Name: a minimally invasive, accurate, and efficient technique for intrathymic injection in mice
Uploaded: 2022-08-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Minimally Invasive, Accurate, and Efficient Technique for Intrathymic Injection in Mice at JoVE.com

Vi vill tacka Raymond H. Thornton för hans insiktsfulla och omfattande tidiga arbete med denna teknik. Denna studie finansierades av bidragsstöd från National Cancer Institute (NCI 1R37CA250661-01A1), Children's Leukemia Research Association, Hackensack Meridian School of Medicine och HUMC Foundation/Tackle Kids Cancer.

Alla procedurer utfördes i enlighet med djurvårdsriktlinjer vid Center for Discovery and Innovation (IACUC protokoll 290). För den aktuella studien, C57BL/6 möss (hona, 4-6 veckor gamla), C57BL/6 möss (hona, 6 månader gamla), J:NU honmöss, NOD scid gamma (NSG) honmöss och B6; CAG-luc, -GFP-möss användes som ung musmodell, åldrad musmodell, athymisk nakenmodell, immunbristmodell respektive bioluminescenscellkälla. Mössen erhölls från en kommersiell källa (se Materialförteckning). Denna pr...

<ol>
	<li>Chinn, I. K., Blackburn, C. C., Manley, N. R., Sempowski, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+primary+lymphoid+organs+with+aging.">Changes in primary lymphoid organs with aging.</a> Seminars in Immunology. 24 (5), 309-320 (2012).</li><li>Gruver, A. L., Sempowski, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines,+leptin,+and+stress-induced+thymic+atrophy.">Cytokines, leptin, and stress-induced thymic atrophy.</a> Journal of Leukocyte Biology. 84 (4), 915-923 (2008).</li><li>Masopust, D., Sivula, C. P., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice,+dirty+mice,+and+men:+Using+mice+to+understand+human+immunology.">Of mice, dirty mice, and men: Using mice to understand human immunology.</a> Journal of Immunology. 199 (2), 383-388 (2017).</li><li>Mukherjee, P., Roy, S., Ghosh, D., Nandi, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+animal+models+in+biomedical+research:+a+review.">Role of animal models in biomedical research: a review.</a> Laboratory Animals Research. 38 (1), 18 (2022).</li><li>McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+tolerance:+What+have+we+learned+from+mice.">Central tolerance: What have we learned from mice.</a> Seminars in Immunopathology. 30 (4), 399-409 (2008).</li><li>Zlotoff, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7+and+CCR9+together+recruit+hematopoietic+progenitors+to+the+adult+thymus.">CCR7 and CCR9 together recruit hematopoietic progenitors to the adult thymus.</a> Blood. 115 (10), 1897-1905 (2010).</li><li>Vukmanovic, S., Grandea, A. G., Faas, S. J., Knowles, B. B., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+selection+of+T-lymphocytes+induced+by+intrathymic+injection+of+a+thymic+epithelial+cell+line.">Positive selection of T-lymphocytes induced by intrathymic injection of a thymic epithelial cell line.</a> Nature. 359 (6397), 729-732 (1992).</li><li>Schwarz, B. A., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+hematopoietic+progenitors+with+T+lineage+potential.">Circulating hematopoietic progenitors with T lineage potential.</a> Nature Immunology. 5 (9), 953-960 (2004).</li><li>Marodon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+antigen-specific+tolerance+by+intrathymic+injection+of+lentiviral+vectors.">Induction of antigen-specific tolerance by intrathymic injection of lentiviral vectors.</a> Blood. 108 (9), 2972-2978 (2006).</li><li>Adjali, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+correction+of+ZAP-70+immunodeficiency+by+intrathymic+gene+transfer.">In vivo correction of ZAP-70 immunodeficiency by intrathymic gene transfer.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (8), 2287-2295 (2005).</li><li>Tuckett, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-guided+intrathymic+injection+of+multipotent+stem+cells+supports+life-long+T+cell+immunity+and+facilitates+targeted+immunotherapy.">Image-guided intrathymic injection of multipotent stem cells supports life-long T cell immunity and facilitates targeted immunotherapy.</a> Blood. 123 (18), 2797-2805 (2014).</li><li>Tuckett, A. Z., Thornton, R. H., O'Reilly, R. J., vanden Brink, M. R. M., Zakrzewski, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathymic+injection+of+hematopoietic+progenitor+cells+establishes+functional+T+cell+development+in+a+mouse+model+of+severe+combined+immunodeficiency.">Intrathymic injection of hematopoietic progenitor cells establishes functional T cell development in a mouse model of severe combined immunodeficiency.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 10 (1), 109 (2017).</li><li>Hogan, B. V., Peter, M. B., Shenoy, H. G., Horgan, K., Hughes, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgery+induced+immunosuppression.">Surgery induced immunosuppression.</a> Surgeon. 9 (1), 38-43 (2011).</li><li>Blair-Handon, R., Mueller, K., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+method+for+intrathymic+injections+in+mice.">An alternative method for intrathymic injections in mice.</a> Laboratory Animals. 39 (8), 248-252 (2010).</li><li>Tuckett, A. Z., Zakrzewski, J. L., Li, D., vanden Brink, M. R., Thornton, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-hand+ultrasound+guidance+permits+safe+and+efficient+minimally+invasive+intrathymic+injections+in+both+young+and+aged+mice.">Free-hand ultrasound guidance permits safe and efficient minimally invasive intrathymic injections in both young and aged mice.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (4), 1105-1111 (2015).</li><li>K&#252;ker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+value+of+necropsy+reports+for+animal+health+surveillance.">The value of necropsy reports for animal health surveillance.</a> BMC Veterinary Research. 14 (1), 191 (2018).</li><li>Sinclair, C., Bains, I., Yates, A. J., Seddon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+thymocyte+death+underlies+the+CD4:CD8+T-cell+ratio+in+the+adaptive+immune+system.">Asymmetric thymocyte death underlies the CD4:CD8 T-cell ratio in the adaptive immune system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2905-2914 (2013).</li><li>Manna, S., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathymic+injection.">Intrathymic injection.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).</li><li>de la Cueva, T., Naranjo, A., de la Cueva, E., Rubio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+intrathymic+injection+in+mice.">Refinement of intrathymic injection in mice.</a> Laboratory Animals. 36 (5), 27-32 (2007).</li></ol>

En ultraljudsstyrd frihandsinjektion är en mycket exakt teknik för att leverera studiematerial till tymus på ett effektivt och aseptiskt sätt. Efter den första steriliseringen av huden på injektionsstället upprätthålls steriliteten under proceduren på grund av användning av sterila handskar, sterila ultraljudssondskydd och steril ultraljudsgel. I motsats till det blinda perkutana tillvägagångssättet 10,17 eller förlita sig på kirurgiska snitt för direkt visualisering av tymus18,19...

Tymus har en viktig roll i T-cellutveckling och immunitet. T-cellsbrist, som bland annat kan orsakas av tymisk involution, genetiska störningar, infektioner och cancerbehandlingar, leder till hög dödlighet och sjuklighet 1,2. Musmodeller är oumbärliga i både grundläggande och translationell immunologiforskning och har använts i årtionden för att studera tymisk biologi och T-cellutveckling, samt för att utveckla behandlingar för dem som lider av tymisk dysfunktion och T-cellbrist 3,4,5.
En central del av tymiska undersökningar har varit intratymisk injektion av biologiska material som celler, gener eller proteiner i musmodeller 6,7,8,9,10,11,12. Konventionella intratymiska injektionsmetoder använder torakotomi följt av intratymisk injektion under direkt visualisering eller genom "blind" perkutan injektion i mediastinum. Det kirurgiska tillvägagångssättet ökar bland annat risken för pneumotorax avsevärt. Dessutom resulterar den förhöjda stressen under denna operation i immunsuppression, vilket potentiellt äventyrar immunologiska data13. Erfaren forskare, efter viss övning, kan utföra blindinjektionstekniken, men detta tillvägagångssätt är mindre exakt och begränsar därför experimentella ämnen till unga möss med en stor tymus.
Användningen av ultraljudsvägledning har introducerats som ett exakt och minimalt invasivt alternativ till traditionella intratymiska injektionsmetoder14. Denna procedur är dock mycket tidskrävande när du använder det integrerade järnvägssystemet istället för frihandstekniken. Att utföra injektioner med injektionsfästet kräver noggrann bildoptimering och positionering av givaren med hjälp av de olika tillbehören som givarstativet och fästet, X-, Y- och Z-positioneringssystemet, samt skicklig drift av mikromanipuleringskontrollerna och rälssystemets förlängningar. En enkel alternativ teknik, ultraljudsstyrd tymisk injektion, presenteras här utförd av en radiolog med hjälp av en frihandsmetod15, vilket är både ett snabbt och exakt minimalt invasivt alternativ till de ovan beskrivna metoderna. Det är viktigt att det nuvarande tillvägagångssättet kan utföras med alla högupplösta ultraljudsavbildningssystem utan att behöva ett injektionsfäste och integrerat skensystem. Det är särskilt användbart för studier som kräver injektion av ett stort antal möss11, för experiment som involverar injektion av båda tymiska loberna eller för korrekt injektion av små tymuser hos åldrade, bestrålade eller immunkomprometterade möss12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aquasonic 100 Ultrasound Gel</td>
			<td>Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA)</td>
			<td>01-01</td>
			<td>Sterile Ultrasound Transmission Gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;CAG-luc, -GFP mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>025854</td>
			<td>Bioluminescence cell source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin Syringes with needle</td>
			<td>Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td>328431</td>
			<td>Ultra-fine needle - 12.7 mm, 30 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mouse - aged</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>000664</td>
			<td>age 6 months old; aged model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mouse - young</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>000664</td>
			<td>age 4-6 weeks; young model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloraprep One-step 0.67 mL</td>
			<td>CareFusion (El Paso, TX, USA)</td>
			<td>260449</td>
			<td>chlorhexidine gluconate applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curity Cotton Tipped Applicator</td>
			<td>Cardinal Health (Dublin, OH, USA)</td>
			<td>A5000-2</td>
			<td>Sterile, 6&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA)</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein (Melville, NY, USA)</td>
			<td>1182097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina X5</td>
			<td>PerkinElmer (Melville, NY, USA)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>In vivo bioluminescence imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J:NU mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>007850</td>
			<td>Athymic nude model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kendall Hypoallergenic Paper Tape</td>
			<td>Cardinal Health (Dublin, OH, USA)</td>
			<td>1914C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Surgical Nitrile Gloves</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA)</td>
			<td>56892</td>
			<td>Sterile Gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair Hair Remover Lotion</td>
			<td>Church and Dwight (Trenton, NJ, USA)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Depilatory agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD scid gamma (NSG) mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>005557</td>
			<td>Immunodeficient model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x</td>
			<td>Corning (Corning, NY, USA)</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>Med Vet International</td>
			<td>PH-PURALUBE-VET</td>
			<td>Eye ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheathes</td>
			<td>Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA)</td>
			<td>10040</td>
			<td>Sterile Ultrasound Probe Covers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sure-Seal Induction Chamber</td>
			<td>Braintree Scientific (Braintree, MA, USA)</td>
			<td>EZ-17 85</td>
			<td>Anesthesia induction chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer MX550D</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue, 0.4% solution in PBS</td>
			<td>MP Biomedicals (Solon, OH, USA)</td>
			<td>91691049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 3100 Imaging System</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Ultrasound imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 3100 Lab Software</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Version 3.2.7 for imaging and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Compact Dual Anesthesia System</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Tabletop isoflurane-based anesthesia unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Imaging Station</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Procedural platform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a minimally invasive, accurate, and efficient technique for intrathymic injection in mice

Intratymisk injektion i musmodeller är en viktig teknik för att studera tymisk och immunfunktion, inklusive genetiska och förvärvade T-cellstörningar. Detta kräver metoder för direkt avsättning av reagenser och/eller celler i tymus hos levande möss. Traditionella metoder för intratymisk injektion inkluderar thoraxkirurgi eller minimalt invasiva perkutana blinda injektioner, som båda har betydande begränsningar. Ultrahögfrekventa ultraljudsavbildningsenheter har möjliggjort bildstyrda perkutana injektioner hos möss, vilket avsevärt förbättrar injektionsnoggrannheten för den perkutana injektionsmetoden och möjliggör injektion av mindre mål. Bildstyrda injektioner är dock beroende av användningen av ett integrerat järnvägssystem, vilket gör detta till en styv och tidskrävande procedur. En unik, säker och effektiv metod för perkutana intratymiska injektioner hos möss presenteras här, vilket eliminerar beroendet av skensystemet för injektioner. Tekniken bygger på att använda en högupplöst mikro-ultraljudsenhet för att avbilda mustymus noninvasivt. Med hjälp av en frihandsteknik kan en radiolog placera en nålspets direkt i mustymusen under sonografisk vägledning. Möss rengörs och bedövas före avbildning. För en erfaren radiolog som är skicklig på ultraljudsstyrda procedurer är inlärningsperioden för den angivna tekniken ganska kort, vanligtvis inom en session. Metoden har låg sjuklighet och dödlighet för mössen och är mycket snabbare än nuvarande mekaniskt assisterade tekniker för perkutan injektion. Det gör det möjligt för utredaren att effektivt utföra exakta och tillförlitliga perkutana injektioner av tymuser av alla storlekar (inklusive mycket små organ som tymus hos åldrade eller immunbristmöss) med minimal stress på djuret. Denna metod möjliggör injektion av enskilda lober om så önskas och underlättar storskaliga experiment på grund av procedurens tidsbesparande natur.

Den framgångsrika implementeringen av denna teknik bygger på några viktiga steg som ska följas. För det första måste tillförlitlig identifiering av själva tymuskörteln säkerställas. Hos unga möss är detta enkelt på grund av körtelns stora storlek (figur 3A). Hos äldre möss eller immunbristmöss kan det vara mer utmanande; Det är dock fortfarande mycket genomförbart med modern ultraljudsutrustning (figur 3B, C). För det andra...

Watch this Scientific Journal Video about A Minimally Invasive, Accurate, and Efficient Technique for Intrathymic Injection in Mice at JoVE.com

A Minimally Invasive, Accurate, and Efficient Technique for Intrathymic Injection in Mice

Detta protokoll beskriver ett interventionellt radiologiförfarande som fastställts för intratymisk injektion hos möss för att undvika risken för öppen kirurgi och förbättra noggrannheten hos blinda perkutana injektioner.

En minimalt invasiv, exakt och effektiv teknik för intratymisk injektion hos möss

Intrathymic injection in mouse models is an important technique for studying thymic and immune function, including genetic and acquired T cell disorders. ...

Protokollet ger ett exakt, säkert och effektivt icke-kirurgiskt alternativ till traditionella kirurgiska och blinda injektionsmetoder. Det är också den mest exakta injektionstekniken för atrofi tymuser hos åldrade eller immunbristmöss. Den viktigaste fördelen är ett minimalt stressande injektionsförfarande som är mycket säkert och exakt, men också snabbt, vilket möjliggör storskaliga experiment utan datakompromettering från kirurgisk stressrelaterad immunsuppression.Att upprätthålla inriktningen av nålen och givaren medan du avancerar den genom bröstväggen kräver lite övning. Vi rekommenderar därför att du samarbetar med en erfaren interventionell radiolog för att utföra injektioner eller ge utbildning. Att hjälpa till att demonstrera proceduren kommer att vara Shaina Anuncio, en tekniker från mitt laboratorium.För att börja, applicera ett tunt lager hårborttagningskräm på mössens främre bröstområde i mindre än en minut för att ta bort pälsen. Använd en våt pappershandduk för att ta bort grädden och lös päls. Bekräfta lämpligt anestesidjup genom att inte svara på baktassklämmen.Applicera oftalmisk salva på båda ögonen för att förhindra torkning av hornhinnan. Placera en mus i taget i ryggläge på den uppvärmda plattformen på ultraljudsavbildningsstationen för små djur med näskonen på plats. Fäst musen på scenen med medicinsk tejp vid bak- och frambenen.Desinficera den pälsfria övre bröstkorgshuden med en klorhexidinglukonatapplikator. Aktivera den högsta frekvenslinjära sonden som finns tillgänglig. Vanligtvis sonden med den högsta rumsliga upplösningen för storleken på djuret som avbildas.Aktivera sonden genom att trycka på motsvarande knapp efter startskärmen. För att optimera ultraljudsinställningarna för avbildning och injektion, justera djupet på synfältet till en lämplig storlek för måldjuret genom att justera de vertikalt orienterade reglagen på höger sida av skärmen. Justera gråskaleförstärkningen genom att skjuta knappen längs det horisontella fältet längst ned på skärmen.Justera sedan fokuszonen till den förväntade nivån på tymusen. Applicera cirka en milliliter ultraljudsgel på givarytan medan den är upprätt, antingen vilar i ultraljudsmaskinhållaren eller i händerna på en assistent. För att förbereda ett litet sterilt fält bredvid den uppvärmda plattformen, töm ett sterilt sondskydd, gummiband, sterila handskar och steril ultraljudsgel på det sterila fältet.Ta sedan på dig de sterila handskarna. Placera försiktigt det sterila sondskyddet över ultraljudsgivaren och gelén. För att upprätthålla sterilitet, rör endast det sterila locket.Skjut det sterila gummibandet över sondskyddet för att hålla det på plats. Placera två till tre milliliter steril ultraljudsgel på givaren. Placera den ultraljudsgeltoppade sonden vertikalt på den desinficerade delen av musens främre bröstvägg för initial avbildning, samtidigt som steriliteten bibehålls.Visa och optimera ultraljudsbilden som visats tidigare. För att skanna musens främre bröstkorg i ett tvärgående plan, håll givaren vertikalt och flytta den upp och ner från nacken till buken i en penselliknande eller svepande rörelse. Med hjärtat centrerat i synfältet, svep givaren något mot nacken.Observera de två runda parade svarta strukturerna på vardera sidan av övre bröstet. Använd ultraljudssonden och lokalisera den bredaste delen av tymus, som vanligtvis är den perfekta målplatsen för injektion. Förutse en horisontell nålbana på den valda platsen och notera var de viktigaste blodkärlen finns på denna plats.Dessa kärl bör undvikas under injektionen. Blodkärlen kommer att vara hypoekoiska pulserande strukturer. Om du är osäker, aktivera färgdopplerläget genom att trycka på färgknappen på skärmen för att kontrollera flödet i kärlen.Håll givaren i ena handen och en 30-gauge insulinnål med 10 mikroliter injektat i den andra. För att påbörja injektionsprocessen, flytta givaren i sidled så att tymus är utanför centrum i ultraljudsfältet. Se till att den andra sidan av synfältet består av mestadels ultraljudsgel och inget annat.Placera nålspetsen i gelén under givaren och flytta nålen långsamt tills den visualiseras intill hudytan. Medan du kontinuerligt avbildar nålen under ultraljud, sätt in nålen i tymuskörteln med en perkutan bana bort från blodkärlen. Använd en tvärgående tymus horisontell bana för att placera nålspetsen i tymloben kontralateralt till ingångsplatsen.När nålspetsen är inne i önskad del av tymusen, injicera snabbt innehållet från 30-gaugesprutan medan du använder sonografisk visualisering. För att stabilisera sprutan under nålinsättning och injektion, håll sprutan mellan tummen och det tredje fingret och kontrollera sprutkolven med pekfingret. Ta bort nålen efter att allt innehåll har deponerats.Hos unga möss var det enkelt att identifiera tymuskörteln på grund av körtelns stora storlek. Det var mer utmanande hos äldre eller immunbristmöss. Det var dock fortfarande mycket genomförbart med modern ultraljudsutrustning.Framgångsrik injektion noterades när nålen inte passerade kritiska strukturer, såsom hjärta, aorta eller en av de underlägsna vena cavae. Nålspetsen visualiserades på sin målplats under injektionen, vilket bekräftade den intratymiska avsättningen. Den intratymiska placeringen av injektionen bekräftades med Luciferin som ett injektat i luciferastransgena möss.Dessa utvärderades omedelbart med bioluminescensavbildning, vilket bekräftade injektionens korrekta plats utan att offra djuret. Alternativt injicerades Trypan Blue som en visuell markör för injektionsstället och injektionsnoggrannheten med ex vivo med obduktion. Vår grupp har använt denna teknik för flera stora studier, inklusive cancerimmunterapiforskning, baserad på injektion av genetiskt modifierade stamceller, och för att förbättra tymisk funktion hos immunbristmöss.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Icke-invasiv avbildning av Leukocyt Homing och migration In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

En metod för märkning vaskulatur i embryonala möss

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

Icke-invasiv optisk avbildning av det lymfatiska vaskulaturen hos en mus

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodalitet Imaging av<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infektioner hos möss

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

Systemisk Injektion av neurala stamceller / stamceller hos möss med kronisk EAE

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

En effektiv och High Yield Metod för isolering av mus dendritiska cellundergrupper

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

En enkel och effektiv strategi för att konstruera Mutant vacciniavirus vektorer

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

En icke-invasiv och tekniskt icke intensiva metod för induktion och fenotypning av experimentell bakteriell lunginflammation hos möss

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Induktion av förlamning och visuella systemet skada hos möss av T celler specifika för Neuromyelitis Optica Autoantigen akvaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Högeffektiv transfektion av primära makrofager med in vitro-transkriberad mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...