+of+a+thymic+epithelial+cell+line.">Positive selection of T-lymphocytes induced by intrathymic injection of a thymic epithelial cell line.</a> Nature. 359 (6397), 729-732 (1992).</li><li>Schwarz, B. A., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+hematopoietic+progenitors+with+T+lineage+potential.">Circulating hematopoietic progenitors with T lineage potential.</a> Nature Immunology. 5 (9), 953-960 (2004).</li><li>Marodon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+antigen-specific+tolerance+by+intrathymic+injection+of+lentiviral+vectors.">Induction of antigen-specific tolerance by intrathymic injection of lentiviral vectors.</a> Blood. 108 (9), 2972-2978 (2006).</li><li>Adjali, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+correction+of+ZAP-70+immunodeficiency+by+intrathymic+gene+transfer.">In vivo correction of ZAP-70 immunodeficiency by intrathymic gene transfer.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (8), 2287-2295 (2005).</li><li>Tuckett, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-guided+intrathymic+injection+of+multipotent+stem+cells+supports+life-long+T+cell+immunity+and+facilitates+targeted+immunotherapy.">Image-guided intrathymic injection of multipotent stem cells supports life-long T cell immunity and facilitates targeted immunotherapy.</a> Blood. 123 (18), 2797-2805 (2014).</li><li>Tuckett, A. Z., Thornton, R. H., O'Reilly, R. J., vanden Brink, M. R. M., Zakrzewski, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathymic+injection+of+hematopoietic+progenitor+cells+establishes+functional+T+cell+development+in+a+mouse+model+of+severe+combined+immunodeficiency.">Intrathymic injection of hematopoietic progenitor cells establishes functional T cell development in a mouse model of severe combined immunodeficiency.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 10 (1), 109 (2017).</li><li>Hogan, B. V., Peter, M. B., Shenoy, H. G., Horgan, K., Hughes, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgery+induced+immunosuppression.">Surgery induced immunosuppression.</a> Surgeon. 9 (1), 38-43 (2011).</li><li>Blair-Handon, R., Mueller, K., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+method+for+intrathymic+injections+in+mice.">An alternative method for intrathymic injections in mice.</a> Laboratory Animals. 39 (8), 248-252 (2010).</li><li>Tuckett, A. Z., Zakrzewski, J. L., Li, D., vanden Brink, M. R., Thornton, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-hand+ultrasound+guidance+permits+safe+and+efficient+minimally+invasive+intrathymic+injections+in+both+young+and+aged+mice.">Free-hand ultrasound guidance permits safe and efficient minimally invasive intrathymic injections in both young and aged mice.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (4), 1105-1111 (2015).</li><li>K&#252;ker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+value+of+necropsy+reports+for+animal+health+surveillance.">The value of necropsy reports for animal health surveillance.</a> BMC Veterinary Research. 14 (1), 191 (2018).</li><li>Sinclair, C., Bains, I., Yates, A. J., Seddon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+thymocyte+death+underlies+the+CD4:CD8+T-cell+ratio+in+the+adaptive+immune+system.">Asymmetric thymocyte death underlies the CD4:CD8 T-cell ratio in the adaptive immune system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2905-2914 (2013).</li><li>Manna, S., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathymic+injection.">Intrathymic injection.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).</li><li>de la Cueva, T., Naranjo, A., de la Cueva, E., Rubio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+intrathymic+injection+in+mice.">Refinement of intrathymic injection in mice.</a> Laboratory Animals. 36 (5), 27-32 (2007).</li></ol>

En ultralydstyrt frihåndsinjeksjon er en svært nøyaktig teknikk for å levere studiemateriell til thymus på en effektiv og aseptisk måte. Etter den første steriliseringen av huden på injeksjonsstedet, opprettholdes steriliteten under prosedyren på grunn av bruk av sterile hansker, sterile ultralydsondedeksler og steril ultralydgel. I motsetning til den blinde perkutane tilnærmingen 10,17 eller stole på kirurgiske snitt for direkte visualisering av thymus18,19, som er de mest brukte metod...

Thymus har en viktig rolle i T-celleutvikling og immunitet. T-cellemangel, som blant annet kan skyldes tymisk involusjon, genetiske lidelser, infeksjoner og kreftbehandlinger, fører til høy dødelighet og sykelighet 1,2. Musemodeller er uunnværlige i både grunnleggende og translasjonell immunologiforskning og har blitt brukt i flere tiår for å studere tymisk biologi og T-celleutvikling, samt å utvikle behandlinger for de som lider av tymisk dysfunksjon og T-cellemangel 3,4,5.
En sentral del av tymiske undersøkelser har vært intratymisk injeksjon av biologisk materiale som celler, gener eller proteiner i musemodellene 6,7,8,9,10,11,12. Konvensjonelle intratymiske injeksjonsmetoder bruker torakotomi etterfulgt av intratymisk injeksjon under direkte visualisering eller ved "blind" perkutan injeksjon i mediastinum. Den kirurgiske tilnærmingen øker blant annet pneumothorax-risikoen betydelig. Videre resulterer det forhøyede stresset under denne operasjonen i immunsuppresjon, og dermed potensielt kompromitterer immunologiske data13. Erfarne forskere, etter litt praksis, kan utføre blind injeksjonsteknikk, men denne tilnærmingen er mindre nøyaktig og begrenser derfor eksperimentelle til unge mus med stor tymus.
Bruken av ultralydveiledning er introdusert som et presist og minimalt invasivt alternativ til tradisjonelle intratymiske injeksjonsmetoder14. Denne prosedyren er imidlertid svært tidkrevende når du bruker det integrerte skinnesystemet i stedet for frihåndsteknikken. Å utføre injeksjoner med injeksjonsfestet krever nøye bildeoptimalisering og posisjonering av transduseren ved hjelp av de forskjellige vedleggene som transduserstativet og -monteringen, X-, Y- og Z-posisjoneringssystemet, samt dyktig drift av mikromanipuleringskontrollene og skinnesystemutvidelsene. En enkel alternativ teknikk, ultralydstyrt tymisk injeksjon, presenteres her av en radiolog ved hjelp av en frihånds tilnærming15, som både er et raskt og nøyaktig minimalt invasivt alternativ til de ovenfor beskrevne metodene. Det er viktig at den nåværende tilnærmingen kan utføres med et hvilket som helst høyoppløselig ultralydbildesystem uten å trenge et injeksjonsfeste og integrert skinnesystem. Det er spesielt nyttig for studier som krever injeksjon av et stort antall mus11, for eksperimenter som involverer injeksjon av begge tymiske lober, eller for nøyaktig injeksjon av små thymuser i alderen, bestrålt eller immunkompromitterte mus12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aquasonic 100 Ultrasound Gel</td>
			<td>Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA)</td>
			<td>01-01</td>
			<td>Sterile Ultrasound Transmission Gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;CAG-luc, -GFP mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>025854</td>
			<td>Bioluminescence cell source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin Syringes with needle</td>
			<td>Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td>328431</td>
			<td>Ultra-fine needle - 12.7 mm, 30 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mouse - aged</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>000664</td>
			<td>age 6 months old; aged model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mouse - young</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>000664</td>
			<td>age 4-6 weeks; young model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloraprep One-step 0.67 mL</td>
			<td>CareFusion (El Paso, TX, USA)</td>
			<td>260449</td>
			<td>chlorhexidine gluconate applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curity Cotton Tipped Applicator</td>
			<td>Cardinal Health (Dublin, OH, USA)</td>
			<td>A5000-2</td>
			<td>Sterile, 6&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA)</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein (Melville, NY, USA)</td>
			<td>1182097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina X5</td>
			<td>PerkinElmer (Melville, NY, USA)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>In vivo bioluminescence imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J:NU mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>007850</td>
			<td>Athymic nude model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kendall Hypoallergenic Paper Tape</td>
			<td>Cardinal Health (Dublin, OH, USA)</td>
			<td>1914C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Surgical Nitrile Gloves</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA)</td>
			<td>56892</td>
			<td>Sterile Gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair Hair Remover Lotion</td>
			<td>Church and Dwight (Trenton, NJ, USA)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Depilatory agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD scid gamma (NSG) mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>005557</td>
			<td>Immunodeficient model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x</td>
			<td>Corning (Corning, NY, USA)</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>Med Vet International</td>
			<td>PH-PURALUBE-VET</td>
			<td>Eye ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheathes</td>
			<td>Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA)</td>
			<td>10040</td>
			<td>Sterile Ultrasound Probe Covers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sure-Seal Induction Chamber</td>
			<td>Braintree Scientific (Braintree, MA, USA)</td>
			<td>EZ-17 85</td>
			<td>Anesthesia induction chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer MX550D</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue, 0.4% solution in PBS</td>
			<td>MP Biomedicals (Solon, OH, USA)</td>
			<td>91691049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 3100 Imaging System</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Ultrasound imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 3100 Lab Software</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Version 3.2.7 for imaging and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Compact Dual Anesthesia System</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Tabletop isoflurane-based anesthesia unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Imaging Station</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Procedural platform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a minimally invasive, accurate, and efficient technique for intrathymic injection in mice

Intratymisk injeksjon i musemodeller er en viktig teknikk for å studere tymisk og immunfunksjon, inkludert genetiske og ervervede T-celleforstyrrelser. Dette krever metoder for direkte avsetning av reagenser og/eller celler i thymus hos levende mus. Tradisjonelle metoder for intratymisk injeksjon inkluderer thoraxkirurgi eller minimalt invasive perkutane blinde injeksjoner, som begge har betydelige begrensninger. Ultrahøyfrekvente ultralydavbildningsenheter har gjort bildestyrte perkutane injeksjoner mulig hos mus, noe som forbedrer injeksjonsnøyaktigheten til perkutan injeksjonsmetode og muliggjør injeksjon av mindre mål. Bildestyrte injeksjoner er imidlertid avhengige av bruk av et integrert skinnesystem, noe som gjør dette til en stiv og tidkrevende prosedyre. En unik, sikker og effektiv metode for perkutan intratymisk injeksjon hos mus er presentert her, og eliminerer avhengigheten av skinnesystemet for injeksjoner. Teknikken er avhengig av å bruke en høyoppløselig mikro-ultralydsenhet for å avbilde musen thymus ikke-invasivt. Ved hjelp av en frihåndsteknikk kan en radiolog plassere en nålespiss direkte inn i musmusen under sonografisk veiledning. Mus rengjøres og bedøves før avbildning. For en erfaren radiolog som er flink til ultralydveiledede prosedyrer, er læringsperioden for den oppgitte teknikken ganske kort, vanligvis innen en økt. Metoden har lav sykelighet og dødelighet for musene og er mye raskere enn dagens mekanisk assisterte teknikker for perkutan injeksjon. Det gjør det mulig for etterforskeren å effektivt utføre presise og pålitelige perkutane injeksjoner av thymuser av hvilken som helst størrelse (inkludert svært små organer som thymus av eldre eller immundefekte mus) med minimal stress på dyret. Denne metoden muliggjør injeksjon av individuelle lober om ønskelig og letter store eksperimenter på grunn av prosedyrens tidsbesparende natur.

Den vellykkede implementeringen av denne teknikken er avhengig av noen få viktige trinn som skal følges. Først må pålitelig identifikasjon av thymuskjertelen selv sikres. Hos unge mus er dette enkelt på grunn av kjertelens store størrelse (figur 3A). Hos eldre mus eller immunsviktende mus kan det være mer utfordrende; Det er imidlertid fortsatt svært mulig med moderne ultralydutstyr (figur 3B, C). For det andre er det kritisk viktig å ...

Watch this Scientific Journal Video about A Minimally Invasive, Accurate, and Efficient Technique for Intrathymic Injection in Mice at JoVE.com

A Minimally Invasive, Accurate, and Efficient Technique for Intrathymic Injection in Mice

Denne protokollen beskriver en intervensjonsradiologisk prosedyre etablert for intratymisk injeksjon hos mus for å unngå risikoen for åpen kirurgi og forbedre nøyaktigheten av blinde perkutane injeksjoner.

En minimal invasiv, nøyaktig og effektiv teknikk for intratymisk injeksjon hos mus

Intrathymic injection in mouse models is an important technique for studying thymic and immune function, including genetic and acquired T cell disorders. ...

Protokollen gir et nøyaktig, trygt og effektivt ikke-kirurgisk alternativ til tradisjonelle kirurgiske og blinde injeksjonsmetoder. Det er også den mest nøyaktige injeksjonsteknikken for atrofi thymuser hos eldre eller immundefekte mus. Den viktigste fordelen er en minimalt stressende injeksjonsprosedyre som er veldig trygg og presis, men også rask, og dermed muliggjør store eksperimenter uten datakompromiss fra kirurgisk stressrelatert immunsuppresjon.Opprettholde justering av nålen og transduseren mens du beveger den gjennom brystveggen tar litt øvelse. Vi anbefaler derfor å samarbeide med en erfaren intervensjonsradiolog for å utføre injeksjoner eller gi opplæring. Med på å demonstrere prosedyren vil være Shaina Anuncio, en tekniker fra laboratoriet mitt.For å begynne, påfør et tynt lag med hårfjerningskrem på musens fremre brystområde i mindre enn ett minutt for å fjerne pelsen. Bruk et vått papirhåndkle for å fjerne krem og løs pels. Bekreft riktig bedøvelsesdybde ved manglende respons på bakpoteklemmen.Påfør oftalmisk salve på begge øynene for å forhindre tørking av hornhinnen. Plasser en mus om gangen i den bakre posisjonen på den oppvarmede plattformen til ultralydbildestasjonen for små dyr med nesekeglen på plass. Fest musen til scenen med medisinsk tape på bakre og forre lemmer.Desinfiser den pelsfrie øvre thoraxhuden ved hjelp av en klorhexidinglukonatapplikator. Aktiver den høyeste frekvens lineære sonden som er tilgjengelig. Vanligvis sonden med høyest romlig oppløsning for størrelsen på dyret som blir avbildet.Aktiver sonden ved å trykke på den tilsvarende knappen etter oppstartsskjermen. For å optimalisere ultralydinnstillingene for avbildning og injeksjon, juster dybden på synsfeltet til en passende størrelse for måldyret ved å justere de vertikalt orienterte glidebryterne på høyre side av skjermen. Juster gråskalaforsterkningen ved å skyve knappen langs den horisontale linjen nederst på skjermen.Juster deretter fokussonen til det forventede nivået av thymus. Påfør omtrent en milliliter ultralydgel på transduseroverflaten mens den er oppreist, enten hvilende i ultralydmaskinholderen eller i hendene på en assistent. For å forberede et lite sterilt felt ved siden av den oppvarmede plattformen, tøm et sterilt sondedeksel, gummibånd, sterile hansker og steril ultralydgel på det sterile feltet.Ta deretter på deg de sterile hanskene. Plasser forsiktig det sterile sondedekselet over ultralydtransduseren og gelen. For å opprettholde steriliteten, berør bare det sterile dekselet.Skyv det sterile gummibåndet over sondedekselet for å holde det på plass. Plasser to til tre milliliter steril ultralydgel på transduseren. Plasser ultralydgel-toppet sonde vertikalt på den desinfiserte delen av musens fremre brystvegg for første avbildning, samtidig som steriliteten opprettholdes.Se og optimaliser ultralydbildet som vist tidligere. For å skanne musens fremre bryst i et tverrplan, hold transduseren vertikalt og flytt den opp og ned fra nakken til magen i en pensellignende eller feiende bevegelse. Med hjertet sentrert i synsfeltet, fei transduseren litt mot nakken.Legg merke til de to runde parrede svarte strukturene på hver side av øvre bryst. Ved hjelp av ultralydssonden, finn den bredeste delen av thymus, som vanligvis er det ideelle målstedet for injeksjon. Forvent en horisontal nålbane på det valgte stedet, og legg merke til hvor de store blodkarene befinner seg på dette stedet.Disse karene bør unngås under injeksjonen. Blodkarene vil være hypoechoic pulsatile strukturer. Hvis du er usikker, aktiverer du fargedopplermodus ved å trykke på fargeknappen på skjermen for å se etter flyt i karene.Hold transduseren i den ene hånden og en 30-gauge insulinnål med 10 mikroliter injeksjon i den andre. For å starte injeksjonsprosessen, flytt transduseren lateralt slik at thymus er utenfor sentrum i ultralydfeltet. Sørg for at den andre siden av synsfeltet består av for det meste ultralydgel og ingenting annet.Plasser spissen av nålen i gelen under transduseren, og beveg nålen sakte til den visualiseres ved siden av hudoverflaten. Mens kontinuerlig imaging nålen under ultralyd, sett nålen inn i thymuskjertelen med en perkutan bane vekk fra blodårene. Bruk en tverr thymus horisontal bane for å plassere nålespissen i den tymiske loben kontralateralt til inngangsstedet.Når nålespissen er inne i ønsket del av thymus, injiserer du raskt innholdet fra den 30 gauge sprøyten mens du bruker sonografisk visualisering. For å stabilisere sprøyten under nålestikk og injeksjon, hold sprøyten mellom tommelen og tredjefingeren, og kontroller sprøytestemplet med pekefingeren. Fjern kanylen etter at alt innholdet er avsatt.Hos unge mus var det enkelt å identifisere tymuskjertelen på grunn av kjertelens store størrelse. Det var mer utfordrende hos eldre eller immunsviktende mus. Det var imidlertid fortsatt veldig mulig med moderne ultralydutstyr.Vellykket injeksjon ble notert når nålen ikke krysset kritiske strukturer, som hjertet, aorta eller en av de dårligere vena cavae. Nålespissen ble visualisert på målstedet under injeksjonen, noe som bekreftet den intratymiske avsetningen. Den intratymiske plasseringen av injeksjonen ble bekreftet ved bruk av Luciferin som injektat i transgene mus med luciferase.Disse ble evaluert umiddelbart med bioluminescensavbildning, som bekreftet injeksjonens korrekte plassering uten å ofre dyret. Alternativt ble Trypan Blue injisert som en visuell markør for injeksjonsstedet og injeksjonsnøyaktigheten ved bruk av ex vivo med nekropsi. Vår gruppe har brukt denne teknikken i flere store studier, inkludert kreftimmunterapiforskning, basert på injeksjon av genmodifiserte stamceller, og for å forbedre tymisk funksjon hos immunsviktende mus.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

Ikke-invasiv optisk avbildning av Lymfatisk blodkar av en mus

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodalitet Imaging av<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infeksjoner i Mus

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

Systemisk Injeksjon av Neural Stem / stamceller i Mus med kronisk EAE

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

En effektiv og High Yield metode for isolering av mus dendrittiske cellen Delsett

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

En enkel og effektiv tilnærming til Konstruer Mutant vacciniavirus vektorer

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

En ikke-invasiv og Teknisk Non-intensiv metode for induksjon og fenotyping of Experimental bakteriell lungebetennelse hos mus

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Induksjon av lammelse og visuelle systemet skade i mus ved T-celler spesifikke for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Svært effektiv Transfeksjoner av primær makrofager med in vitro skrives mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...