Name: a minimally invasive, accurate, and efficient technique for intrathymic injection in mice
Uploaded: 2022-08-23T14:00:00
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Gostaríamos de agradecer a Raymond H. Thornton por seu trabalho inicial perspicaz e abrangente sobre essa técnica. Este estudo foi financiado pelo apoio financeiro do Instituto Nacional do Câncer (NCI 1R37CA250661-01A1), da Children's Leukemia Research Association, da Hackensack Meridian School of Medicine e da HUMC Foundation / Tackle Kids Cancer.

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes de cuidados com os animais no Center for Discovery and Innovation (protocolo IACUC 290). Para o presente estudo, camundongos C57BL/6 (fêmea, 4-6 semanas de idade), C57BL/6 camundongos (fêmea, 6 meses de idade), camundongos fêmeas J:NU, camundongos fêmeas NOD scid gamma (NSG) e B6; Camundongos CAG-luc, -GFP foram usados como modelo de camundongo jovem, modelo de camundongo envelhecido, modelo de nudez atímica, modelo imunodeficiente e fonte de célul...

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathymic+injection+of+hematopoietic+progenitor+cells+establishes+functional+T+cell+development+in+a+mouse+model+of+severe+combined+immunodeficiency.">Intrathymic injection of hematopoietic progenitor cells establishes functional T cell development in a mouse model of severe combined immunodeficiency.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 10 (1), 109 (2017).</li><li>Hogan, B. V., Peter, M. B., Shenoy, H. G., Horgan, K., Hughes, T. 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J., Seddon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+thymocyte+death+underlies+the+CD4:CD8+T-cell+ratio+in+the+adaptive+immune+system.">Asymmetric thymocyte death underlies the CD4:CD8 T-cell ratio in the adaptive immune system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2905-2914 (2013).</li><li>Manna, S., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathymic+injection.">Intrathymic injection.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).</li><li>de la Cueva, T., Naranjo, A., de la Cueva, E., Rubio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+intrathymic+injection+in+mice.">Refinement of intrathymic injection in mice.</a> Laboratory Animals. 36 (5), 27-32 (2007).</li></ol>

Uma injeção à mão livre guiada por ultrassom é uma técnica altamente precisa para fornecer materiais de estudo ao timo de forma eficiente e asséptica. Após a esterilização inicial da pele no local da injeção, a esterilidade é mantida durante o procedimento devido ao uso de luvas estéreis, tampas estéreis de sonda de ultrassom e gel de ultrassom estéril. Em contraste com a abordagem percutânea cega10,17 ou contando com incisões cirúrgicas para visualização direta do timo<sup cl...

O timo tem um papel essencial no desenvolvimento e imunidade das células T. A deficiência de células T, que pode ser causada por involução tímica, distúrbios genéticos, infecções e tratamentos contra o câncer, entre outros fatores, leva a alta mortalidade e morbidade 1,2. Os modelos de camundongos são indispensáveis tanto na pesquisa em imunologia básica quanto translacional e têm sido utilizados há décadas para estudar a biologia tímica e o desenvolvimento de células T, bem como para desenvolver tratamentos para aqueles que sofrem de disfunção tímica e deficiência de células T 3,4,5.
Uma parte central das investigações tímicas tem sido a injeção intratímica de materiais biológicos, como células, genes ou proteínas, em modelos de camundongos 6,7,8,9,10,11,12. Os métodos convencionais de injeção intratímica usam toracotomia seguida de injeção intratímica sob visualização direta ou por injeção percutânea "cega" no mediastino. A abordagem cirúrgica aumenta significativamente o risco de pneumotórax, entre outros. Além disso, o estresse elevado durante essa cirurgia resulta em imunossupressão, comprometendo potencialmente os dados imunológicos13. Pesquisadores experientes, após alguma prática, podem realizar a técnica de injeção cega, mas essa abordagem é menos precisa e, portanto, limita os sujeitos experimentais a camundongos jovens com um grande timo.
A utilização da orientação ultrassonográfica tem sido introduzida como uma alternativa precisa e minimamente invasiva às abordagens tradicionais de injeção intratímica14. No entanto, este procedimento é muito demorado ao usar o sistema ferroviário integrado em vez da técnica de mão livre. A realização de injeções com o suporte de injeção requer otimização de imagem cuidadosa e posicionamento do transdutor com a ajuda dos vários acessórios, como o suporte e a montagem do transdutor, o sistema de posicionamento X, Y e Z, bem como a operação proficiente dos controles de micromanipulação e extensões do sistema ferroviário. Uma técnica alternativa simples, a injeção tímica guiada por ultrassom, é apresentada aqui por um radiologista usando uma abordagem à mão livre15, que é uma alternativa minimamente invasiva rápida e precisa aos métodos descritos acima. É importante ressaltar que a abordagem atual pode ser realizada com qualquer sistema de imagem de ultrassom de alta resolução sem a necessidade de um suporte de injeção e um sistema de trilho integrado. É especialmente útil para estudos que requerem a injeção de um grande número de camundongos11, para experimentos envolvendo a injeção de ambos os lobos tímicos, ou para a injeção precisa de pequenos timos em camundongos idosos, irradiados ou imunocomprometidos12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aquasonic 100 Ultrasound Gel</td>
			<td>Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA)</td>
			<td>01-01</td>
			<td>Sterile Ultrasound Transmission Gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;CAG-luc, -GFP mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>025854</td>
			<td>Bioluminescence cell source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin Syringes with needle</td>
			<td>Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td>328431</td>
			<td>Ultra-fine needle - 12.7 mm, 30 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mouse - aged</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>000664</td>
			<td>age 6 months old; aged model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mouse - young</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>000664</td>
			<td>age 4-6 weeks; young model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloraprep One-step 0.67 mL</td>
			<td>CareFusion (El Paso, TX, USA)</td>
			<td>260449</td>
			<td>chlorhexidine gluconate applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curity Cotton Tipped Applicator</td>
			<td>Cardinal Health (Dublin, OH, USA)</td>
			<td>A5000-2</td>
			<td>Sterile, 6&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA)</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein (Melville, NY, USA)</td>
			<td>1182097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina X5</td>
			<td>PerkinElmer (Melville, NY, USA)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>In vivo bioluminescence imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J:NU mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>007850</td>
			<td>Athymic nude model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kendall Hypoallergenic Paper Tape</td>
			<td>Cardinal Health (Dublin, OH, USA)</td>
			<td>1914C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Surgical Nitrile Gloves</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA)</td>
			<td>56892</td>
			<td>Sterile Gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair Hair Remover Lotion</td>
			<td>Church and Dwight (Trenton, NJ, USA)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Depilatory agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD scid gamma (NSG) mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>005557</td>
			<td>Immunodeficient model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x</td>
			<td>Corning (Corning, NY, USA)</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>Med Vet International</td>
			<td>PH-PURALUBE-VET</td>
			<td>Eye ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheathes</td>
			<td>Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA)</td>
			<td>10040</td>
			<td>Sterile Ultrasound Probe Covers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sure-Seal Induction Chamber</td>
			<td>Braintree Scientific (Braintree, MA, USA)</td>
			<td>EZ-17 85</td>
			<td>Anesthesia induction chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer MX550D</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue, 0.4% solution in PBS</td>
			<td>MP Biomedicals (Solon, OH, USA)</td>
			<td>91691049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 3100 Imaging System</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Ultrasound imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 3100 Lab Software</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Version 3.2.7 for imaging and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Compact Dual Anesthesia System</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Tabletop isoflurane-based anesthesia unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Imaging Station</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Procedural platform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a minimally invasive, accurate, and efficient technique for intrathymic injection in mice

A injeção intratímica em modelos de camundongos é uma técnica importante para o estudo da função tímica e imunológica, incluindo distúrbios genéticos e de células T adquiridas. Isso requer métodos para a deposição direta de reagentes e/ou células no timo de camundongos vivos. Os métodos tradicionais de injeção intratímica incluem cirurgia torácica ou injeções cegas percutâneas minimamente invasivas, ambas com limitações significativas. Os dispositivos de imagem de ultra-alta frequência tornaram possíveis injeções percutâneas guiadas por imagem em camundongos, melhorando muito a precisão da injeção da abordagem de injeção percutânea e permitindo a injeção de alvos menores. No entanto, as injeções guiadas por imagem dependem da utilização de um sistema ferroviário integrado, tornando este um procedimento rígido e demorado. Um método único, seguro e eficiente para injeções intratímicas percutâneas em camundongos é apresentado aqui, eliminando a dependência do sistema ferroviário para injeções. A técnica baseia-se no uso de uma unidade de micro-ultra-som de alta resolução para visualizar o timo do rato de forma não invasiva. Usando uma técnica de mão livre, um radiologista pode colocar uma ponta de agulha diretamente no timo do rato sob orientação ultrassonográfica. Os ratos são limpos e anestesiados antes da imagem. Para um radiologista experiente adepto de procedimentos guiados por ultrassom, o período de aprendizado para a técnica declarada é bastante curto, normalmente dentro de uma sessão. O método tem uma baixa taxa de morbidade e mortalidade para os camundongos e é muito mais rápido do que as técnicas atuais de injeção percutânea assistida mecanicamente. Ele permite que o investigador realize eficientemente injeções percutâneas precisas e confiáveis de timos de qualquer tamanho (incluindo órgãos muito pequenos, como o timo de camundongos idosos ou imunodeficientes) com o mínimo de estresse sobre o animal. Este método permite a injeção de lobos individuais, se desejado, e facilita experimentos em larga escala devido à natureza de economia de tempo do procedimento.

A implementação bem-sucedida dessa técnica depende de algumas etapas importantes a serem seguidas. Primeiro, a identificação confiável da própria glândula timo deve ser assegurada. Em camundongos jovens, isso é simples devido ao grande tamanho da glândula (Figura 3A). Em ratos mais velhos ou imunodeficientes, pode ser mais desafiador; no entanto, ainda é muito viável com equipamentos de ultrassom modernos (Figura 3B,C). Em segundo lu...

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A Minimally Invasive, Accurate, and Efficient Technique for Intrathymic Injection in Mice

O presente protocolo descreve um procedimento de radiologia intervencionista estabelecido para injeção intratímica em camundongos para evitar o risco de cirurgia aberta e melhorar a precisão das injeções percutâneas cegas.

Uma técnica minimamente invasiva, precisa e eficiente para injeção intratímica em camundongos

Intrathymic injection in mouse models is an important technique for studying thymic and immune function, including genetic and acquired T cell disorders. ...

O protocolo fornece uma alternativa não cirúrgica precisa, segura e eficiente aos métodos tradicionais de injeção cirúrgica e cega. É também a técnica de injeção mais precisa para timos atrofiados em camundongos idosos ou imunodeficientes. A principal vantagem é um procedimento de injeção minimamente estressante que é muito seguro e preciso, mas também rápido, permitindo assim experimentos em larga escala sem comprometimento de dados da imunossupressão relacionada ao estresse cirúrgico.Manter o alinhamento da agulha e do transdutor enquanto avança através da parede torácica requer alguma prática. Portanto, recomendamos colaborar com um radiologista intervencionista experiente para realizar injeções ou fornecer treinamento. Ajudando a demonstrar o procedimento estará Shaina Anuncio, uma técnica do meu laboratório.Para começar, aplique uma fina camada de creme depilatório na área anterior do tórax dos ratos por menos de um minuto para remover a pele. Use uma toalha de papel molhada para remover o creme e a pele solta. Confirme a profundidade anestésica apropriada por falta de resposta à pinça da pata traseira.Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar a secagem da córnea. Coloque um rato de cada vez na posição supina na plataforma aquecida da estação de imagem de ultrassom de pequenos animais com o cone do nariz no lugar. Prenda o rato ao palco com fita adesiva médica nos membros posteriores e dianteiros.Desinfete a pele do tórax superior sem pelos usando um aplicador de gluconato de clorexidina . Ative a sonda linear de frequência mais alta disponível. Normalmente, a sonda com a maior resolução espacial para o tamanho do animal que está sendo fotografado.Ative a sonda tocando no botão correspondente após a tela de inicialização. Para otimizar as configurações de ultrassom para imagem e injeção, ajuste a profundidade do campo de visão para um tamanho apropriado para o animal alvo, ajustando os controles deslizantes orientados verticalmente no lado direito da tela. Ajuste o ganho de escala de cinza deslizando o botão ao longo da barra horizontal na parte inferior da tela.Em seguida, ajuste a zona focal para o nível previsto do timo. Aplique cerca de um mililitro de gel de ultrassom na superfície do transdutor enquanto estiver ereto, descansando no suporte da máquina de ultrassom ou nas mãos de um assistente. Para preparar um pequeno campo estéril ao lado da plataforma aquecida, esvazie uma tampa de sonda estéril, elástico, luvas estéreis e gel de ultrassom estéril no campo estéril.Em seguida, coloque as luvas estéreis. Coloque cuidadosamente a tampa da sonda estéril sobre o transdutor de ultrassom e o gel. Para manter a esterilidade, toque apenas na tampa estéril.Deslize o elástico estéril sobre a tampa da sonda para mantê-lo no lugar. Coloque dois a três mililitros de gel de ultrassom estéril no transdutor. Coloque a sonda com tampo de gel de ultrassom verticalmente na porção desinfetada da parede torácica anterior do camundongo para a imagem inicial, mantendo a esterilidade.Visualize e otimize a imagem de ultrassom como demonstrado anteriormente. Para escanear o tórax anterior do rato em um plano transversal, segure o transdutor verticalmente e mova-o para cima e para baixo do pescoço para o abdômen em um movimento semelhante a um pincel ou varredura. Com o coração centrado no campo de visão, varra o transdutor ligeiramente em direção ao pescoço.Observe as duas estruturas pretas emparelhadas redondas em ambos os lados da parte superior do tórax. Usando a sonda de ultrassom, localize a porção mais larga do timo, que geralmente é o local alvo ideal para a injeção. Antecipe uma trajetória horizontal da agulha no local escolhido e observe onde os principais vasos sanguíneos estão localizados neste local.Estes vasos devem ser evitados durante a injeção. Os vasos sanguíneos serão estruturas pulsáteis hipoecóicas. Se não tiver certeza, ative o modo Doppler colorido tocando no botão de cor na tela para verificar o fluxo dentro dos vasos.Segure o transdutor com uma mão e uma agulha de insulina de calibre 30 com 10 microlitros de injeção na outra. Para iniciar o processo de injeção, mova o transdutor lateralmente para que o timo fique fora do centro no campo de visão do ultrassom. Certifique-se de que o outro lado do campo de visão consiste principalmente em gel de ultrassom e nada mais.Coloque a ponta da agulha no gel sob o transdutor e mova lentamente a agulha até que ela seja visualizada adjacente à superfície da pele. Ao fotografar continuamente a agulha sob ultrassom, insira a agulha na glândula timo com uma trajetória percutânea longe dos vasos sanguíneos. Use uma trajetória horizontal do timo cruzado para colocar a ponta da agulha no lobo tímico contralateral ao local de entrada.Uma vez que a ponta da agulha esteja dentro da porção desejada do timo, injete rapidamente o conteúdo da seringa de calibre 30 enquanto usa a visualização ultrassonográfica. Para estabilizar a seringa durante a inserção e injeção da agulha, segure a seringa entre o polegar e o terceiro dedo e controle o êmbolo da seringa com o dedo indicador. Remova a agulha depois de todo o conteúdo ter sido depositado.Em ratos jovens, a identificação da glândula timo foi simples devido ao grande tamanho da glândula. Foi mais desafiador em camundongos mais velhos ou imunodeficientes. No entanto, ainda era muito viável com modernos equipamentos de ultrassom.A injeção bem-sucedida foi observada quando a agulha não atravessou estruturas críticas, como o coração, a aorta ou uma das veias cavas inferiores. A ponta da agulha foi visualizada em sua localização alvo durante a injeção, confirmando a deposição intratímica. A localização intratímica da injeção foi confirmada usando Luciferin como um injetado em camundongos transgênicos com luciferase.Estes foram avaliados imediatamente com imagens de bioluminescência, confirmando a localização correta da injeção sem sacrificar o animal. Alternativamente, Trypan Blue foi injetado como um marcador visual do local de injeção e precisão da injeção usando ex vivo com necropsia. Nosso grupo tem usado essa técnica para vários grandes estudos, incluindo pesquisas de imunoterapia contra o câncer, com base na injeção de células progenitoras geneticamente modificadas, e para melhorar a função tímica em camundongos imunodeficientes.

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The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Um método não-invasivo e tecnicamente não-intensivo para indução e fenotipagem of Experimental pneumonia bacteriana em ratos

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Indução de paralisia e lesão do sistema Visual em camundongos por específicos de células T para Neuromielite Óptica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Transfecção altamente eficiente de macrófagos primários com mRNA Transcrito in vitro

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...