Name: fluorescence lifetime macro imager for biomedical applications
Uploaded: 2023-04-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications at JoVE.com

Økonomisk støtte til dette arbejde fra Science Foundation Ireland, tilskud SFI/12/RC/2276_P2, SFI/17/RC-PhD/3484 og 18/SP/3522 og Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland) anerkendes med taknemmelighed.

Alle forsøg med dyr blev udført i henhold til tilladelser udstedt af Health Products Regulatory Authority (HPRA, Irland) i overensstemmelse med Det Europæiske Fællesskabs rådsdirektiv (2010/63/EU) og blev godkendt af Animal Experimentation Ethics Committee ved University College Cork.
1. Forberedelse af prøver
<ol><li>Farvning med sonde af levende vævsprøver ex vivo<ol><li>Til ex vivo-applikationer skal du bruge frisk isolerede vævsprøver fra 4 ug...

<ol>
	<li>Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+oxygen+and+hypoxia+in+cell+and+tissue+samples.">Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).</li><li>Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+is+the+partial+oxygen+pressure+of+human+tissues+a+crucial+parameter?+Small+molecules+and+hypoxia.">Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 15 (6), 1239-1253 (2011).</li><li>Yoshihara, T., Hirakawa, Y., Hosaka, M., Nangaku, M., Tobita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+imaging+of+living+cells+and+tissues+using+luminescent+molecular+probes.">Oxygen imaging of living cells and tissues using luminescent molecular probes.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews. 30, 71-95 (2017).</li><li>Papkovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescence+based+oxygen+sensors+essential+tools+for+cell+biology+and+life+science+research.">Phosphorescence based oxygen sensors essential tools for cell biology and life science research.</a> 17th International Meeting on Chemical Sensors - IMCS. , 71-72 (2018).</li><li>Tsytsarev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+brain+metabolism+activity+using+a+phosphorescent+oxygen-sensitive+probe.">In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe.</a> Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).</li><li>O'Donovan, C., Hynes, J., Yashunski, D., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescent+oxygen-sensitive+materials+for+biological+applications.">Phosphorescent oxygen-sensitive materials for biological applications.</a> Journal of Materials Chemistry. 15, 2946-2951 (2005).</li><li>Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+probes+and+techniques+for+O+2+measurement+in+live+cells+and+tissue.">Optical probes and techniques for O 2 measurement in live cells and tissue.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (12), 2025-2039 (2012).</li><li>Papkovsky, D. B., Zhdanov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescence+based+oxygen+sensors+and+probes+for+biomedical+research.">Phosphorescence based oxygen sensors and probes for biomedical research.</a> Advanced Environmental, Chemical, and Biological Sensing Technologies XIV. 10215, 102150 (2017).</li><li>Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+phosphorescence:+A+novel+method+for+measuring+oxygen+distribution+in+perfused+tissue.">Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue.</a> Science. 241 (4873), 1649-1651 (1988).</li><li>Hogan, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescence+quenching+method+for+measurement+of+intracellular+PO+2+in+isolated+skeletal+muscle+fibers.">Phosphorescence quenching method for measurement of intracellular PO 2 in isolated skeletal muscle fibers.</a> Journal of Applied Physiology. 86 (2), 720-724 (1999).</li><li>Apreleva, S. V., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomographic+imaging+of+oxygen+by+phosphorescence+lifetime.">Tomographic imaging of oxygen by phosphorescence lifetime.</a> Applied Optics. 45 (33), 8547-8559 (2006).</li><li>Becker, W., Shcheslavskiy, V., R&#252;ck, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+phosphorescence+and+fluorescence+lifetime+imaging+by+multi-dimensional+TCSPC+and+multi-pulse+excitation.">Simultaneous phosphorescence and fluorescence lifetime imaging by multi-dimensional TCSPC and multi-pulse excitation.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 19-30 (2017).</li><li>Wolfbeis, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescent+sensing+and+imaging+of+oxygen:+Fierce+competition+to+the+Clark+electrode.">Luminescent sensing and imaging of oxygen: Fierce competition to the Clark electrode.</a> BioEssays. 37 (8), 921-928 (2015).</li><li>Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+neurosphere+oxygenation+with+phosphorescent+probes.">Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes.</a> Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).</li><li>Shcheslavskiy, V. I., Neubauer, A., Bukowiecki, R., Dinter, F., Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+fluorescence+and+phosphorescence+lifetime+imaging.">Combined fluorescence and phosphorescence lifetime imaging.</a> Applied Physics Letters. 108, 091111 (2016).</li><li>Babilas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+phosphorescence+imaging+of+pO2+using+planar+oxygen+sensors.">In vivo phosphorescence imaging of pO2 using planar oxygen sensors.</a> Microcirculation. 12 (6), 477-487 (2005).</li><li>Babilas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+pO2+imaging+during+tourniquet-induced+forearm+ischemia+using+planar+optical+oxygen+sensors.">Transcutaneous pO2 imaging during tourniquet-induced forearm ischemia using planar optical oxygen sensors.</a> Skin Research and Technology. 14 (3), 304-311 (2008).</li><li>Golub, A. S., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PO2+measurements+in+the+microcirculation+using+phosphorescence+quenching+microscopy+at+high+magnification.">PO2 measurements in the microcirculation using phosphorescence quenching microscopy at high magnification.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2905-2916 (2008).</li><li>Zhdanov, A. V., Golubeva, A. V., Okkelman, I. A., Cryan, J. F., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+oxygen+gradients+in+giant+umbrella+cells:+An+ex+vivo+PLIM+study.">Imaging of oxygen gradients in giant umbrella cells: An ex vivo PLIM study.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 309 (7), 501-509 (2015).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+-+Techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging - Techniques and applications.</a> Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).</li><li>Jenkins, J., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B., Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cell+and+tissue+O+2+by+TCSPC-PLIM.">Imaging cell and tissue O 2 by TCSPC-PLIM.</a> Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Applications. , 225-247 (2015).</li><li>Becker, W., K&#246;nig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+TCSPC-FLIM+techniques.">Advanced TCSPC-FLIM techniques.</a> Multiphoton Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging: Applications in Biology and Medicine. , 23-52 (2018).</li><li>Wei, L., Yan, W., Ho, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+fluorescence+lifetime+analytical+microsystems:+Contact+optics+and+CMOS+time-resolved+electronics.">Recent advances in fluorescence lifetime analytical microsystems: Contact optics and CMOS time-resolved electronics.</a> Sensors. 17 (12), 2800 (2017).</li><li>Hirvonen, L. M., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wide-field+TCSPC:+Methods+and+applications.">Wide-field TCSPC: Methods and applications.</a> Measurement Science and Technology. 28, 012003 (2017).</li><li>Hirvonen, L. M., Festy, F., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wide-field+time-correlated+single-photon+counting+(TCSPC)+lifetime+microscopy+with+microsecond+time+resolution.">Wide-field time-correlated single-photon counting (TCSPC) lifetime microscopy with microsecond time resolution.</a> Optics Letters. 39 (19), 5602 (2014).</li><li>Sparks, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+new+gated+optical+image+intensifiers+for+fluorescence+lifetime+imaging.">Characterisation of new gated optical image intensifiers for fluorescence lifetime imaging.</a> Review of Scientific Instruments. 88 (1), 013707 (2017).</li><li>Chelushkin, P. S., Tunik, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Progress in Photon Science: Emerging New Directions. 115, (2017).</li><li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+macro-imager+based+on+Tpx3Cam+optical+camera+for+PLIM+applications.">A new macro-imager based on Tpx3Cam optical camera for PLIM applications.</a> Proceedings of SPIE. , 113591 (2020).</li><li>Fisher-Levine, M., Nomerotski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TimepixCam:+A+fast+optical+imager+with+time-stamping.">TimepixCam: A fast optical imager with time-stamping.</a> Journal of Instrumentation. 11, (2016).</li><li>Nomerotski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+time+stamping+of+photons+with+nanosecond+resolution+in+Timepix+based+optical+cameras.">Imaging and time stamping of photons with nanosecond resolution in Timepix based optical cameras.</a> Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 937. 937, 26-30 (2019).</li><li>Poikela, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timepix3:+A+65K+channel+hybrid+pixel+readout+chip+with+simultaneous+ToA/ToT+and+sparse+readout.">Timepix3: A 65K channel hybrid pixel readout chip with simultaneous ToA/ToT and sparse readout.</a> Journal of Instrumentation. 9, 05013 (2014).</li><li>Nomerotski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+TimepixCam,+a+fast+imager+for+the+time-stamping+of+optical+photons.">Characterization of TimepixCam, a fast imager for the time-stamping of optical photons.</a> Journal of Instrumentation. 12, 01017 (2017).</li><li>Hirvonen, L. M., Fisher-Levine, M., Suhling, K., Nomerotski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photon+counting+phosphorescence+lifetime+imaging+with+TimepixCam.">Photon counting phosphorescence lifetime imaging with TimepixCam.</a> Review of Scientific Instruments. 88, 013104 (2017).</li><li>Visser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDR:+A+read-out+system+for+Medipix3+&amp;+Timepix3.">SPIDR: A read-out system for Medipix3 &amp; Timepix3.</a> Journal of Instrumentation. 10, 12028 (2015).</li><li>Tsytsarev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+brain+metabolism+activity+using+a+phosphorescent+oxygen-sensitive+probe.">In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe.</a> Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).</li><li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+O2+concentration+in+ex-vivo+tissue+samples+on+a+fast+PLIM+macro-imager.">Mapping O2 concentration in ex-vivo tissue samples on a fast PLIM macro-imager.</a> Scientific Reports. 10, 19006 (2020).</li><li>Kersemans, V., Cornelissen, B., Allen, P. D., Beech, J. S., Smart, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+tumor+volume+measurement+in+the+awake,+manually+restrained+mouse+using+MRI.">Subcutaneous tumor volume measurement in the awake, manually restrained mouse using MRI.</a> Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (6), 1499-1504 (2013).</li><li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+luminescence+lifetime+macro-imager+based+on+a+Tpx3Cam+optical+camera.">New luminescence lifetime macro-imager based on a Tpx3Cam optical camera.</a> Biomedical Optics Express. 11 (1), 77-88 (2020).</li><li>Papkovsky, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescent+polymer+films+for+optical+oxygen+sensors.">Phosphorescent polymer films for optical oxygen sensors.</a> Biosensors and Bioelectronics. 7 (3), 199-206 (1992).</li><li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+planar+phosphorescence+based+oxygen+sensors+on+a+TCSPC-PLIM+macro-imager.">Characterization of planar phosphorescence based oxygen sensors on a TCSPC-PLIM macro-imager.</a> Sensors and Actuators, B: Chemical. 321, 128459 (2020).</li><li>Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Berndt, K. W., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging.">Fluorescence lifetime imaging.</a> Analytical Biochemistry. 202 (2), 316-330 (1992).</li></ol>

Ovenstående protokoller giver en detaljeret beskrivelse af samlingen af det nye kamera og dets funktion i mikrosekund FLIM/PLIM-tilstand. Det TCSPC-baserede nye generation Tpx3Cam-kamera, kombineret med den optomekaniske adapter Cricket med billedforstærkeren, emissionsfilteret og makroobjektivet, producerer et stabilt, kompakt og fleksibelt optisk modul, der er let at betjene. Billeddanneren viste sig at fungere godt med en række forskellige prøver og analytiske opgaver, som omfattede karakterisering af fosforescere...

O 2 er et af de vigtigste miljøparametre for levende systemer, og viden om fordelingen af O 2 og dens dynamik er vigtig for mange biologiske undersøgelser 1,2,3. Vurderingen af vævets iltning ved hjælp af fosforescerende sonder 4,5,6,7,8 og PLIM 9,10,11,12,13 vinder popularitet inden for biologisk og medicinsk forskning 3,9,14,15,16, 17,18,19. Dette skyldes, at PLIM, i modsætning til fluorescens- eller phosphorescensintensitetsmålinger, ikke påvirkes af eksterne faktorer såsom sondekoncentration, fotoblegning, excitationsintensitet, optisk justering, spredning og autofluorescens.
Imidlertid er nuværende O2 PLIM-platforme begrænset af deres følsomhed, billedoptagelseshastighed, nøjagtighed og generelle brugervenlighed. Tidskorreleret enkeltfotontælling (TCSPC) kombineret med en rasterscanningsprocedure bruges ofte i PLIM- og FLIM-enheder (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) 20,21,22. Men da PLIM kræver en lang pixelopholdstid (i millisekundområdet), er tiden for billedoptagelse meget længere end hvad der kræves til FLIM-applikationer20,22,23. Andre teknikker, såsom gated CCD / CMOS-kameraer, mangler enkelt fotonfølsomhed og har lave billedhastigheder20,24,25,26. Desuden anvendes de eksisterende PLIM-systemer mest i mikroskopisk format, mens makroskopiske systemer er mindre almindelige27.
Det TCSPC-baserede PLIM macro imager28 blev oprettet for at overvinde mange af disse begrænsninger. Kameraets design blev i høj grad lettet ved brug af en ny optomekanisk adapter, Cricket, som har følgende: i) to C-mount-adaptere, som giver nem kobling af kameramodulet på bagsiden og objektivobjektiv på forsiden; ii) et indvendigt hus til en billedforstærker og en stikkontakt til sidstnævnte på ydersiden af cricket; iii) et indvendigt rum bag C-monteringsadapteren på forsiden, hvor et standard 25 mm emissionsfilter kan anbringes foran forstærkeren og iv) en indbygget lyskolliderende optik med ringregulatorer, som tillader optisk justering / fokusering mellem linsen og kameraet for at producere skarpe billeder på kamerachippen.
I det samlede kamera er kameramodulet koblet til bagsiden af Cricket-adapteren, som også huser en billedforstærker bestående af en fotokatode efterfulgt af en mikrokanalplade (MCP), en forstærker og en hurtig scintillator, P47-fosfor. Et 760 nm ± 50 nm emissionsfilter er monteret inde i Cricket, og en objektivlinse, NMV-50M11'', er fastgjort til C-mount-adapteren på forsiden. Endelig er linsen og kameraet justeret optisk med ringregulatorer.
Forstærkerens rolle er at detektere indkommende fotoner og omdanne dem til hurtige lysudbrud på kamerachippen, som registreres og bruges til at generere emissionshenfald og levetidsbilleder. Kameramodulet består af et avanceret TCSPC-baseret optisk sensorarray (256 pixels x 256 pixels) og en ny generation af udlæsningschip 29,30,31,32,33, som muliggør samtidig registrering af ankomsttidspunktet (TOA) og tiden over tærsklen (TOT) for fotonudbrud ved hver pixel i billedchippen med en tidsopløsning på 1,6 ns og en udlæsningshastighed på 80 Mpixel/s.
I denne konfiguration har kameraet med forstærkeren enkeltfotonfølsomhed. Det er datadrevet og baseret på SPIDR-systemet (Speedy Pixel Detector Readout)34. Den rumlige opløsning af billeddanneren var tidligere karakteriseret med plane fosforescerendeO2-sensorer og en opløsningsplademaske. Instrumentresponsfunktionen (IRF) blev målt ved billeddannelse af en plan fluorescerende sensor under de samme indstillinger, som blev brugt til alle de andre målinger. Farvestoffets levetid på omkring 2,6 ns var kort nok til, at det kunne bruges til IRF-måling i PLIM-tilstand. Kameraet kan afbilde objekter på op til 18 mm x 18 mm i størrelse med rumlige og tidsmæssige opløsninger på henholdsvis 39,4 μm og 30,6 ns (fuld bredde ved halv maksimum)28.
Følgende protokoller beskriver samlingen af makrokameraet og dets efterfølgende anvendelse til kortlægning af O2-koncentrationen i biologiske prøver farvet med den tidligere karakteriserede nær-infrarødeO2-sonde, NanO2-IR35. Sonden er en lys, fotobar, cellegennemtrængelig O2-sensing sonde baseret på platin (II) benzoporphyrin (PtBP) farvestof. Det er spændende ved 625 nm, udsender ved 760 nm og giver et robust optisk respons på O2 i det fysiologiske område (0% -21% eller 0-210 μMO2). Billeddanneren er også demonstreret for at karakterisere forskellige sensormaterialer baseret på Pt(II)-porfyrinfarvestoffer. Samlet set er kameraet kompakt og fleksibelt, svarende til et almindeligt fotografisk kamera. I den nuværende opsætning er imageren velegnet til forskellige widefield PLIM-applikationer. Udskiftning af LED'en med en hurtig laserkilde vil yderligere forbedre billeddannerens ydeevne og kan potentielt muliggøre nanosekund FLIM-applikationer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>627 nm LED</td>
			<td>Parts Express</td>
			<td></td>
			<td>Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>760 &#177; 50 nm emission filter</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>84-788</td>
			<td>Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 &#177; 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balb/c mice</td>
			<td>Envigo, UK</td>
			<td>Balb/c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black box</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25C9/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cricket Adapter</td>
			<td>Photonis</td>
			<td>Cricket-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CT26 cells&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CT26.WT</td>
			<td>https://www.atcc.org/products/crl-2638</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0697</td>
			<td>Other media can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen</td>
			<td>Photonis</td>
			<td>PP0360EF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900.300</td>
			<td>35 mm diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar plastic film, 75 micron&#160;</td>
			<td>RS Ireland</td>
			<td>785-0795</td>
			<td>Othe plastic substrates can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanO2-IR</td>
			<td>home-made</td>
			<td>n/a</td>
			<td>The probe can be synthesised according to the published method &#39;Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.&#39; or provided by our lab.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMV-50M11&#8221; 50 mm lens</td>
			<td>Navitar</td>
			<td></td>
			<td>Other lenses compatibel with C-mount adators can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB1836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1472.001</td>
			<td>92 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Supply</td>
			<td>Tenma</td>
			<td>72-10495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse Generator</td>
			<td>Tenma</td>
			<td>TGP110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sophy</td>
			<td>Amsterdam Scientific Instruments</td>
			<td>n/z</td>
			<td>Provided by ASI together with the Tpx3Cam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tpx3Cam</td>
			<td>Amsterdam Scientific Instruments</td>
			<td>TPXCAM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri2 Software</td>
			<td>University of Oxford</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ Translation Stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LT3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence lifetime macro imager for biomedical applications

Dette papir præsenterer et nyt fotoluminescenslevetidskamera designet til at kortlægge koncentrationen af molekylært ilt (O2) i forskellige fosforescerende prøver, der spænder fra faststof, O2-følsomme belægninger til levende animalske vævsprøver farvet med opløseligeO2-følsomme sonder. Især blev den nanopartikelbaserede nær-infrarøde sonde NanO2-IR, som er spændende med en 625 nm lysemitterende diode (LED) og udsender ved 760 nm, brugt. Billedbehandlingssystemet er baseret på Timepix3-kameraet (Tpx3Cam) og den optomekaniske adapter, som også huser en billedforstærker. O2 phosphorescens levetid billeddannelse mikroskopi (PLIM) er almindeligt påkrævet for forskellige undersøgelser, men nuværende platforme har begrænsninger i deres nøjagtighed, generelle fleksibilitet og brugervenlighed.
Systemet, der præsenteres her, er et hurtigt og meget følsomt kamera, der er bygget på en integreret optisk sensor og udlæsningschipmodul, Tpx3Cam. Det er vist at producere højintensive phosphorescenssignaler og stabile levetidsværdier fra overfladefarvede tarmvævsprøver eller intraluminalt farvede fragmenter af tyktarmen og muliggør detaljeret kortlægning af vævO2-niveauer i ca. 20 s eller mindre. Indledende forsøg på billeddannelse af hypoxi i podede tumorer hos bevidstløse dyr præsenteres også. Vi beskriver også, hvordan kameraet kan omkonfigureres til brugmed O2-følsomme materialer baseret på Pt-porfyrinfarvestoffer ved hjælp af en 390 nm LED til excitation og et båndpas 650 nm filter til emission. Samlet set viste PLIM-kameraet sig at producere nøjagtige kvantitative målinger af levetidsværdier for de anvendte sonder og respektive todimensionelle kort overO2-koncentrationen . Det er også nyttigt til metabolisk billeddannelse af ex vivo vævsmodeller og levende dyr.

Til ex vivo-billeddannelsesapplikationer blev fragmenter af tarmvæv farvet ved topisk anvendelse af NanO2-IR-sonden på den serosale side af vævet. For dybere farvning blev 1 μL af sonden injiceret i lumen. I sidstnævnte tilfælde skærmede den 0,2-0,25 mm tykke tarmvæg sonden fra kameraet. De to farvningsprocesser er vist i figur 2A.
Den resulterende intensitet og PLIM-billeder er vist i figur 2B-G<stro...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications at JoVE.com

Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications

Dette papir beskriver brugen af et nyt, hurtigt optisk kamera til makroskopisk fotoluminescens levetidsbilleddannelse af prøver med lang henfaldsemission. Integrations-, billedoptagelses- og analyseprocedurerne beskrives sammen med forberedelsen og karakteriseringen af sensormaterialerne til billeddannelse og anvendelse af billeddanneren til undersøgelse af biologiske prøver.

Fluorescens levetid makro imager til biomedicinske applikationer

This paper presents a new photoluminescence lifetime imager designed to map the molecular oxygen (O2) concentration in different phosphorescent samples ...

Vores protokol giver detaljeret 2D-kortlægning af fosforescenslevetid og iltkoncentration i makroskopiske objekter, især levende dyrevæv og hele dyr, ved hjælp af dedikerede sonder og sensormaterialer. Disse oplysninger er vigtige for mange forskningsområder. Vores protokol bruger et integreret og kompakt billeddannelsesmodul, der fungerer i TCSPC-tilstand og giver nem og nøjagtig visualisering af levetid og iltfordeling i komplekse biologiske prøver, såsom livsvæv.Tag Cricket-adapteren og inspicer den fra forskellige sider. Fjern den forreste C-mount-adapter for at vise Photonis PP0360EF-forstærkeren, der er placeret i Cricket, og sæt derefter C-mount-adapteren tilbage. Fjern Crickets C-mount-adapter på forsiden, og indsæt 650 plus/minus 50 nanometer emissionsfilteret.Løs problemet ved at sætte C-holderen tilbage. Tilslut derefter TPX tre-cam-kameramodulet til bagsiden af Cricket-modulet via deres ringadaptere. Tilslut objektivet til forsiden af Cricket-modulet via C-mount-adapteren.Tilslut LED'en til en strømforsyning og en pulsgenerator. Monter nu den 390-nanometer superlyse LED på en stolpe, der er fastgjort til et brødbræt inde i den sorte boks. Tænd LED'en, og fokuser den for at sikre effektiv og ensartet excitation af prøven, der afbildes.Monter kameraenheden oven på den optiske sorte boks med forsiden nedad mod det stadium, hvor prøverne skal afbildes. Tilslut kameraet og LED'en til topulsgeneratorer og et firekanals oscilloskop. Brug indstillinger på oscilloskopet og pulsgeneratorerne til at synkronisere de impulser, der sendes til kameraet og LED'en.Brug det specielle kabel og stikkontakten på Cricket-enheden til at tilslutte forstærkeren til en standard strømforsyning og indstil forstærkningen til 2,7 volt. Placer prøven før kameralinsen. Tænd derefter kameraet og alle de elektriske moduler, undtagen forstærkeren.Aktivér SOFI-softwaren for at indstille driftsparametrene, såsom fokusering og prøvejustering. I modulerne skal du indstille rammeeksponeringen til 0,01 sekunder. Vælg Uendelige billeder, og indstil pixeldriftstilstanden til tid over tærsklen.Gå derefter til Preview og vælg Aktivt modul for at åbne Medipix / Timepix-rammevinduet. I det næste trin, efter at du har startet optagelsen, skal du justere farveskalaen og rotere billedet til den ønskede retning. Sluk derefter lysene i rummet og tænd forstærkeren.Fokuser kameraoptikken på prøvetrinnet med objektivets og Cricketadapterens fokuseringsfunktioner for at generere klare billeder af prøver med god kontrast og lysstyrke. Når fokus er færdigt, skal du lukke SOFI-softwaren. Gå derefter til terminalen, udfør kommandoerne i specialdesignsoftwaren for at erhverve de rå data i det binære format og lukke terminalen.Åbn en ny terminal for at behandle de erhvervede data. Indlæs datafilen, og kør datareduktionen. Analyser efterbehandlingsdataene med et dedikeret program skrevet på C-sprog, der skriver dataene i en ICS-billedfil.Åbn derefter ICS-billedfilerne ved hjælp af den frit tilgængelige Time Resolved Imaging-software, og brug to eksponentielle funktioner til at tilpasse fosforescenshenfaldene. Til sidst skal du åbne Fitted. ICS-billedfiler med den tilgængelige billedanalysesoftware.Generer billeder af phosphorescenslevetid ved hjælp af opslagstabeller, og kod dem i pseudofarveskala. Brug funktionen Måling til at beregne de gennemsnitlige levetidsværdier for hele billedet eller interesseområder. Phosphorescensintensitet og phosphorescenslevetid billeddannelsesmikroskopi billeder af platinoctaethylporphyrinfarvestofsensorstedet i oxygeneret og deoxygeneret tilstand vises.Sørg for, at det rigtige emissionsfilter er monteret inde i Cricket, og at den rigtige LED, kabelforbindelser og pulsindstillinger bruges. I øjeblikket er denne protokol begrænset til dyremodeller, men kan potentielt anvendes til at diagnosticere og behandle patologiske tilstande forbundet med vævshypoxi, såsom kræft, slagtilfælde og betændelse.

Research

JoVE Journal

Biology

BioMEMS and Cellular Biology: Perspectives and Applications

The ability to culture cells has revolutionized hypothesis testing in basic cell and molecular biology research. It has become a standard methodology in ...

Microfluidic Applications for Disposable Diagnostics

In this interview, Dr. Klapperich discusses the fabrication of thermoplastic microfluidic devices and their application for development of new ...

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Absolut kvantumudbytte Måling af pulverprøver

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Infinium Assay for Storstilet SNP Genotypebestemmelse Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Inddrivelse af voksne zebrafisk Hearts for high-throughput applikationer

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Genetisk Barcoding med fluorescerende proteiner for Multipleksede Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...