Name: fluorescence lifetime macro imager for biomedical applications
Uploaded: 2023-04-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications at JoVE.com

Le soutien financier pour ce travail de la Science Foundation Ireland, des subventions SFI/12/RC/2276_P2, SFI/17/RC-PhD/3484 et 18/SP/3522, et de Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland) est vivement apprécié.

Toutes les procédures sur les animaux ont été effectuées en vertu d’autorisations délivrées par l’Autorité de réglementation des produits de santé (HPRA, Irlande) conformément à la directive du Conseil des Communautés européennes (2010/63/UE) et ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’expérimentation animale de l’University College Cork.
1. Préparation de l’échantillon
<ol><li>Coloration avec la sonde d’échantillons de tissus vivan...

<ol>
	<li>Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+oxygen+and+hypoxia+in+cell+and+tissue+samples.">Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).</li><li>Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+is+the+partial+oxygen+pressure+of+human+tissues+a+crucial+parameter?+Small+molecules+and+hypoxia.">Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 15 (6), 1239-1253 (2011).</li><li>Yoshihara, T., Hirakawa, Y., Hosaka, M., Nangaku, M., Tobita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+imaging+of+living+cells+and+tissues+using+luminescent+molecular+probes.">Oxygen imaging of living cells and tissues using luminescent molecular probes.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews. 30, 71-95 (2017).</li><li>Papkovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescence+based+oxygen+sensors+essential+tools+for+cell+biology+and+life+science+research.">Phosphorescence based oxygen sensors essential tools for cell biology and life science research.</a> 17th International Meeting on Chemical Sensors - IMCS. , 71-72 (2018).</li><li>Tsytsarev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+brain+metabolism+activity+using+a+phosphorescent+oxygen-sensitive+probe.">In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe.</a> Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).</li><li>O'Donovan, C., Hynes, J., Yashunski, D., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescent+oxygen-sensitive+materials+for+biological+applications.">Phosphorescent oxygen-sensitive materials for biological applications.</a> Journal of Materials Chemistry. 15, 2946-2951 (2005).</li><li>Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+probes+and+techniques+for+O+2+measurement+in+live+cells+and+tissue.">Optical probes and techniques for O 2 measurement in live cells and tissue.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (12), 2025-2039 (2012).</li><li>Papkovsky, D. B., Zhdanov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescence+based+oxygen+sensors+and+probes+for+biomedical+research.">Phosphorescence based oxygen sensors and probes for biomedical research.</a> Advanced Environmental, Chemical, and Biological Sensing Technologies XIV. 10215, 102150 (2017).</li><li>Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+phosphorescence:+A+novel+method+for+measuring+oxygen+distribution+in+perfused+tissue.">Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue.</a> Science. 241 (4873), 1649-1651 (1988).</li><li>Hogan, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescence+quenching+method+for+measurement+of+intracellular+PO+2+in+isolated+skeletal+muscle+fibers.">Phosphorescence quenching method for measurement of intracellular PO 2 in isolated skeletal muscle fibers.</a> Journal of Applied Physiology. 86 (2), 720-724 (1999).</li><li>Apreleva, S. V., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomographic+imaging+of+oxygen+by+phosphorescence+lifetime.">Tomographic imaging of oxygen by phosphorescence lifetime.</a> Applied Optics. 45 (33), 8547-8559 (2006).</li><li>Becker, W., Shcheslavskiy, V., R&#252;ck, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+phosphorescence+and+fluorescence+lifetime+imaging+by+multi-dimensional+TCSPC+and+multi-pulse+excitation.">Simultaneous phosphorescence and fluorescence lifetime imaging by multi-dimensional TCSPC and multi-pulse excitation.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 19-30 (2017).</li><li>Wolfbeis, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescent+sensing+and+imaging+of+oxygen:+Fierce+competition+to+the+Clark+electrode.">Luminescent sensing and imaging of oxygen: Fierce competition to the Clark electrode.</a> BioEssays. 37 (8), 921-928 (2015).</li><li>Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+neurosphere+oxygenation+with+phosphorescent+probes.">Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes.</a> Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).</li><li>Shcheslavskiy, V. I., Neubauer, A., Bukowiecki, R., Dinter, F., Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+fluorescence+and+phosphorescence+lifetime+imaging.">Combined fluorescence and phosphorescence lifetime imaging.</a> Applied Physics Letters. 108, 091111 (2016).</li><li>Babilas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+phosphorescence+imaging+of+pO2+using+planar+oxygen+sensors.">In vivo phosphorescence imaging of pO2 using planar oxygen sensors.</a> Microcirculation. 12 (6), 477-487 (2005).</li><li>Babilas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+pO2+imaging+during+tourniquet-induced+forearm+ischemia+using+planar+optical+oxygen+sensors.">Transcutaneous pO2 imaging during tourniquet-induced forearm ischemia using planar optical oxygen sensors.</a> Skin Research and Technology. 14 (3), 304-311 (2008).</li><li>Golub, A. S., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PO2+measurements+in+the+microcirculation+using+phosphorescence+quenching+microscopy+at+high+magnification.">PO2 measurements in the microcirculation using phosphorescence quenching microscopy at high magnification.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2905-2916 (2008).</li><li>Zhdanov, A. V., Golubeva, A. V., Okkelman, I. A., Cryan, J. F., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+oxygen+gradients+in+giant+umbrella+cells:+An+ex+vivo+PLIM+study.">Imaging of oxygen gradients in giant umbrella cells: An ex vivo PLIM study.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 309 (7), 501-509 (2015).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+-+Techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging - Techniques and applications.</a> Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).</li><li>Jenkins, J., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B., Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cell+and+tissue+O+2+by+TCSPC-PLIM.">Imaging cell and tissue O 2 by TCSPC-PLIM.</a> Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Applications. , 225-247 (2015).</li><li>Becker, W., K&#246;nig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+TCSPC-FLIM+techniques.">Advanced TCSPC-FLIM techniques.</a> Multiphoton Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging: Applications in Biology and Medicine. , 23-52 (2018).</li><li>Wei, L., Yan, W., Ho, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+fluorescence+lifetime+analytical+microsystems:+Contact+optics+and+CMOS+time-resolved+electronics.">Recent advances in fluorescence lifetime analytical microsystems: Contact optics and CMOS time-resolved electronics.</a> Sensors. 17 (12), 2800 (2017).</li><li>Hirvonen, L. M., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wide-field+TCSPC:+Methods+and+applications.">Wide-field TCSPC: Methods and applications.</a> Measurement Science and Technology. 28, 012003 (2017).</li><li>Hirvonen, L. M., Festy, F., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wide-field+time-correlated+single-photon+counting+(TCSPC)+lifetime+microscopy+with+microsecond+time+resolution.">Wide-field time-correlated single-photon counting (TCSPC) lifetime microscopy with microsecond time resolution.</a> Optics Letters. 39 (19), 5602 (2014).</li><li>Sparks, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+new+gated+optical+image+intensifiers+for+fluorescence+lifetime+imaging.">Characterisation of new gated optical image intensifiers for fluorescence lifetime imaging.</a> Review of Scientific Instruments. 88 (1), 013707 (2017).</li><li>Chelushkin, P. S., Tunik, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Progress in Photon Science: Emerging New Directions. 115, (2017).</li><li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+macro-imager+based+on+Tpx3Cam+optical+camera+for+PLIM+applications.">A new macro-imager based on Tpx3Cam optical camera for PLIM applications.</a> Proceedings of SPIE. , 113591 (2020).</li><li>Fisher-Levine, M., Nomerotski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TimepixCam:+A+fast+optical+imager+with+time-stamping.">TimepixCam: A fast optical imager with time-stamping.</a> Journal of Instrumentation. 11, (2016).</li><li>Nomerotski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+time+stamping+of+photons+with+nanosecond+resolution+in+Timepix+based+optical+cameras.">Imaging and time stamping of photons with nanosecond resolution in Timepix based optical cameras.</a> Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 937. 937, 26-30 (2019).</li><li>Poikela, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timepix3:+A+65K+channel+hybrid+pixel+readout+chip+with+simultaneous+ToA/ToT+and+sparse+readout.">Timepix3: A 65K channel hybrid pixel readout chip with simultaneous ToA/ToT and sparse readout.</a> Journal of Instrumentation. 9, 05013 (2014).</li><li>Nomerotski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+TimepixCam,+a+fast+imager+for+the+time-stamping+of+optical+photons.">Characterization of TimepixCam, a fast imager for the time-stamping of optical photons.</a> Journal of Instrumentation. 12, 01017 (2017).</li><li>Hirvonen, L. M., Fisher-Levine, M., Suhling, K., Nomerotski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photon+counting+phosphorescence+lifetime+imaging+with+TimepixCam.">Photon counting phosphorescence lifetime imaging with TimepixCam.</a> Review of Scientific Instruments. 88, 013104 (2017).</li><li>Visser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDR:+A+read-out+system+for+Medipix3+&amp;+Timepix3.">SPIDR: A read-out system for Medipix3 &amp; Timepix3.</a> Journal of Instrumentation. 10, 12028 (2015).</li><li>Tsytsarev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+brain+metabolism+activity+using+a+phosphorescent+oxygen-sensitive+probe.">In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe.</a> Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).</li><li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+O2+concentration+in+ex-vivo+tissue+samples+on+a+fast+PLIM+macro-imager.">Mapping O2 concentration in ex-vivo tissue samples on a fast PLIM macro-imager.</a> Scientific Reports. 10, 19006 (2020).</li><li>Kersemans, V., Cornelissen, B., Allen, P. D., Beech, J. S., Smart, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+tumor+volume+measurement+in+the+awake,+manually+restrained+mouse+using+MRI.">Subcutaneous tumor volume measurement in the awake, manually restrained mouse using MRI.</a> Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (6), 1499-1504 (2013).</li><li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+luminescence+lifetime+macro-imager+based+on+a+Tpx3Cam+optical+camera.">New luminescence lifetime macro-imager based on a Tpx3Cam optical camera.</a> Biomedical Optics Express. 11 (1), 77-88 (2020).</li><li>Papkovsky, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescent+polymer+films+for+optical+oxygen+sensors.">Phosphorescent polymer films for optical oxygen sensors.</a> Biosensors and Bioelectronics. 7 (3), 199-206 (1992).</li><li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+planar+phosphorescence+based+oxygen+sensors+on+a+TCSPC-PLIM+macro-imager.">Characterization of planar phosphorescence based oxygen sensors on a TCSPC-PLIM macro-imager.</a> Sensors and Actuators, B: Chemical. 321, 128459 (2020).</li><li>Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Berndt, K. W., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging.">Fluorescence lifetime imaging.</a> Analytical Biochemistry. 202 (2), 316-330 (1992).</li></ol>

Les protocoles ci-dessus donnent une description détaillée de l’assemblage du nouvel imageur et de son fonctionnement en mode FLIM/PLIM à la microseconde. La caméra Tpx3Cam de nouvelle génération basée sur TCSPC, couplée au moyen de l’adaptateur opto-mécanique Cricket avec l’intensificateur d’image, le filtre d’émission et la macro-lentille, produit un module optique stable, compact et flexible facile à utiliser. L’imageur s’est avéré performant avec une gamme d’échantillons et de tâches an...

O2 est l’un des paramètres environnementaux clés pour les systèmes vivants, et la connaissance de la distribution deO2 et de sa dynamique est importante pour de nombreuses études biologiques 1,2,3. L’évaluation de l’oxygénation des tissus au moyen des sondes phosphorescentes 4,5,6,7,8 et PLIM 9,10,11,12,13 gagne en popularité dans la recherche biologique et médicale 3,9,14,15,16, 17,18,19. En effet, le PLIM, contrairement aux mesures de fluorescence ou d’intensité de phosphorescence, n’est pas affecté par des facteurs externes tels que la concentration de la sonde, le photoblanchiment, l’intensité de l’excitation, l’alignement optique, la diffusion et l’autofluorescence.
Cependant, les plates-formes PLIM O2 actuelles sont limitées par leur sensibilité, leur vitesse d’acquisition d’images, leur précision et leur facilité d’utilisation générale. Le comptage monophotonique corrélé dans le temps (TCSPC), combiné à une procédure de balayage raster, est fréquemment utilisé dans les dispositifs PLIM et FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy)20,21,22. Cependant, comme PLIM nécessite un long temps de séjour des pixels (de l’ordre de la milliseconde), le temps d’acquisition de l’image est beaucoup plus long que ce qui est requis pour les applications FLIM20,22,23. D’autres techniques, telles que les caméras CCD/CMOS fermées, manquent de sensibilité à un seul photon et ont de faibles fréquences d’images20,24,25,26. De plus, les systèmes PLIM existants sont principalement utilisés au format microscopique, tandis que les systèmes macroscopiques sont moins courants27.
L’imageur de macro PLIM28 basé sur TCSPC a été configuré pour surmonter bon nombre de ces limitations. La conception de l’imageur a été grandement facilitée par l’utilisation d’un nouvel adaptateur opto-mécanique, Cricket, qui a les éléments suivants: i) deux adaptateurs à monture C, qui permettent un couplage facile du module de caméra à l’arrière et de l’objectif de l’objectif à l’avant; ii) un boîtier interne pour un intensificateur d’image et une prise de courant pour ce dernier sur la face extérieure du grillon; iii) un espace interne derrière l’adaptateur à monture C de la face avant où un filtre d’émission standard de 25 mm peut être logé devant l’intensificateur; et iv) une optique de collimature lumineuse intégrée avec des régulateurs annulaires, qui permettent l’alignement optique / mise au point entre l’objectif et la caméra pour produire des images nettes sur la puce de l’appareil photo.
Dans l’imageur assemblé, le module de caméra est couplé à l’arrière de l’adaptateur Cricket, qui abrite également un intensificateur d’image composé d’une photocathode suivie d’une plaque à microcanaux (MCP), d’un amplificateur et d’un scintillateur rapide, le phosphore P47. Un filtre d’émission de 760 nm ± 50 nm est installé à l’intérieur du Cricket, et un objectif d’objectif, NMV-50M11'', est fixé à l’adaptateur de monture C de la face avant. Enfin, l’objectif et la caméra sont alignés optiquement avec des régulateurs annulaires.
Le rôle de l’intensificateur est de détecter les photons entrants et de les convertir en rafales de lumière rapides sur la puce de la caméra, qui sont enregistrées et utilisées pour générer des désintégrations d’émission et des images à vie. Le module de caméra comprend un réseau avancé de capteurs optiques basés sur TCSPC (256 pixels x 256 pixels) et une puce de lecture de nouvelle génération 29,30,31,32,33, qui permettent l’enregistrement simultané de l’heure d’arrivée (TOA) et du temps au-delà du seuil (TOT) des sursauts de photons à chaque pixel de la puce d’imagerie avec une résolution temporelle de 1,6 ns et un taux de lecture de 80 Mpixel / s.
Dans cette configuration, la caméra avec l’intensificateur a une sensibilité à photon unique. Il est axé sur les données et basé sur le système de lecture rapide du détecteur de pixels (SPIDR)34. La résolution spatiale de l’imageur était auparavant caractérisée par des capteurs O2 phosphorescents planaires et un masque de plaque de résolution. La fonction de réponse de l’instrument (IRF) a été mesurée par l’imagerie d’un capteur fluorescent planaire sous les mêmes réglages que ceux utilisés pour toutes les autres mesures. La durée de vie du colorant d’environ 2,6 ns était suffisamment courte pour qu’il puisse être utilisé pour la mesure IRF en mode PLIM. L’imageur peut imager des objets d’une taille maximale de 18 mm x 18 mm avec des résolutions spatiales et temporelles de 39,4 μm et 30,6 ns (pleine largeur à la moitié maximum), respectivement28.
Les protocoles suivants décrivent l’assemblage du macroimageur et son utilisation ultérieure pour cartographier la concentration d’O2 dans des échantillons biologiques colorés avec la sonde O2 proche infrarouge précédemment caractérisée,NanO2-IR 35. La sonde est une sonde de détection O2 brillante, photostable, perméable aux cellules, à base de colorant benzoporphyrine (PtBP) en platine (II). Il est excitable à 625 nm, émet à 760 nm et fournit une réponse optique robuste àO2 dans la gamme physiologique (0%-21% ou 0-210 μM de O2). Il est également démontré que l’imageur caractérise différents matériaux de capteur à base de colorants à porphyrine Pt(II). Dans l’ensemble, l’imageur est compact et flexible, similaire à un appareil photo commun. Dans la configuration actuelle, l’imageur est adapté à différentes applications PLIM grand champ. Le remplacement de la LED par une source laser rapide améliorera encore les performances de l’imageur et pourrait potentiellement permettre des applications FLIM nanosecondes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>627 nm LED</td>
			<td>Parts Express</td>
			<td></td>
			<td>Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>760 &#177; 50 nm emission filter</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>84-788</td>
			<td>Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 &#177; 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balb/c mice</td>
			<td>Envigo, UK</td>
			<td>Balb/c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black box</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25C9/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cricket Adapter</td>
			<td>Photonis</td>
			<td>Cricket-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CT26 cells&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CT26.WT</td>
			<td>https://www.atcc.org/products/crl-2638</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0697</td>
			<td>Other media can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen</td>
			<td>Photonis</td>
			<td>PP0360EF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900.300</td>
			<td>35 mm diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar plastic film, 75 micron&#160;</td>
			<td>RS Ireland</td>
			<td>785-0795</td>
			<td>Othe plastic substrates can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanO2-IR</td>
			<td>home-made</td>
			<td>n/a</td>
			<td>The probe can be synthesised according to the published method &#39;Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.&#39; or provided by our lab.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMV-50M11&#8221; 50 mm lens</td>
			<td>Navitar</td>
			<td></td>
			<td>Other lenses compatibel with C-mount adators can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB1836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1472.001</td>
			<td>92 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Supply</td>
			<td>Tenma</td>
			<td>72-10495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse Generator</td>
			<td>Tenma</td>
			<td>TGP110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sophy</td>
			<td>Amsterdam Scientific Instruments</td>
			<td>n/z</td>
			<td>Provided by ASI together with the Tpx3Cam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tpx3Cam</td>
			<td>Amsterdam Scientific Instruments</td>
			<td>TPXCAM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri2 Software</td>
			<td>University of Oxford</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ Translation Stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LT3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence lifetime macro imager for biomedical applications

Cet article présente un nouvel imageur à durée de vie par photoluminescence conçu pour cartographier la concentration d’oxygène moléculaire (O2) dans différents échantillons phosphorescents allant des revêtements sensibles à l’état solide à l’O 2 aux échantillons de tissus animaux vivants colorés avec des sondes solubles sensibles à l’O2. En particulier, la sonde proche infrarouge à base de nanoparticules NanO2-IR, qui est excitable avec une diode électroluminescente (LED) de 625 nm et émet à 760 nm, a été utilisée. Le système d’imagerie est basé sur la caméra Timepix3 (Tpx3Cam) et l’adaptateur opto-mécanique, qui abrite également un intensificateur d’image. La microscopie d’imagerie à vie par phosphorescence O2 (PLIM) est couramment requise pour diverses études, mais les plates-formes actuelles ont des limites dans leur précision, leur flexibilité générale et leur facilité d’utilisation.
Le système présenté ici est un imageur rapide et très sensible, construit sur un capteur optique intégré et un module de puce de lecture, Tpx3Cam. Il est démontré qu’il produit des signaux de phosphorescence de haute intensité et des valeurs de vie stables à partir d’échantillons de tissus intestinaux colorés en surface ou de fragments du gros intestin colorés par voie intraluminale et permet la cartographie détaillée des niveaux de tissu O2 en environ 20 s ou moins. Des expériences initiales sur l’imagerie de l’hypoxie dans les tumeurs greffées chez des animaux inconscients sont également présentées. Nous décrivons également comment l’imageur peut être reconfiguré pour une utilisation avec des matériaux sensibles à l’O2 à base de colorants Pt-porphyrine à l’aide d’une LED de 390 nm pour l’excitation et d’un filtre passe-bande de 650 nm pour l’émission. Dans l’ensemble, on a constaté que l’imageur PLIM produisait des mesures quantitatives précises des valeurs de durée de vie des sondes utilisées et des cartes bidimensionnelles respectives de la concentration d’O2. Il est également utile pour l’imagerie métabolique de modèles tissulaires ex vivo et d’animaux vivants.

Pour les applications d’imagerie ex vivo , des fragments de tissus intestinaux ont été colorés par l’application topique de la sonde NanO2-IR sur la face sérossale du tissu. Pour une coloration plus profonde, 1 μL de la sonde a été injecté dans la lumière. Dans ce dernier cas, la paroi intestinale de 0,2 à 0,25 mm d’épaisseur protégeait la sonde de la caméra. Les deux procédés de coloration sont illustrés à la figure 2A.
L’intensi...

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Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications

Cet article décrit l’utilisation d’un nouvel imageur optique rapide pour l’imagerie macroscopique à vie par photoluminescence d’échantillons émettant de longues désintégrations. Les procédures d’intégration, d’acquisition d’images et d’analyse sont décrites, ainsi que la préparation et la caractérisation des matériaux du capteur pour l’imagerie et l’application de l’imageur dans l’étude d’échantillons biologiques.

Macro-imageur à vie de fluorescence pour applications biomédicales

This paper presents a new photoluminescence lifetime imager designed to map the molecular oxygen (O2) concentration in different phosphorescent samples ...

Notre protocole fournit une cartographie 2D détaillée de la durée de vie de la phosphorescence et de la concentration d’oxygène dans les objets macroscopiques, en particulier les tissus animaux vivants et les animaux entiers, au moyen de sondes et de matériaux de détection dédiés. Cette information est importante pour de nombreux domaines de recherche. Notre protocole utilise un module d’imagerie intégré et compact qui fonctionne en mode TCSPC et fournit une visualisation facile et précise de la durée de vie et de la distribution de l’oxygène dans des échantillons biologiques complexes, tels que les tissus vivants.Prenez l’adaptateur Cricket et inspectez-le de différents côtés. Retirez l’adaptateur de monture C de la face avant pour montrer l’intensificateur de PP0360EF Photonis logé dans le Cricket, puis remettez l’adaptateur de monture C. Retirez l’adaptateur de monture C de la face avant du Cricket et insérez le filtre d’émission 650 plus / moins 50 nanomètres.Réparez-le en remettant la monture C. Ensuite, connectez le module de caméra à trois cames TPX à l’arrière du module Cricket via leurs adaptateurs annulaires. Connectez l’objectif à l’avant du module Cricket via l’adaptateur de monture C.Connectez la LED à une alimentation et à un générateur d’impulsions. Maintenant, montez la LED super lumineuse de 390 nanomètres sur un poteau attaché à une breadboard à l’intérieur de la boîte noire. Allumez la LED et concentrez-la pour assurer une excitation efficace et uniforme de l’échantillon à imager.Montez l’ensemble caméra sur le dessus de la boîte noire optique vers le bas vers la scène où les échantillons seront imagés. Connectez la caméra et la LED à des générateurs à deux impulsions et à un oscilloscope à quatre canaux. À l’aide des réglages de l’oscilloscope et des générateurs d’impulsions, synchronisez les impulsions envoyées à la caméra et à la LED.Utilisez le câble spécial et la prise de l’unité Cricket pour connecter l’intensificateur à une alimentation standard et régler le gain à 2,7 volts. Placez l’échantillon devant l’objectif de la caméra. Ensuite, allumez la caméra et tous les modules électriques, à l’exception de l’intensificateur.Activez le logiciel SOFI pour régler les paramètres opérationnels, tels que la mise au point et l’alignement des échantillons. Dans les modules, définissez l’exposition de l’image sur 0,01 seconde. Sélectionnez Images infinies et définissez le mode de fonctionnement des pixels sur le dépassement du seuil.Ensuite, allez dans Aperçu et sélectionnez Module actif pour ouvrir la fenêtre des images Medipix / Timepix. À l’étape suivante, après avoir démarré l’enregistrement, ajustez l’échelle de couleurs et faites pivoter l’image dans l’orientation souhaitée. Après cela, éteignez les lumières de la pièce et allumez l’intensificateur.Concentrez l’optique de la caméra sur la scène d’échantillonnage avec les capacités de mise au point de l’objectif et de l’adaptateur Cricket pour générer des images claires des échantillons avec un bon contraste et une bonne luminosité. Une fois le focus terminé, fermez le logiciel SOFI. Ensuite, allez au terminal, exécutez les commandes du logiciel de conception personnalisée pour acquérir les données brutes au format binaire et fermez le terminal.Ouvrez un nouveau terminal pour traiter les données acquises. Chargez le fichier de données et exécutez le réducteur de données. Analysez les données de post-traitement avec un programme dédié écrit en langage C qui écrira les données dans un fichier image ICS.Ensuite, ouvrez les fichiers image ICS à l’aide du logiciel d’imagerie à résolution temporelle disponible gratuitement et utilisez deux fonctions exponentielles pour s’adapter aux désintégrations de phosphorescence. Enfin, ouvrez le Fitted. ICS fichiers d’image avec le logiciel d’analyse d’image disponible.Générez des images de durée de vie de phosphorescence à l’aide de tables de correspondance et codez-les dans une pseudo-échelle de couleurs. Utilisez la fonction Mesure pour calculer les valeurs moyennes de durée de vie de l’image ou des régions d’intérêt. Les images de microscopie d’imagerie de l’intensité de phosphorescence et de la durée de vie de la phosphorescence du capteur de colorant octaéthylporphyrine de platine dans les états oxygéné et désoxygéné sont montrées.Assurez-vous que le bon filtre d’émission est monté à l’intérieur du Cricket et que la bonne LED, les connexions de câble et les paramètres d’impulsion sont utilisés. Actuellement, ce protocole est limité aux modèles animaux, mais peut potentiellement être appliqué pour diagnostiquer et traiter les états pathologiques associés à l’hypoxie tissulaire, tels que le cancer, les accidents vasculaires cérébraux et l’inflammation.

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