Name: a minimally invasive, accurate, and efficient technique for intrathymic injection in mice
Uploaded: 2022-08-23T14:00:00
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Nos gustaría agradecer a Raymond H. Thornton por su perspicaz y completo trabajo inicial sobre esta técnica. Este estudio fue financiado por subvenciones del Instituto Nacional del Cáncer (NCI 1R37CA250661-01A1), la Asociación de Investigación de Leucemia Infantil, la Escuela de Medicina Hackensack Meridian y la Fundación HUMC / Tackle Kids Cancer.

Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las pautas de cuidado animal en el Centro para el Descubrimiento y la Innovación (protocolo IACUC 290). Para el presente estudio, ratones C57BL/6 (hembra, 4-6 semanas de edad), ratones C57BL/6 (hembra, 6 meses de edad), ratones hembra J:NU, ratones hembra NOD scid gamma (NSG) y B6; Se utilizaron ratones CAG-luc, -GFP como modelo de ratón joven, modelo de ratón envejecido, modelo de desnudo atímico, modelo inmunodeficiente y fuente de células de bioluminiscencia, ...

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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-hand+ultrasound+guidance+permits+safe+and+efficient+minimally+invasive+intrathymic+injections+in+both+young+and+aged+mice.">Free-hand ultrasound guidance permits safe and efficient minimally invasive intrathymic injections in both young and aged mice.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (4), 1105-1111 (2015).</li><li>K&#252;ker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+value+of+necropsy+reports+for+animal+health+surveillance.">The value of necropsy reports for animal health surveillance.</a> BMC Veterinary Research. 14 (1), 191 (2018).</li><li>Sinclair, C., Bains, I., Yates, A. J., Seddon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+thymocyte+death+underlies+the+CD4:CD8+T-cell+ratio+in+the+adaptive+immune+system.">Asymmetric thymocyte death underlies the CD4:CD8 T-cell ratio in the adaptive immune system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2905-2914 (2013).</li><li>Manna, S., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathymic+injection.">Intrathymic injection.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).</li><li>de la Cueva, T., Naranjo, A., de la Cueva, E., Rubio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+intrathymic+injection+in+mice.">Refinement of intrathymic injection in mice.</a> Laboratory Animals. 36 (5), 27-32 (2007).</li></ol>

Una inyección a mano alzada guiada por ultrasonido es una técnica altamente precisa para administrar materiales de estudio al timo de una manera eficiente y aséptica. Después de la esterilización inicial de la piel en el lugar de la inyección, la esterilidad se mantiene durante el procedimiento debido al uso de guantes estériles, cubiertas de sonda de ultrasonido estériles y gel de ultrasonido estéril. En contraste con el abordaje percutáneo ciego 10,17 o confiando en incisiones quirúrgicas para la visualizaci...

El timo tiene un papel esencial en el desarrollo de las células T y la inmunidad. La deficiencia de células T, que puede ser causada por la involución tímica, trastornos genéticos, infecciones y tratamientos contra el cáncer, entre otros factores, conduce a una alta mortalidad y morbilidad 1,2. Los modelos de ratón son indispensables en la investigación de inmunología básica y traslacional y se han utilizado durante décadas para estudiar la biología tímica y el desarrollo de células T, así como para desarrollar tratamientos para aquellos que sufren de disfunción tímica y deficiencia de células T 3,4,5.
Una parte central de las investigaciones tímicas ha sido la inyección intratímica de materiales biológicos como células, genes o proteínas en modelos de ratón 6,7,8,9,10,11,12. Los métodos convencionales de inyección intratímica utilizan toracotomía seguida de inyección intratímica bajo visualización directa o inyección percutánea "ciega" en el mediastino. El abordaje quirúrgico aumenta significativamente el riesgo de neumotórax, entre otros. Además, el estrés elevado durante esta cirugía resulta en inmunosupresión, comprometiendo potencialmente los datos inmunológicos13. Los investigadores experimentados, después de algo de práctica, pueden realizar la técnica de inyección ciega, pero este enfoque es menos preciso y, por lo tanto, limita a los sujetos experimentales a ratones jóvenes con un timo grande.
La utilización de la guía ecográfica ha sido introducida como una alternativa precisa y mínimamente invasiva a los enfoques tradicionales de inyección intratímica14. Sin embargo, este procedimiento requiere mucho tiempo cuando se utiliza el sistema ferroviario integrado en lugar de la técnica de mano alzada. La realización de inyecciones con el soporte de inyección requiere una cuidadosa optimización de imágenes y posicionamiento del transductor con la ayuda de los diversos accesorios, como el soporte y el soporte del transductor, el sistema de posicionamiento X, Y y Z, así como un funcionamiento competente de los controles de micromanipulación y las extensiones del sistema de rieles. Una técnica alternativa simple, la inyección tímica guiada por ultrasonido, se presenta aquí realizada por un radiólogo utilizando un enfoque a mano alzada15, que es una alternativa mínimamente invasiva rápida y precisa a los métodos descritos anteriormente. Es importante destacar que el enfoque actual se puede realizar con cualquier sistema de imágenes de ultrasonido de alta resolución sin necesidad de un soporte de inyección y un sistema de riel integrado. Es especialmente útil para estudios que requieren la inyección de un gran número de ratones11, para experimentos que involucran la inyección de ambos lóbulos tímicos, o para la inyección precisa de timos pequeños en ratones envejecidos, irradiados o inmunocomprometidos12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aquasonic 100 Ultrasound Gel</td>
			<td>Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA)</td>
			<td>01-01</td>
			<td>Sterile Ultrasound Transmission Gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;CAG-luc, -GFP mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>025854</td>
			<td>Bioluminescence cell source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin Syringes with needle</td>
			<td>Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td>328431</td>
			<td>Ultra-fine needle - 12.7 mm, 30 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mouse - aged</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>000664</td>
			<td>age 6 months old; aged model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mouse - young</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>000664</td>
			<td>age 4-6 weeks; young model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloraprep One-step 0.67 mL</td>
			<td>CareFusion (El Paso, TX, USA)</td>
			<td>260449</td>
			<td>chlorhexidine gluconate applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curity Cotton Tipped Applicator</td>
			<td>Cardinal Health (Dublin, OH, USA)</td>
			<td>A5000-2</td>
			<td>Sterile, 6&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA)</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein (Melville, NY, USA)</td>
			<td>1182097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina X5</td>
			<td>PerkinElmer (Melville, NY, USA)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>In vivo bioluminescence imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J:NU mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>007850</td>
			<td>Athymic nude model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kendall Hypoallergenic Paper Tape</td>
			<td>Cardinal Health (Dublin, OH, USA)</td>
			<td>1914C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Surgical Nitrile Gloves</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA)</td>
			<td>56892</td>
			<td>Sterile Gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair Hair Remover Lotion</td>
			<td>Church and Dwight (Trenton, NJ, USA)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Depilatory agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD scid gamma (NSG) mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>005557</td>
			<td>Immunodeficient model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x</td>
			<td>Corning (Corning, NY, USA)</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>Med Vet International</td>
			<td>PH-PURALUBE-VET</td>
			<td>Eye ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheathes</td>
			<td>Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA)</td>
			<td>10040</td>
			<td>Sterile Ultrasound Probe Covers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sure-Seal Induction Chamber</td>
			<td>Braintree Scientific (Braintree, MA, USA)</td>
			<td>EZ-17 85</td>
			<td>Anesthesia induction chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer MX550D</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue, 0.4% solution in PBS</td>
			<td>MP Biomedicals (Solon, OH, USA)</td>
			<td>91691049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 3100 Imaging System</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Ultrasound imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 3100 Lab Software</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Version 3.2.7 for imaging and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Compact Dual Anesthesia System</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Tabletop isoflurane-based anesthesia unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Imaging Station</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Procedural platform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a minimally invasive, accurate, and efficient technique for intrathymic injection in mice

La inyección intratímica en modelos de ratón es una técnica importante para estudiar la función tímica e inmune, incluidos los trastornos genéticos y adquiridos de células T. Esto requiere métodos para la deposición directa de reactivos y / o células en el timo de ratones vivos. Los métodos tradicionales de inyección intratímica incluyen cirugía torácica o inyecciones percutáneas ciegas mínimamente invasivas, las cuales tienen limitaciones significativas. Los dispositivos de imágenes de ultrasonido de frecuencia ultra alta han hecho posibles las inyecciones percutáneas guiadas por imágenes en ratones, mejorando en gran medida la precisión de la inyección del enfoque de inyección percutánea y permitiendo la inyección de objetivos más pequeños. Sin embargo, las inyecciones guiadas por imágenes dependen de la utilización de un sistema ferroviario integrado, lo que lo convierte en un procedimiento rígido y lento. Aquí se presenta un método único, seguro y eficiente para inyecciones intratímicas percutáneas en ratones, eliminando la dependencia del sistema de rieles para las inyecciones. La técnica se basa en el uso de una unidad de micro-ultrasonido de alta resolución para obtener imágenes del timo del ratón de forma no invasiva. Usando una técnica de mano alzada, un radiólogo puede colocar una punta de aguja directamente en el timo del ratón bajo guía ecográfica. Los ratones se limpian y anestesian antes de la obtención de imágenes. Para un radiólogo experimentado experto en procedimientos guiados por ultrasonido, el período de aprendizaje para la técnica indicada es bastante corto, generalmente dentro de una sesión. El método tiene una baja tasa de morbilidad y mortalidad para los ratones y es mucho más rápido que las técnicas actuales asistidas mecánicamente para la inyección percutánea. Permite al investigador realizar de manera eficiente inyecciones percutáneas precisas y confiables de timos de cualquier tamaño (incluidos órganos muy pequeños como el timo de ratones envejecidos o inmunodeficientes) con un estrés mínimo en el animal. Este método permite la inyección de lóbulos individuales si se desea y facilita experimentos a gran escala debido a la naturaleza de ahorro de tiempo del procedimiento.

La implementación exitosa de esta técnica se basa en algunos pasos clave a seguir. En primer lugar, se debe garantizar una identificación fiable de la propia glándula del timo. En ratones jóvenes, esto es sencillo debido al gran tamaño de la glándula (Figura 3A). En ratones más viejos o ratones inmunodeficientes, puede ser más desafiante; sin embargo, todavía es muy factible con equipos de ultrasonido modernos (Figura 3B, C). En segund...

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A Minimally Invasive, Accurate, and Efficient Technique for Intrathymic Injection in Mice

El presente protocolo describe un procedimiento de radiología intervencionista establecido para la inyección intratímica en ratones para evitar el riesgo de cirugía abierta y mejorar la precisión de las inyecciones percutáneas ciegas.

Una técnica mínimamente invasiva, precisa y eficiente para la inyección intratímica en ratones

Intrathymic injection in mouse models is an important technique for studying thymic and immune function, including genetic and acquired T cell disorders. ...

El protocolo proporciona una alternativa no quirúrgica precisa, segura y eficiente a los métodos tradicionales de inyección quirúrgica y ciega. También es la técnica de inyección más precisa para los timos atrofiados en ratones ancianos o inmunodeficientes. La ventaja clave es un procedimiento de inyección mínimamente estresante que es muy seguro y preciso, pero también rápido, lo que permite experimentos a gran escala sin comprometer los datos de la inmunosupresión relacionada con el estrés quirúrgico.Mantener la alineación de la aguja y el transductor mientras se avanza a través de la pared torácica requiere algo de práctica. Por lo tanto, recomendamos colaborar con un radiólogo intervencionista experimentado para realizar inyecciones o proporcionar capacitación. Ayudando a demostrar el procedimiento estará Shaina Anuncio, una técnica de mi laboratorio.Para comenzar, aplique una capa delgada de crema depilatoria en el área anterior del pecho de los ratones durante menos de un minuto para eliminar el pelaje. Use una toalla de papel húmeda para quitar la crema y el pelaje suelto. Confirme la profundidad anestésica apropiada por falta de respuesta al pellizco de la pata trasera.Aplique ungüento oftálmico en ambos ojos para evitar el secado de la córnea. Coloque un ratón a la vez en posición supina en la plataforma calentada de la estación de imágenes de ultrasonido de animales pequeños con el cono de la nariz en su lugar. Asegure el ratón al escenario con cinta adhesiva médica en las extremidades posteriores y delanteras.Desinfecte la piel de la parte superior del tórax sin pelaje con un aplicador de gluconato de clorhexidina. Active la sonda lineal de frecuencia más alta disponible. Por lo general, la sonda con la resolución espacial más alta para el tamaño del animal que se está fotografiando.Active la sonda tocando el botón correspondiente después de la pantalla de inicio. Para optimizar la configuración de ultrasonido para imágenes e inyección, ajuste la profundidad del campo de visión a un tamaño apropiado para el animal objetivo ajustando los controles deslizantes orientados verticalmente en el lado derecho de la pantalla. Ajuste la ganancia de escala de grises deslizando el botón a lo largo de la barra horizontal en la parte inferior de la pantalla.Luego, ajuste la zona focal al nivel anticipado del timo. Aplique aproximadamente un mililitro de gel de ultrasonido a la superficie del transductor mientras está en posición vertical, ya sea descansando en el soporte de la máquina de ultrasonido o en las manos de un asistente. Para preparar un pequeño campo estéril junto a la plataforma calentada, vacíe una cubierta de sonda estéril, una banda elástica, guantes estériles y gel de ultrasonido estéril en el campo estéril.Luego, póngase los guantes estériles. Coloque con cuidado la cubierta estéril de la sonda sobre el transductor de ultrasonido y el gel. Para mantener la esterilidad, toque solo la cubierta estéril.Deslice la banda elástica estéril sobre la cubierta de la sonda para mantenerla en su lugar. Coloque de dos a tres mililitros de gel de ultrasonido estéril en el transductor. Coloque la sonda de ultrasonido con tapa de gel verticalmente en la parte desinfectada de la pared torácica anterior del ratón para obtener imágenes iniciales, mientras mantiene la esterilidad.Vea y optimice la imagen de ultrasonido como se demostró anteriormente. Para escanear el pecho anterior del ratón en un plano transversal, sostenga el transductor verticalmente y muévalo hacia arriba y hacia abajo desde el cuello hasta el abdomen en un movimiento similar a un pincel o de barrido. Con el corazón centrado en el campo de visión, barre el transductor ligeramente hacia el cuello.Tenga en cuenta las dos estructuras negras emparejadas redondas a cada lado de la parte superior del pecho. Usando la sonda de ultrasonido, localice la porción más ancha del timo, que generalmente es el sitio objetivo ideal para la inyección. Anticipe una trayectoria horizontal de la aguja en la ubicación elegida y observe dónde se encuentran los vasos sanguíneos principales en este sitio.Estos vasos deben evitarse durante la inyección. Los vasos sanguíneos serán estructuras pulsátiles hipoecoicas. Si no está seguro, active el modo Doppler color tocando el botón de color en la pantalla para verificar el flujo dentro de los vasos.Sostenga el transductor en una mano y una aguja de insulina de calibre 30 con 10 microlitros de inyección en la otra. Para comenzar el proceso de inyección, mueva el transductor lateralmente para que el timo esté descentrado en el campo de visión del ultrasonido. Asegúrese de que el otro lado del campo de visión consista principalmente en gel de ultrasonido y nada más.Coloque la punta de la aguja en el gel debajo del transductor y mueva lentamente la aguja hasta que se visualice adyacente a la superficie de la piel. Mientras toma imágenes continuamente de la aguja bajo ultrasonido, inserte la aguja en la glándula del timo con una trayectoria percutánea lejos de los vasos sanguíneos. Utilice una trayectoria horizontal transversal del timo para colocar la punta de la aguja en el lóbulo tímico contralateral al sitio de entrada.Una vez que la punta de la aguja esté dentro de la porción deseada del timo, inyecte rápidamente el contenido de la jeringa de calibre 30 mientras usa la visualización ecográfica. Para estabilizar la jeringa durante la inserción e inyección de la aguja, sostenga la jeringa entre el pulgar y el tercer dedo, y controle el émbolo de la jeringa con el dedo índice. Retire la aguja después de que se haya depositado todo el contenido.En ratones jóvenes, la identificación de la glándula timo fue sencilla debido al gran tamaño de la glándula. Fue más desafiante en ratones más viejos o inmunodeficientes. Sin embargo, todavía era muy factible con equipos de ultrasonido modernos.La inyección exitosa se observó cuando la aguja no atravesó estructuras críticas, como el corazón, la aorta o una de las venas cavas inferiores. La punta de la aguja se visualizó en su ubicación objetivo durante la inyección, confirmando la deposición intratímica. La localización intratímica de la inyección se confirmó utilizando luciferina como inyectado en ratones transgénicos con luciferasa.Estos fueron evaluados inmediatamente con imágenes de bioluminiscencia, confirmando la ubicación correcta de la inyección sin sacrificar al animal. Alternativamente, se inyectó Trypan Blue como marcador visual del sitio de inyección y la precisión de la inyección utilizando ex vivo con necropsia. Nuestro grupo ha estado utilizando esta técnica para varios estudios grandes, incluida la investigación de inmunoterapia contra el cáncer, basada en la inyección de células progenitoras modificadas genéticamente, y para mejorar la función tímica en ratones inmunodeficientes.

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Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Transfección altamente eficiente de macrófagos primarios con ARNm transcrito in Vitro

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...