Name: a minimally invasive, accurate, and efficient technique for intrathymic injection in mice
Uploaded: 2022-08-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Minimally Invasive, Accurate, and Efficient Technique for Intrathymic Injection in Mice at JoVE.com

Raymond H. Thornton'a bu teknik üzerindeki anlayışlı ve kapsamlı erken çalışmaları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI 1R37CA250661-01A1), Çocuk Lösemi Araştırma Derneği, Hackensack Meridyen Tıp Fakültesi ve HUMC Vakfı / Çocuk Kanseriyle Mücadele hibe desteği ile finanse edilmiştir.

Tüm prosedürler, Keşif ve İnovasyon Merkezi'ndeki (IACUC protokolü 290) hayvan bakımı kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, C57BL/6 fareler (dişi, 4-6 haftalık), C57BL/6 fareler (dişi, 6 aylık), J:NU dişi fareler, NOD scid gama (NSG) dişi fareler ve B6; CAG-luc, -GFP fareler sırasıyla genç fare modeli, yaşlı fare modeli, atimik çıplak model, immün yetmezlik modeli ve biyolüminesans hücre kaynağı olarak kullanılmıştır. Fareler ticari bir kaynaktan elde edilmiş...

<ol>
	<li>Chinn, I. K., Blackburn, C. C., Manley, N. R., Sempowski, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+primary+lymphoid+organs+with+aging.">Changes in primary lymphoid organs with aging.</a> Seminars in Immunology. 24 (5), 309-320 (2012).</li><li>Gruver, A. L., Sempowski, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines,+leptin,+and+stress-induced+thymic+atrophy.">Cytokines, leptin, and stress-induced thymic atrophy.</a> Journal of Leukocyte Biology. 84 (4), 915-923 (2008).</li><li>Masopust, D., Sivula, C. P., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice,+dirty+mice,+and+men:+Using+mice+to+understand+human+immunology.">Of mice, dirty mice, and men: Using mice to understand human immunology.</a> Journal of Immunology. 199 (2), 383-388 (2017).</li><li>Mukherjee, P., Roy, S., Ghosh, D., Nandi, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+animal+models+in+biomedical+research:+a+review.">Role of animal models in biomedical research: a review.</a> Laboratory Animals Research. 38 (1), 18 (2022).</li><li>McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+tolerance:+What+have+we+learned+from+mice.">Central tolerance: What have we learned from mice.</a> Seminars in Immunopathology. 30 (4), 399-409 (2008).</li><li>Zlotoff, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7+and+CCR9+together+recruit+hematopoietic+progenitors+to+the+adult+thymus.">CCR7 and CCR9 together recruit hematopoietic progenitors to the adult thymus.</a> Blood. 115 (10), 1897-1905 (2010).</li><li>Vukmanovic, S., Grandea, A. G., Faas, S. J., Knowles, B. B., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+selection+of+T-lymphocytes+induced+by+intrathymic+injection+of+a+thymic+epithelial+cell+line.">Positive selection of T-lymphocytes induced by intrathymic injection of a thymic epithelial cell line.</a> Nature. 359 (6397), 729-732 (1992).</li><li>Schwarz, B. A., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+hematopoietic+progenitors+with+T+lineage+potential.">Circulating hematopoietic progenitors with T lineage potential.</a> Nature Immunology. 5 (9), 953-960 (2004).</li><li>Marodon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+antigen-specific+tolerance+by+intrathymic+injection+of+lentiviral+vectors.">Induction of antigen-specific tolerance by intrathymic injection of lentiviral vectors.</a> Blood. 108 (9), 2972-2978 (2006).</li><li>Adjali, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+correction+of+ZAP-70+immunodeficiency+by+intrathymic+gene+transfer.">In vivo correction of ZAP-70 immunodeficiency by intrathymic gene transfer.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (8), 2287-2295 (2005).</li><li>Tuckett, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-guided+intrathymic+injection+of+multipotent+stem+cells+supports+life-long+T+cell+immunity+and+facilitates+targeted+immunotherapy.">Image-guided intrathymic injection of multipotent stem cells supports life-long T cell immunity and facilitates targeted immunotherapy.</a> Blood. 123 (18), 2797-2805 (2014).</li><li>Tuckett, A. Z., Thornton, R. H., O'Reilly, R. J., vanden Brink, M. R. M., Zakrzewski, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathymic+injection+of+hematopoietic+progenitor+cells+establishes+functional+T+cell+development+in+a+mouse+model+of+severe+combined+immunodeficiency.">Intrathymic injection of hematopoietic progenitor cells establishes functional T cell development in a mouse model of severe combined immunodeficiency.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 10 (1), 109 (2017).</li><li>Hogan, B. V., Peter, M. B., Shenoy, H. G., Horgan, K., Hughes, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgery+induced+immunosuppression.">Surgery induced immunosuppression.</a> Surgeon. 9 (1), 38-43 (2011).</li><li>Blair-Handon, R., Mueller, K., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+method+for+intrathymic+injections+in+mice.">An alternative method for intrathymic injections in mice.</a> Laboratory Animals. 39 (8), 248-252 (2010).</li><li>Tuckett, A. Z., Zakrzewski, J. L., Li, D., vanden Brink, M. R., Thornton, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-hand+ultrasound+guidance+permits+safe+and+efficient+minimally+invasive+intrathymic+injections+in+both+young+and+aged+mice.">Free-hand ultrasound guidance permits safe and efficient minimally invasive intrathymic injections in both young and aged mice.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (4), 1105-1111 (2015).</li><li>K&#252;ker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+value+of+necropsy+reports+for+animal+health+surveillance.">The value of necropsy reports for animal health surveillance.</a> BMC Veterinary Research. 14 (1), 191 (2018).</li><li>Sinclair, C., Bains, I., Yates, A. J., Seddon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+thymocyte+death+underlies+the+CD4:CD8+T-cell+ratio+in+the+adaptive+immune+system.">Asymmetric thymocyte death underlies the CD4:CD8 T-cell ratio in the adaptive immune system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2905-2914 (2013).</li><li>Manna, S., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathymic+injection.">Intrathymic injection.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).</li><li>de la Cueva, T., Naranjo, A., de la Cueva, E., Rubio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+intrathymic+injection+in+mice.">Refinement of intrathymic injection in mice.</a> Laboratory Animals. 36 (5), 27-32 (2007).</li></ol>

Ultrason rehberliğinde serbest el enjeksiyonu, çalışma materyallerini timusa verimli ve aseptik bir şekilde iletmek için oldukça doğru bir tekniktir. Enjeksiyon bölgesinde cildin ilk sterilizasyonunu takiben, steril eldivenler, steril ultrason prob kapakları ve steril ultrason jeli kullanımı nedeniyle prosedür sırasında sterilite korunur. Kör perkütan yaklaşım 10,17'nin aksine veya farelerde intratimik enjeksiyonlar için yaygın olarak kullanılan yöntemler olan timus </...

Timus, T hücresi gelişimi ve bağışıklığında önemli bir role sahiptir. Timik evrim, genetik bozukluklar, enfeksiyonlar ve kanser tedavilerinin neden olabileceği T hücre eksikliği, diğer faktörlerin yanı sıra, yüksek mortalite ve morbiditeye yol açmaktadır 1,2. Fare modelleri hem temel hem de translasyonel immünoloji araştırmalarında vazgeçilmezdir ve timik biyoloji ve T hücresi gelişimini incelemek ve ayrıca timik disfonksiyon ve T hücre eksikliğinden muzdarip olanlar için tedaviler geliştirmek için onlarca yıldır kullanılmaktadır 3,4,5.
Timik araştırmaların merkezi bir kısmı, fare modellerinde hücreler, genler veya proteinler gibi biyolojik materyallerin intratimik enjeksiyonu olmuştur 6,7,8,9,10,11,12. Konvansiyonel intratimik enjeksiyon yöntemleri, torakotomi ve ardından doğrudan görselleştirme altında intratimik enjeksiyon veya mediastenin içine "kör" perkütan enjeksiyon kullanır. Cerrahi yaklaşım, diğerlerinin yanı sıra pnömotoraks riskini önemli ölçüde artırır. Dahası, bu ameliyat sırasında artan stres immünsüpresyona neden olur, böylece potansiyel olarak immünolojik verilerden ödün verir13. Deneyimli araştırmacılar, bazı uygulamalardan sonra, kör enjeksiyon tekniğini uygulayabilirler, ancak bu yaklaşım daha az doğrudur ve bu nedenle deneysel konuları büyük bir timuslu genç farelerle sınırlar.
Ultrason rehberliğinin kullanımı, geleneksel intratimik enjeksiyon yaklaşımlarına kesin ve minimal invaziv bir alternatif olarak tanıtılmıştır14. Bununla birlikte, serbest el tekniği yerine entegre raylı sistem kullanıldığında bu prosedür çok zaman alıcıdır. Enjeksiyon montajı ile enjeksiyonların gerçekleştirilmesi, dikkatli görüntüleme optimizasyonu ve dönüştürücü standı ve montajı, X, Y ve Z konumlandırma sistemi gibi çeşitli ataşmanların yardımıyla dönüştürücünün konumlandırılmasını ve ayrıca mikro manipülasyon kontrollerinin ve ray sistemi uzantılarının yetkin bir şekilde çalışmasını gerektirir. Basit bir alternatif teknik olan ultrason rehberliğinde timik enjeksiyon, burada bir radyolog tarafından yukarıda açıklanan yöntemlere hem hızlı hem de doğru minimal invaziv bir alternatif olan serbest el yaklaşımı15 kullanılarak gerçekleştirilmektedir. Daha da önemlisi, mevcut yaklaşım, enjeksiyon montajına ve entegre raylı sisteme ihtiyaç duymadan herhangi bir yüksek çözünürlüklü ultrason görüntüleme sistemi ile gerçekleştirilebilir. Özellikle çok sayıda farenin enjekte edilmesini gerektiren çalışmalar içinyararlıdır 11, her iki timik lobun enjeksiyonunu içeren deneyler için veya yaşlı, ışınlanmış veya bağışıklık sistemi baskılanmış farelerde küçük timüslerin doğru enjeksiyonuiçin 12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aquasonic 100 Ultrasound Gel</td>
			<td>Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA)</td>
			<td>01-01</td>
			<td>Sterile Ultrasound Transmission Gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;CAG-luc, -GFP mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>025854</td>
			<td>Bioluminescence cell source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin Syringes with needle</td>
			<td>Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA)</td>
			<td>328431</td>
			<td>Ultra-fine needle - 12.7 mm, 30 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mouse - aged</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>000664</td>
			<td>age 6 months old; aged model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mouse - young</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>000664</td>
			<td>age 4-6 weeks; young model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloraprep One-step 0.67 mL</td>
			<td>CareFusion (El Paso, TX, USA)</td>
			<td>260449</td>
			<td>chlorhexidine gluconate applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curity Cotton Tipped Applicator</td>
			<td>Cardinal Health (Dublin, OH, USA)</td>
			<td>A5000-2</td>
			<td>Sterile, 6&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA)</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein (Melville, NY, USA)</td>
			<td>1182097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina X5</td>
			<td>PerkinElmer (Melville, NY, USA)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>In vivo bioluminescence imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J:NU mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>007850</td>
			<td>Athymic nude model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kendall Hypoallergenic Paper Tape</td>
			<td>Cardinal Health (Dublin, OH, USA)</td>
			<td>1914C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Surgical Nitrile Gloves</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA)</td>
			<td>56892</td>
			<td>Sterile Gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair Hair Remover Lotion</td>
			<td>Church and Dwight (Trenton, NJ, USA)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Depilatory agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD scid gamma (NSG) mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)</td>
			<td>005557</td>
			<td>Immunodeficient model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x</td>
			<td>Corning (Corning, NY, USA)</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>Med Vet International</td>
			<td>PH-PURALUBE-VET</td>
			<td>Eye ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheathes</td>
			<td>Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA)</td>
			<td>10040</td>
			<td>Sterile Ultrasound Probe Covers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sure-Seal Induction Chamber</td>
			<td>Braintree Scientific (Braintree, MA, USA)</td>
			<td>EZ-17 85</td>
			<td>Anesthesia induction chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer MX550D</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue, 0.4% solution in PBS</td>
			<td>MP Biomedicals (Solon, OH, USA)</td>
			<td>91691049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 3100 Imaging System</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Ultrasound imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 3100 Lab Software</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Version 3.2.7 for imaging and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Compact Dual Anesthesia System</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Tabletop isoflurane-based anesthesia unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Imaging Station</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Procedural platform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a minimally invasive, accurate, and efficient technique for intrathymic injection in mice

Fare modellerinde intratimik enjeksiyon, genetik ve edinilmiş T hücre bozuklukları da dahil olmak üzere timik ve bağışıklık fonksiyonlarını incelemek için önemli bir tekniktir. Bu, reaktiflerin ve / veya hücrelerin canlı farelerin timusuna doğrudan birikmesi için yöntemler gerektirir. Geleneksel intratimik enjeksiyon yöntemleri, her ikisi de önemli sınırlamalara sahip olan göğüs cerrahisi veya minimal invaziv perkütan kör enjeksiyonları içerir. Ultra yüksek frekanslı ultrason görüntüleme cihazları, farelerde görüntü rehberliğinde perkütan enjeksiyonları mümkün kılarak perkütan enjeksiyon yaklaşımının enjeksiyon doğruluğunu büyük ölçüde artırmış ve daha küçük hedeflerin enjeksiyonunu sağlamıştır. Bununla birlikte, görüntü kılavuzlu enjeksiyonlar, entegre bir raylı sistemin kullanımına dayanır ve bu da bunu katı ve zaman alıcı bir prosedür haline getirir. Farelerde perkütan intratimik enjeksiyonlar için benzersiz, güvenli ve etkili bir yöntem burada sunulmakta ve enjeksiyonlar için raylı sisteme olan bağımlılığı ortadan kaldırmaktadır. Teknik, fare timusunu invaziv olmayan bir şekilde görüntülemek için yüksek çözünürlüklü bir mikro-ultrason ünitesi kullanmaya dayanır. Serbest el tekniği kullanarak, bir radyolog sonografik rehberlik altında doğrudan fare timusuna bir iğne ucu yerleştirebilir. Fareler görüntülemeden önce temizlenir ve anestezi altına alınır. Ultrason rehberliğindeki prosedürlerde usta deneyimli bir radyolog için, belirtilen tekniğin öğrenme süresi, tipik olarak bir seansta oldukça kısadır. Yöntem, fareler için düşük morbidite ve mortalite oranına sahiptir ve perkütan enjeksiyon için mevcut mekanik destekli tekniklerden çok daha hızlıdır. Araştırmacının, hayvan üzerinde minimum stresle her büyüklükteki (yaşlı veya immün yetmezlikli farelerin timusları gibi çok küçük organlar dahil) timüzlerin hassas ve güvenilir perkütan enjeksiyonlarını verimli bir şekilde gerçekleştirmesini sağlar. Bu yöntem, istenirse bireysel lobların enjeksiyonunu sağlar ve prosedürün zaman kazandıran doğası nedeniyle büyük ölçekli deneyleri kolaylaştırır.

Bu tekniğin başarılı bir şekilde uygulanması, izlenecek birkaç önemli adıma dayanmaktadır. İlk olarak, timus bezinin kendisinin güvenilir bir şekilde tanımlanması sağlanmalıdır. Genç farelerde, bezin büyüklüğü nedeniyle bu basittir (Şekil 3A). Yaşlı farelerde veya immün yetmezlikli farelerde, daha zor olabilir; Bununla birlikte, modern ultrason ekipmanı ile hala çok uygundur (Şekil 3B, C). İkincisi, iğne yörüng...

Watch this Scientific Journal Video about A Minimally Invasive, Accurate, and Efficient Technique for Intrathymic Injection in Mice at JoVE.com

A Minimally Invasive, Accurate, and Efficient Technique for Intrathymic Injection in Mice

Bu protokol, açık cerrahi riskini önlemek ve kör perkütan enjeksiyonların doğruluğunu artırmak için farelerde intratimik enjeksiyon için oluşturulan girişimsel bir radyoloji prosedürünü tanımlamaktadır.

Farelerde İntratimik Enjeksiyon için Minimal İnvaziv, Doğru ve Etkili Bir Teknik

Intrathymic injection in mouse models is an important technique for studying thymic and immune function, including genetic and acquired T cell disorders. ...

Protokol, geleneksel cerrahi ve kör enjeksiyon yöntemlerine doğru, güvenli ve etkili bir cerrahi olmayan alternatif sunar. Aynı zamanda yaşlı veya immün yetmezlikli farelerde atrofi timusları için en doğru enjeksiyon tekniğidir. En önemli avantajı, çok güvenli ve hassas, aynı zamanda hızlı olan minimal stresli bir enjeksiyon prosedürüdür, böylece cerrahi strese bağlı immünsüpresyondan veri ödün vermeden büyük ölçekli deneylere olanak tanır.İğnenin ve dönüştürücünün hizalanmasını sağlarken göğüs duvarından ilerletmek biraz pratik gerektirir. Bu nedenle, enjeksiyon yapmak veya eğitim vermek için deneyimli bir girişimsel radyolog ile işbirliği yapmanızı öneririz. Prosedürün gösterilmesine yardımcı olacak kişi, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Shaina Anuncio olacak.Başlamak için, kürkü çıkarmak için farelerin ön göğüs bölgesine bir dakikadan az bir süre boyunca ince bir tüy dökücü krem tabakası uygulayın. Kremayı ve gevşek kürkü çıkarmak için ıslak bir kağıt havlu kullanın. Arka pençe sıkışmasına yanıt vermeyerek uygun anestezik derinliği onaylayın.Kornea kurumasını önlemek için her iki göze de oftalmik merhem uygulayın. Burun konisi yerinde olacak şekilde küçük hayvan ultrason görüntüleme istasyonunun ısıtılmış platformunda sırtüstü pozisyonda her seferinde bir fare yerleştirin. Fareyi arka ve ön bacaklarda tıbbi yapışkan bantla sahneye sabitleyin.Kürksüz üst toraks derisini bir klorheksidin glukonat aplikatörü kullanarak dezenfekte edin. Mevcut en yüksek frekanslı lineer probu etkinleştirin. Tipik olarak, görüntülenen hayvanın büyüklüğü için en yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip prob.Başlatma ekranından sonra ilgili düğmeye dokunarak probu etkinleştirin. Görüntüleme ve enjeksiyon için ultrason ayarlarını optimize etmek amacıyla, ekranın sağ tarafındaki dikey yönelimli kaydırıcıları ayarlayarak görüş alanının derinliğini hedef hayvan için uygun bir boyuta ayarlayın. Düğmeyi ekranın altındaki yatay çubuk boyunca kaydırarak gri tonlama kazancını ayarlayın.Ardından, odak bölgesini timusun beklenen seviyesine ayarlayın. Dönüştürücü yüzeyine, ultrason makinesi tutucusunda veya bir asistanın elinde dururken, dik durumdayken yaklaşık bir mililitre ultrason jeli uygulayın. Isıtılmış platformun yanında küçük bir steril alan hazırlamak için, steril bir prob kapağını, lastik bandı, steril eldivenleri ve steril ultrason jelini steril alana boşaltın.Ardından, steril eldivenleri giyin. Steril prob kapağını ultrason dönüştürücü ve jel üzerine dikkatlice yerleştirin. Steriliteyi korumak için sadece steril kapağa dokunun.Steril lastik bandı yerinde tutmak için prob kapağının üzerine kaydırın. Transdüserin üzerine iki ila üç mililitre steril ultrason jeli yerleştirin. Ultrason jel kaplı probu, steriliteyi korurken, ilk görüntüleme için farenin ön göğüs duvarının dezenfekte edilmiş kısmına dikey olarak yerleştirin.Ultrason görüntüsünü daha önce gösterildiği gibi görüntüleyin ve optimize edin. Farenin ön göğsünü enine bir düzlemde taramak için, dönüştürücüyü dikey olarak tutun ve boya fırçası benzeri veya süpürme hareketiyle boyundan karnına yukarı ve aşağı hareket ettirin. Kalp görüş alanında ortalanmışken, dönüştürücüyü hafifçe boyuna doğru süpürün.Üst göğsün her iki tarafındaki iki yuvarlak eşleştirilmiş siyah yapıya dikkat edin. Ultrason probunu kullanarak, genellikle enjeksiyon için ideal hedef bölge olan timusun en geniş kısmını bulun. Seçilen yerde yatay bir iğne yörüngesi öngörün ve ana kan damarlarının bu bölgede nerede bulunduğunu not edin.Enjeksiyon sırasında bu damarlardan kaçınılmalıdır. Kan damarları hipoekoik pulsatil yapılar olacaktır. Emin değilseniz, damarlardaki akışı kontrol etmek için ekrandaki renk düğmesine dokunarak renkli Doppler modunu etkinleştirin.Transdüseri bir elinizde tutun ve diğer elinizde 10 mikrolitre enjekte edilen 30 gauge insülin iğnesini tutun. Enjeksiyon işlemine başlamak için, transdüseri yanal olarak hareket ettirin, böylece timus ultrason görüş alanında merkezden uzakta olur. Görüş alanının diğer tarafının çoğunlukla ultrason jelinden ve başka hiçbir şeyden oluşmadığından emin olun.İğnenin ucunu dönüştürücünün altındaki jele yerleştirin ve iğneyi cilt yüzeyine bitişik olarak görselleştirilene kadar yavaşça hareket ettirin. İğneyi ultrason altında sürekli görüntülerken, iğneyi kan damarlarından uzakta perkütan bir yörünge ile timus bezine yerleştirin. İğne ucunu giriş bölgesine aykırı timik loba yerleştirmek için çapraz timus yatay yörüngesi kullanın.İğne ucu timusun istenen kısmının içine girdikten sonra, sonografik görselleştirme kullanırken içeriği 30 gauge şırıngadan hızlı bir şekilde enjekte edin. İğne yerleştirme ve enjeksiyon sırasında şırıngayı stabilize etmek için, şırıngayı baş parmak ile üçüncü parmak arasında tutun ve şırınga pistonunu işaret parmağıyla kontrol edin. Tüm içerikler yatırıldıktan sonra iğneyi çıkarın.Genç farelerde, timus bezinin tanımlanması, bezin büyüklüğü nedeniyle basitti. Yaşlı veya immün yetmezlikli farelerde daha zordu. Bununla birlikte, modern ultrason ekipmanı ile hala çok mümkündü.İğne, kalp, aort veya inferior vena kavalardan biri gibi kritik yapıları geçmediğinde başarılı enjeksiyon kaydedildi. İğne ucu, enjeksiyon sırasında hedef konumunda görselleştirildi ve intratimik birikimi doğruladı. Enjeksiyonun intratimik yeri, Luciferin'i lusiferaz transgenik farelere enjekte olarak kullanarak doğrulandı.Bunlar hemen biyolüminesans görüntüleme ile değerlendirildi ve hayvanı feda etmeden enjeksiyonun doğru yerini doğruladı. Alternatif olarak, Trypan Blue, enjeksiyon bölgesinin görsel bir belirteci olarak enjekte edildi ve nekropsi ile ex vivo kullanılarak enjeksiyon doğruluğu enjekte edildi. Grubumuz bu tekniği, genetiği değiştirilmiş progenitör hücrelerin enjeksiyonuna dayanan kanser immünoterapi araştırmaları da dahil olmak üzere birçok büyük çalışma için ve immün yetmezlikli farelerde timik fonksiyonu iyileştirmek için kullanmaktadır.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Lökosit Homing Göç ve non-invaziv Görüntüleme In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

Embriyonik Farelerde damarları Etiketleme Bir Yöntem

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

Bir Mouse Lenfatik damarları Non-invaziv Optik Görüntüleme

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D modelli Görüntüleme<em&gt; Citrobacter rodentium</emFarelerde&gt; Enfeksiyonlar

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

Kronik EAE ile Fare nöral kök / progenitör hücrelerinin sistemik enjeksiyonundan

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Fare Dendritik Hücre Alt Grupları İzolasyonunda bir Verimli ve Yüksek Verim Yöntem

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Basit ve Etkin Yaklaşım Mutant Vaccinia Virüs Vektörler Construct

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Farelerde Deneysel Bakteriyel Pnömoni İndüksiyonunun ve fenotipleme bir Non-invaziv ve Teknik Olmayan yoğun Yöntem

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Felç ve görsel sistem yaralanma tarafından Nöromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4 T hücreleri belirli farelerde indüksiyon

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

In Vitro Transcribed mRNA ile Primer Makrofajların Yüksek Verimli Transföytüsü

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...