Name: fluorescence lifetime macro imager for biomedical applications
Uploaded: 2023-04-07T12:30:00
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アイルランド科学財団からのこの研究への財政的支援、SFI/12/RC/2276_P2、SFI/17/RC-PhD/3484および18/SP/3522、およびBreakthrough Cancer Research(Precision Oncology Ireland)は感謝の意を表します。

動物を使ったすべての手順は、欧州共同体理事会指令(2010/63 / EU)に従って健康製品規制当局(HPRA、アイルランド)によって発行された承認の下で実行され、ユニバーシティカレッジコークの動物実験倫理委員会によって承認されました。
1. サンプル調製
<ol><li>生体外での生体外組織サンプルのプローブによる染色<ol><li>ex vivoアプリケーションの?...

<ol>
	<li>Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+oxygen+and+hypoxia+in+cell+and+tissue+samples.">Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).</li><li>Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+is+the+partial+oxygen+pressure+of+human+tissues+a+crucial+parameter?+Small+molecules+and+hypoxia.">Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 15 (6), 1239-1253 (2011).</li><li>Yoshihara, T., Hirakawa, Y., Hosaka, M., Nangaku, M., Tobita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+imaging+of+living+cells+and+tissues+using+luminescent+molecular+probes.">Oxygen imaging of living cells and tissues using luminescent molecular probes.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews. 30, 71-95 (2017).</li><li>Papkovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescence+based+oxygen+sensors+essential+tools+for+cell+biology+and+life+science+research.">Phosphorescence based oxygen sensors essential tools for cell biology and life science research.</a> 17th International Meeting on Chemical Sensors - IMCS. , 71-72 (2018).</li><li>Tsytsarev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+brain+metabolism+activity+using+a+phosphorescent+oxygen-sensitive+probe.">In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe.</a> Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).</li><li>O'Donovan, C., Hynes, J., Yashunski, D., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescent+oxygen-sensitive+materials+for+biological+applications.">Phosphorescent oxygen-sensitive materials for biological applications.</a> Journal of Materials Chemistry. 15, 2946-2951 (2005).</li><li>Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+probes+and+techniques+for+O+2+measurement+in+live+cells+and+tissue.">Optical probes and techniques for O 2 measurement in live cells and tissue.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (12), 2025-2039 (2012).</li><li>Papkovsky, D. B., Zhdanov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescence+based+oxygen+sensors+and+probes+for+biomedical+research.">Phosphorescence based oxygen sensors and probes for biomedical research.</a> Advanced Environmental, Chemical, and Biological Sensing Technologies XIV. 10215, 102150 (2017).</li><li>Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+phosphorescence:+A+novel+method+for+measuring+oxygen+distribution+in+perfused+tissue.">Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue.</a> Science. 241 (4873), 1649-1651 (1988).</li><li>Hogan, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescence+quenching+method+for+measurement+of+intracellular+PO+2+in+isolated+skeletal+muscle+fibers.">Phosphorescence quenching method for measurement of intracellular PO 2 in isolated skeletal muscle fibers.</a> Journal of Applied Physiology. 86 (2), 720-724 (1999).</li><li>Apreleva, S. V., Wilson, D. F., Vinogradov, S. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescent+sensing+and+imaging+of+oxygen:+Fierce+competition+to+the+Clark+electrode.">Luminescent sensing and imaging of oxygen: Fierce competition to the Clark electrode.</a> BioEssays. 37 (8), 921-928 (2015).</li><li>Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+neurosphere+oxygenation+with+phosphorescent+probes.">Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes.</a> Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).</li><li>Shcheslavskiy, V. I., Neubauer, A., Bukowiecki, R., Dinter, F., Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+fluorescence+and+phosphorescence+lifetime+imaging.">Combined fluorescence and phosphorescence lifetime imaging.</a> Applied Physics Letters. 108, 091111 (2016).</li><li>Babilas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+phosphorescence+imaging+of+pO2+using+planar+oxygen+sensors.">In vivo phosphorescence imaging of pO2 using planar oxygen sensors.</a> Microcirculation. 12 (6), 477-487 (2005).</li><li>Babilas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+pO2+imaging+during+tourniquet-induced+forearm+ischemia+using+planar+optical+oxygen+sensors.">Transcutaneous pO2 imaging during tourniquet-induced forearm ischemia using planar optical oxygen sensors.</a> Skin Research and Technology. 14 (3), 304-311 (2008).</li><li>Golub, A. S., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PO2+measurements+in+the+microcirculation+using+phosphorescence+quenching+microscopy+at+high+magnification.">PO2 measurements in the microcirculation using phosphorescence quenching microscopy at high magnification.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2905-2916 (2008).</li><li>Zhdanov, A. V., Golubeva, A. V., Okkelman, I. A., Cryan, J. F., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+oxygen+gradients+in+giant+umbrella+cells:+An+ex+vivo+PLIM+study.">Imaging of oxygen gradients in giant umbrella cells: An ex vivo PLIM study.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 309 (7), 501-509 (2015).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+-+Techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging - Techniques and applications.</a> Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).</li><li>Jenkins, J., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B., Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cell+and+tissue+O+2+by+TCSPC-PLIM.">Imaging cell and tissue O 2 by TCSPC-PLIM.</a> Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Applications. , 225-247 (2015).</li><li>Becker, W., K&#246;nig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+TCSPC-FLIM+techniques.">Advanced TCSPC-FLIM techniques.</a> Multiphoton Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging: Applications in Biology and Medicine. , 23-52 (2018).</li><li>Wei, L., Yan, W., Ho, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+fluorescence+lifetime+analytical+microsystems:+Contact+optics+and+CMOS+time-resolved+electronics.">Recent advances in fluorescence lifetime analytical microsystems: Contact optics and CMOS time-resolved electronics.</a> Sensors. 17 (12), 2800 (2017).</li><li>Hirvonen, L. M., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wide-field+TCSPC:+Methods+and+applications.">Wide-field TCSPC: Methods and applications.</a> Measurement Science and Technology. 28, 012003 (2017).</li><li>Hirvonen, L. M., Festy, F., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wide-field+time-correlated+single-photon+counting+(TCSPC)+lifetime+microscopy+with+microsecond+time+resolution.">Wide-field time-correlated single-photon counting (TCSPC) lifetime microscopy with microsecond time resolution.</a> Optics Letters. 39 (19), 5602 (2014).</li><li>Sparks, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+new+gated+optical+image+intensifiers+for+fluorescence+lifetime+imaging.">Characterisation of new gated optical image intensifiers for fluorescence lifetime imaging.</a> Review of Scientific Instruments. 88 (1), 013707 (2017).</li><li>Chelushkin, P. S., Tunik, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Progress in Photon Science: Emerging New Directions. 115, (2017).</li><li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+macro-imager+based+on+Tpx3Cam+optical+camera+for+PLIM+applications.">A new macro-imager based on Tpx3Cam optical camera for PLIM applications.</a> Proceedings of SPIE. , 113591 (2020).</li><li>Fisher-Levine, M., Nomerotski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TimepixCam:+A+fast+optical+imager+with+time-stamping.">TimepixCam: A fast optical imager with time-stamping.</a> Journal of Instrumentation. 11, (2016).</li><li>Nomerotski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+time+stamping+of+photons+with+nanosecond+resolution+in+Timepix+based+optical+cameras.">Imaging and time stamping of photons with nanosecond resolution in Timepix based optical cameras.</a> Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 937. 937, 26-30 (2019).</li><li>Poikela, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timepix3:+A+65K+channel+hybrid+pixel+readout+chip+with+simultaneous+ToA/ToT+and+sparse+readout.">Timepix3: A 65K channel hybrid pixel readout chip with simultaneous ToA/ToT and sparse readout.</a> Journal of Instrumentation. 9, 05013 (2014).</li><li>Nomerotski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+TimepixCam,+a+fast+imager+for+the+time-stamping+of+optical+photons.">Characterization of TimepixCam, a fast imager for the time-stamping of optical photons.</a> Journal of Instrumentation. 12, 01017 (2017).</li><li>Hirvonen, L. M., Fisher-Levine, M., Suhling, K., Nomerotski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photon+counting+phosphorescence+lifetime+imaging+with+TimepixCam.">Photon counting phosphorescence lifetime imaging with TimepixCam.</a> Review of Scientific Instruments. 88, 013104 (2017).</li><li>Visser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDR:+A+read-out+system+for+Medipix3+&amp;+Timepix3.">SPIDR: A read-out system for Medipix3 &amp; Timepix3.</a> Journal of Instrumentation. 10, 12028 (2015).</li><li>Tsytsarev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+brain+metabolism+activity+using+a+phosphorescent+oxygen-sensitive+probe.">In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe.</a> Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).</li><li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+O2+concentration+in+ex-vivo+tissue+samples+on+a+fast+PLIM+macro-imager.">Mapping O2 concentration in ex-vivo tissue samples on a fast PLIM macro-imager.</a> Scientific Reports. 10, 19006 (2020).</li><li>Kersemans, V., Cornelissen, B., Allen, P. D., Beech, J. S., Smart, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+tumor+volume+measurement+in+the+awake,+manually+restrained+mouse+using+MRI.">Subcutaneous tumor volume measurement in the awake, manually restrained mouse using MRI.</a> Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (6), 1499-1504 (2013).</li><li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+luminescence+lifetime+macro-imager+based+on+a+Tpx3Cam+optical+camera.">New luminescence lifetime macro-imager based on a Tpx3Cam optical camera.</a> Biomedical Optics Express. 11 (1), 77-88 (2020).</li><li>Papkovsky, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescent+polymer+films+for+optical+oxygen+sensors.">Phosphorescent polymer films for optical oxygen sensors.</a> Biosensors and Bioelectronics. 7 (3), 199-206 (1992).</li><li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+planar+phosphorescence+based+oxygen+sensors+on+a+TCSPC-PLIM+macro-imager.">Characterization of planar phosphorescence based oxygen sensors on a TCSPC-PLIM macro-imager.</a> Sensors and Actuators, B: Chemical. 321, 128459 (2020).</li><li>Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Berndt, K. W., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging.">Fluorescence lifetime imaging.</a> Analytical Biochemistry. 202 (2), 316-330 (1992).</li></ol>

上記のプロトコルは、新しいイメージャのアセンブリとマイクロ秒FLIM/PLIMモードでの動作の詳細な説明を提供します。TCSPCベースの新世代Tpx3Camカメラは、イメージインテンシファイア、発光フィルター、マクロレンズを備えたオプトメカニカルアダプターCricketによって組み合わされ、操作が容易な安定したコンパクトで柔軟な光学モジュールを生成します。イメージャーは、燐光発光材料の...

O 2は生命システムにとって重要な環境パラメータの1つであり、O 2の分布とそのダイナミクスに関する知識は多くの生物学的研究にとって重要です1,2,3。リン光プローブ4,5,6,7,8およびPLIM9,10,11,12,13による組織酸素化の評価は、生物学的および医学的研究3,9,14,15,16において人気を集めている。 17、18、19。これは、PLIMが蛍光や燐光強度の測定とは異なり、プローブ濃度、光退色、励起強度、光学アライメント、散乱、自家蛍光などの外的要因の影響を受けないためです。
しかしながら、現在のO2 PLIMプラットフォームは、それらの感度、画像取得速度、精度、および一般的なユーザビリティによって制限される。ラスタースキャン手順と組み合わせた時間相関単一光子計数(TCSPC)は、PLIMおよび蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)デバイス20、21、22で頻繁に使用されます。しかしながら、PLIMは長いピクセル滞留時間(ミリ秒の範囲)を必要とするので、画像取得の時間は、FLIMアプリケーション20、22、23に必要とされる時間よりもはるかに長い。ゲート付きCCD / CMOSカメラなどの他の技術は、単一光子感度に欠け、フレームレートが低い20,24,25,26です。さらに、既存のPLIMシステムは主に微視的フォーマットで使用されていますが、巨視的システムはあまり一般的ではありません27。
TCSPCベースのPLIMマクロイメージャ28 は、これらの制限の多くを克服するためにセットアップされた。イメージャーの設計は、次の新しいオプトメカニカルアダプターCricketを使用することで大幅に容易になりました:i)背面のカメラモジュールと前面の対物レンズを簡単に結合できる2つのCマウントアダプター。ii)イメージインテンシファイア用の内部ハウジングと、クリケットの外側にある後者用の電源ソケット。iii)前面Cマウントアダプターの後ろの内部スペースで、標準の25mmエミッションフィルターをインテンシファイアの前に収納できます。iv)リングレギュレーターを備えた内蔵の光コリメート光学系により、レンズとカメラ間の光学的位置合わせ/焦点合わせが可能になり、カメラチップ上に鮮明な画像が生成されます。
組み立てられたイメージャーでは、カメラモジュールはクリケットアダプターの裏側に結合され、光電陰極とそれに続くマイクロチャネルプレート(MCP)、増幅器、および高速シンチレーターであるP47蛍光体で構成されるイメージインテンシファイアも収容されています。クリケットの内部には760nm±50nmの発光フィルターが取り付けられ、前面のCマウントアダプターには対物レンズNMV-50M11''が取り付けられています。最後に、レンズとカメラはリングレギュレーターと光学的に位置合わせされます。
インテンシファイアの役割は、入射する光子を検出し、それらをカメラチップ上で高速の光バーストに変換することであり、それらは登録され、発光減衰と生涯画像を生成するために使用されます。カメラモジュールは、高度なTCSPCベースの光学センサーアレイ(256ピクセルx 256ピクセル)と新世代の読み出しチップ29,30,31,32,33で構成されており、1.6nsの時間分解能と80Mpixel/sの読み出し速度で、イメージングチップの各ピクセルでのフォトンバーストの到着時間(TOA)と時間超過しきい値(TOT)の同時記録を可能にします。
この構成では、インテンシファイアを備えたカメラは単一光子感度を有する。これは、データ駆動型であり、高速ピクセル検出器読み出し(SPIDR)システム34に基づいている。イメージャの空間分解能は、平面燐光O2 センサおよび分解能プレートマスクを用いて予め特徴付けられた。機器の応答関数(IRF)は、他のすべての測定に使用したのと同じ設定で平面蛍光センサーのイメージングによって測定されました。約2.6nsの色素の寿命は、PLIMモードでのIRF測定に使用するのに十分短かった。イメージャは、最大18 mm x 18 mmのサイズのオブジェクトを、それぞれ39.4 μmおよび30.6 ns(半値で全幅)の空間分解能と時間分解能でイメージングできます28。
以下のプロトコルは、マクロイメージャの組み立て、および以前に特徴付けられた近赤外O2プローブ、NanO2−IR35で染色された生物学的試料中のO2濃度をマッピングするためのその後の使用について記載している。このプローブは、白金(II)ベンゾポルフィリン(PtBP)色素をベースにした、明るく光安定性のある細胞透過性のO2センシングプローブです。それは625nmで励起性であり、760nmで放出し、生理学的範囲(0%〜21%または0〜210μMのO2)のO2に対して堅牢な光学応答を提供する。イメージャーは、Pt(II)-ポルフィリン色素に基づくさまざまなセンサー材料の特性評価も実証されています。全体として、イメージャーはコンパクトで柔軟性があり、一般的な写真カメラに似ています。現在のセットアップでは、イメージャはさまざまな広視野PLIMアプリケーションに適しています。LEDを高速レーザー光源に置き換えると、イメージャの性能がさらに向上し、ナノ秒のFLIMアプリケーションが可能になる可能性があります。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>627 nm LED</td>
			<td>Parts Express</td>
			<td></td>
			<td>Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>760 &#177; 50 nm emission filter</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>84-788</td>
			<td>Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 &#177; 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balb/c mice</td>
			<td>Envigo, UK</td>
			<td>Balb/c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black box</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25C9/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cricket Adapter</td>
			<td>Photonis</td>
			<td>Cricket-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CT26 cells&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CT26.WT</td>
			<td>https://www.atcc.org/products/crl-2638</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0697</td>
			<td>Other media can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen</td>
			<td>Photonis</td>
			<td>PP0360EF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900.300</td>
			<td>35 mm diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar plastic film, 75 micron&#160;</td>
			<td>RS Ireland</td>
			<td>785-0795</td>
			<td>Othe plastic substrates can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanO2-IR</td>
			<td>home-made</td>
			<td>n/a</td>
			<td>The probe can be synthesised according to the published method &#39;Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.&#39; or provided by our lab.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMV-50M11&#8221; 50 mm lens</td>
			<td>Navitar</td>
			<td></td>
			<td>Other lenses compatibel with C-mount adators can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB1836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1472.001</td>
			<td>92 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Supply</td>
			<td>Tenma</td>
			<td>72-10495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse Generator</td>
			<td>Tenma</td>
			<td>TGP110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sophy</td>
			<td>Amsterdam Scientific Instruments</td>
			<td>n/z</td>
			<td>Provided by ASI together with the Tpx3Cam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tpx3Cam</td>
			<td>Amsterdam Scientific Instruments</td>
			<td>TPXCAM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri2 Software</td>
			<td>University of Oxford</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ Translation Stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LT3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence lifetime macro imager for biomedical applications

この論文では、固体のO 2感受性コーティングから可溶性O2感受性プローブで染色された生きた動物組織サンプルまで、さまざまなリン光サンプル中の分子状酸素(O2)濃度をマッピングするように設計された新しいフォトルミネッセンスライフタイムイメージャーを紹介します。特に、625nmの発光ダイオード(LED)で励起可能で760nmで発光するナノ粒子ベースの近赤外プローブNanO2-IRを用いた。イメージングシステムは、Timepix3カメラ(Tpx3Cam)と、イメージインテンシファイアも収容するオプトメカニカルアダプターに基づいています。O2リン光寿命イメージング顕微鏡(PLIM)は、様々な研究に一般的に必要とされるが、現在のプラットフォームは、その精度、一般的な柔軟性、およびユーザビリティにおいて限界を有する。
ここで紹介するシステムは、統合された光学センサーと読み出しチップモジュールであるTpx3Cam上に構築された、高速で高感度のイメージャーです。表面染色された腸組織サンプルまたは大腸の管腔内染色断片から高強度のリン光シグナルおよび安定した寿命値を生成することが示され、約20秒以下で組織O2 レベルの詳細なマッピングを可能にする。無意識の動物の移植腫瘍における低酸素症のイメージングに関する最初の実験も提示されています。また、励起用の390 nm LEDと発光用のバンドパス650 nmフィルターを使用して、Pt-ポルフィリン色素に基づくO2感応材料で使用するためにイメージャを再構成する方法についても説明します。全体として、PLIMイメージャは、使用されたプローブの寿命値およびO2 濃度のそれぞれの2次元マップの正確な定量的測定値を生成することが見出された。また、 ex vivo 組織モデルや生きた動物の代謝イメージングにも有用です。

ex vivoイメージングアプリケーションの場合、腸組織の断片は、組織の漿膜側にNanO2-IRプローブの局所適用によって染色されました。より深い染色のために、1μLのプローブを内腔に注入した。後者の場合、厚さ0.2〜0.25 mmの腸壁がプローブをカメラから遮蔽しました。2つの染色プロセスを図2Aに示します。
得られた強度とPLIM画像を<strong class="xf...

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Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications

この論文では、長い崩壊発光サンプルの巨視的なフォトルミネッセンスライフタイムイメージングのための新しい高速光学イメージャーの使用について説明します。統合、画像取得、および分析手順、およびイメージング用のセンサー材料の準備と特性評価、および生物学的サンプルの研究におけるイメージャーの適用について説明します。

生物医学アプリケーション向けの蛍光寿命マクロイメージャ

This paper presents a new photoluminescence lifetime imager designed to map the molecular oxygen (O2) concentration in different phosphorescent samples ...

当社のプロトコルは、専用のプローブとセンシング材料を使用して、巨視的な物体、特に生きている動物の組織と動物全体のリン光寿命と酸素濃度の詳細な2Dマッピングを提供します。この情報は、多くの研究分野にとって重要です。当社のプロトコルは、TCSPCモードで動作する統合されたコンパクトなイメージングモジュールを使用し、生命組織などの複雑な生物学的サンプルの寿命と酸素分布を簡単かつ正確に視覚化します。クリケットアダプターを取り、さまざまな側面から検査します。前面のCマウントアダプターを取り外して、クリケットに収納されているPhotonis PP0360EFインテンシファイアを表示してから、Cマウントアダプターを元に戻します。Cricketの前面Cマウントアダプターを取り外し、650プラスマイナス50ナノメートルの発光フィルターを挿入します。Cマウントを元に戻して修正します。次に、TPX 3カムカメラモジュールをリングアダプターを介してクリケットモジュールの背面に接続します。Cマウントアダプターを介してレンズをクリケットモジュールの前面に接続します。LEDを電源とパルス発生器に接続します。次に、390ナノメートルの超高輝度LEDをブラックボックス内のブレッドボードに取り付けられたポストに取り付けます。LEDをオンにして焦点を合わせ、イメージングするサンプルの効果的かつ均一な励起を確保します。カメラアセンブリを、サンプルが画像化されるステージに向かって下を向いている光学ブラックボックスの上に取り付けます。カメラとLEDを2パルス発生器と4チャンネルオシロスコープに接続します。オシロスコープとパルス発生器の設定を使用して、カメラとLEDに送信されるパルスを同期させます。クリケットユニットの特別なケーブルとソケットを使用して、インテンシファイアを標準電源に接続し、ゲインを2.7ボルトに設定します。サンプルをカメラレンズの前に配置します。次に、カメラとインテンシファイアを除くすべての電気モジュールの電源を入れます。SOFIソフトウェアをアクティブにして、フォーカシングやサンプルアライメントなどの操作パラメータを調整します。モジュールで、フレーム露出を 0.01 秒に設定します。[無限フレーム] を選択し、ピクセル操作モードを [しきい値を超える時間] に設定します。次に、[プレビュー]に移動し、[アクティブ]モジュールを選択して、[Medipix / Timepixフレーム]ウィンドウを開きます。次のステップでは、記録を開始した後、カラースケールを調整し、画像を目的の方向に回転させます。その後、部屋の照明を消し、インテンシファイアをオンにします。レンズとクリケットアダプターのフォーカシング機能を使用して、カメラの光学系をサンプルステージに焦点を合わせ、コントラストと明るさの良いサンプルの鮮明な画像を生成します。フォーカスが完了したら、SOFIソフトウェアを閉じます。次に、ターミナルに移動し、カスタム設計ソフトウェアのコマンドを実行して、バイナリ形式の生データを取得し、ターミナルを閉じます。集録したデータを処理するために新しいターミナルを開きます。データファイルをロードし、データレデューサーを実行します。C言語で記述された専用プログラムで後処理データを解析し、ICS画像ファイルに書き込みます。その後、自由に利用できる時間分解イメージングソフトウェアを使用してICS画像ファイルを開き、2つの指数関数を使用して燐光減衰に適合させます。最後に、フィットを開きます。利用可能な画像解析ソフトウェアを含むICS画像ファイル。ルックアップテーブルを使用して燐光寿命画像を生成し、それらを擬似カラースケールでコーディングします。Measure関数を使用して、画像全体または関心領域の平均寿命値を計算します。酸素化および脱酸素状態における白金オクタエチルポルフィリン色素センサースポットの燐光強度および燐光寿命イメージング顕微鏡画像が示されている。適切な発光フィルターがクリケットの内側に取り付けられ、適切なLED、ケーブル接続、およびパルス設定が使用されていることを確認してください。現在、このプロトコルは動物モデルに限定されていますが、癌、脳卒中、炎症などの組織低酸素症に関連する病態の診断と治療に適用できる可能性があります。

Research

JoVE Journal

Biology

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