Name: fluorescence lifetime macro imager for biomedical applications
Uploaded: 2023-04-07T12:30:00
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Science Foundation Ireland, 보조금 SFI/12/RC/2276_P2, SFI/17/RC-PhD/3484 및 18/SP/3522, Breakthrough Cancer Research(Precision Oncology Ireland)의 이 작업에 대한 재정 지원에 감사드립니다.

동물을 이용한 모든 절차는 유럽 공동체 위원회 지침(2010/63/EU)에 따라 건강 제품 규제 당국(HPRA, 아일랜드)에서 발행한 승인에 따라 수행되었으며 University College Cork의 동물 실험 윤리 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 시료 전처리
<ol><li>생체 외에서 살아있는 조직 샘플의 프로브로 염색<ol><li>생체 외 적용의 경우 4주령 암컷 Balb/c 마우스에서 갓 분리?...

<ol>
	<li>Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+oxygen+and+hypoxia+in+cell+and+tissue+samples.">Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).</li><li>Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+is+the+partial+oxygen+pressure+of+human+tissues+a+crucial+parameter?+Small+molecules+and+hypoxia.">Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 15 (6), 1239-1253 (2011).</li><li>Yoshihara, T., Hirakawa, Y., Hosaka, M., Nangaku, M., Tobita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+imaging+of+living+cells+and+tissues+using+luminescent+molecular+probes.">Oxygen imaging of living cells and tissues using luminescent molecular probes.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews. 30, 71-95 (2017).</li><li>Papkovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescence+based+oxygen+sensors+essential+tools+for+cell+biology+and+life+science+research.">Phosphorescence based oxygen sensors essential tools for cell biology and life science research.</a> 17th International Meeting on Chemical Sensors - IMCS. , 71-72 (2018).</li><li>Tsytsarev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+brain+metabolism+activity+using+a+phosphorescent+oxygen-sensitive+probe.">In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe.</a> Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).</li><li>O'Donovan, C., Hynes, J., Yashunski, D., Papkovsky, D. 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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescence+based+oxygen+sensors+and+probes+for+biomedical+research.">Phosphorescence based oxygen sensors and probes for biomedical research.</a> Advanced Environmental, Chemical, and Biological Sensing Technologies XIV. 10215, 102150 (2017).</li><li>Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+phosphorescence:+A+novel+method+for+measuring+oxygen+distribution+in+perfused+tissue.">Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue.</a> Science. 241 (4873), 1649-1651 (1988).</li><li>Hogan, M. 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I., Neubauer, A., Bukowiecki, R., Dinter, F., Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+fluorescence+and+phosphorescence+lifetime+imaging.">Combined fluorescence and phosphorescence lifetime imaging.</a> Applied Physics Letters. 108, 091111 (2016).</li><li>Babilas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+phosphorescence+imaging+of+pO2+using+planar+oxygen+sensors.">In vivo phosphorescence imaging of pO2 using planar oxygen sensors.</a> Microcirculation. 12 (6), 477-487 (2005).</li><li>Babilas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+pO2+imaging+during+tourniquet-induced+forearm+ischemia+using+planar+optical+oxygen+sensors.">Transcutaneous pO2 imaging during tourniquet-induced forearm ischemia using planar optical oxygen sensors.</a> Skin Research and Technology. 14 (3), 304-311 (2008).</li><li>Golub, A. S., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PO2+measurements+in+the+microcirculation+using+phosphorescence+quenching+microscopy+at+high+magnification.">PO2 measurements in the microcirculation using phosphorescence quenching microscopy at high magnification.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2905-2916 (2008).</li><li>Zhdanov, A. V., Golubeva, A. V., Okkelman, I. A., Cryan, J. F., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+oxygen+gradients+in+giant+umbrella+cells:+An+ex+vivo+PLIM+study.">Imaging of oxygen gradients in giant umbrella cells: An ex vivo PLIM study.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 309 (7), 501-509 (2015).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+-+Techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging - Techniques and applications.</a> Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).</li><li>Jenkins, J., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B., Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cell+and+tissue+O+2+by+TCSPC-PLIM.">Imaging cell and tissue O 2 by TCSPC-PLIM.</a> Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Applications. , 225-247 (2015).</li><li>Becker, W., K&#246;nig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+TCSPC-FLIM+techniques.">Advanced TCSPC-FLIM techniques.</a> Multiphoton Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging: Applications in Biology and Medicine. , 23-52 (2018).</li><li>Wei, L., Yan, W., Ho, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+fluorescence+lifetime+analytical+microsystems:+Contact+optics+and+CMOS+time-resolved+electronics.">Recent advances in fluorescence lifetime analytical microsystems: Contact optics and CMOS time-resolved electronics.</a> Sensors. 17 (12), 2800 (2017).</li><li>Hirvonen, L. M., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wide-field+TCSPC:+Methods+and+applications.">Wide-field TCSPC: Methods and applications.</a> Measurement Science and Technology. 28, 012003 (2017).</li><li>Hirvonen, L. M., Festy, F., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wide-field+time-correlated+single-photon+counting+(TCSPC)+lifetime+microscopy+with+microsecond+time+resolution.">Wide-field time-correlated single-photon counting (TCSPC) lifetime microscopy with microsecond time resolution.</a> Optics Letters. 39 (19), 5602 (2014).</li><li>Sparks, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+new+gated+optical+image+intensifiers+for+fluorescence+lifetime+imaging.">Characterisation of new gated optical image intensifiers for fluorescence lifetime imaging.</a> Review of Scientific Instruments. 88 (1), 013707 (2017).</li><li>Chelushkin, P. S., Tunik, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Progress in Photon Science: Emerging New Directions. 115, (2017).</li><li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+macro-imager+based+on+Tpx3Cam+optical+camera+for+PLIM+applications.">A new macro-imager based on Tpx3Cam optical camera for PLIM applications.</a> Proceedings of SPIE. , 113591 (2020).</li><li>Fisher-Levine, M., Nomerotski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TimepixCam:+A+fast+optical+imager+with+time-stamping.">TimepixCam: A fast optical imager with time-stamping.</a> Journal of Instrumentation. 11, (2016).</li><li>Nomerotski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+time+stamping+of+photons+with+nanosecond+resolution+in+Timepix+based+optical+cameras.">Imaging and time stamping of photons with nanosecond resolution in Timepix based optical cameras.</a> Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 937. 937, 26-30 (2019).</li><li>Poikela, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timepix3:+A+65K+channel+hybrid+pixel+readout+chip+with+simultaneous+ToA/ToT+and+sparse+readout.">Timepix3: A 65K channel hybrid pixel readout chip with simultaneous ToA/ToT and sparse readout.</a> Journal of Instrumentation. 9, 05013 (2014).</li><li>Nomerotski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+TimepixCam,+a+fast+imager+for+the+time-stamping+of+optical+photons.">Characterization of TimepixCam, a fast imager for the time-stamping of optical photons.</a> Journal of Instrumentation. 12, 01017 (2017).</li><li>Hirvonen, L. M., Fisher-Levine, M., Suhling, K., Nomerotski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photon+counting+phosphorescence+lifetime+imaging+with+TimepixCam.">Photon counting phosphorescence lifetime imaging with TimepixCam.</a> Review of Scientific Instruments. 88, 013104 (2017).</li><li>Visser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDR:+A+read-out+system+for+Medipix3+&amp;+Timepix3.">SPIDR: A read-out system for Medipix3 &amp; Timepix3.</a> Journal of Instrumentation. 10, 12028 (2015).</li><li>Tsytsarev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+brain+metabolism+activity+using+a+phosphorescent+oxygen-sensitive+probe.">In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe.</a> Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).</li><li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+O2+concentration+in+ex-vivo+tissue+samples+on+a+fast+PLIM+macro-imager.">Mapping O2 concentration in ex-vivo tissue samples on a fast PLIM macro-imager.</a> Scientific Reports. 10, 19006 (2020).</li><li>Kersemans, V., Cornelissen, B., Allen, P. D., Beech, J. S., Smart, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+tumor+volume+measurement+in+the+awake,+manually+restrained+mouse+using+MRI.">Subcutaneous tumor volume measurement in the awake, manually restrained mouse using MRI.</a> Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (6), 1499-1504 (2013).</li><li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+luminescence+lifetime+macro-imager+based+on+a+Tpx3Cam+optical+camera.">New luminescence lifetime macro-imager based on a Tpx3Cam optical camera.</a> Biomedical Optics Express. 11 (1), 77-88 (2020).</li><li>Papkovsky, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescent+polymer+films+for+optical+oxygen+sensors.">Phosphorescent polymer films for optical oxygen sensors.</a> Biosensors and Bioelectronics. 7 (3), 199-206 (1992).</li><li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+planar+phosphorescence+based+oxygen+sensors+on+a+TCSPC-PLIM+macro-imager.">Characterization of planar phosphorescence based oxygen sensors on a TCSPC-PLIM macro-imager.</a> Sensors and Actuators, B: Chemical. 321, 128459 (2020).</li><li>Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Berndt, K. W., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging.">Fluorescence lifetime imaging.</a> Analytical Biochemistry. 202 (2), 316-330 (1992).</li></ol>

위의 프로토콜은 새 이미저의 조립 및 마이크로초 FLIM/PLIM 모드에서의 작동에 대한 자세한 설명을 제공합니다. TCSPC 기반의 차세대 Tpx3Cam 카메라는 광기계식 어댑터 Cricket과 이미지 강화 장치, 방출 필터 및 매크로 렌즈를 통해 결합되어 작동하기 쉬운 안정적이고 컴팩트하며 유연한 광학 모듈을 생성합니다. 이미저는 인광 물질의 특성화 및 살아있는 조직 O2 이미징을 포함하는 다양한 샘?...

O 2 는 생명체에 대한 주요 환경 매개 변수 중 하나이며, O 2 의 분포와 그 역학에 대한 지식은 많은 생물학적 연구 1,2,3에서 중요합니다. 인광 프로브 4,5,6,7,8 및 PLIM 9,10,11,12,13에 의한 조직 산소화 평가는 생물학 및 의학 연구 3,9,14,15,16에서 인기를 얻고 있습니다. 17,18,19. 이는 PLIM이 형광 또는 인광 강도 측정과 달리 프로브 농도, 광표백, 여기 강도, 광학 정렬, 산란 및 자가형광과 같은 외부 요인의 영향을 받지 않기 때문입니다.
그러나 현재O2 PLIM 플랫폼은 감도, 이미지 획득 속도, 정확도 및 일반적인 사용성에 의해 제한됩니다. 래스터 스캐닝 절차와 결합된 시간 상관 단일 광자 계수(TCSPC)는 PLIM 및 형광 수명 이미징 현미경(FLIM) 장치(20,21,22)에서 자주 사용됩니다. 그러나, PLIM은 긴 픽셀 체류 시간(밀리초 범위에서)을 요구하기 때문에, 이미지 획득 시간은 FLIM 애플리케이션(20,22,23)에 요구되는 것보다 훨씬 더 긴다. 게이트 CCD/CMOS 카메라와 같은 다른 기술은 단일 광자 감도가 부족하고 낮은 프레임 속도(20,24,25,26)를 갖습니다. 또한, 기존의 PLIM 시스템은 대부분 현미경 형식으로 사용되는 반면, 거시적 시스템은 덜 일반적이다27.
TCSPC에 기초한 PLIM 매크로 이미저(28 )는 이러한 많은 한계들을 극복하기 위해 설정되었다. 이미 저의 설계는 다음과 같은 새로운 광기계식 어댑터 인 Cricket을 사용하여 크게 촉진되었습니다 : i) 후면의 카메라 모듈과 전면의 대물 렌즈를 쉽게 결합 할 수있는 2 개의 C- 마운트 어댑터; ii) 이미지 강화 장치용 내부 하우징 및 크리켓 바깥쪽에 있는 후자용 전원 소켓; iii) 표준 25mm 방출 필터를 증압기 앞에 수용할 수 있는 전면 C-마운트 어댑터 뒤의 내부 공간; 및 iv) 렌즈와 카메라 사이의 광학 정렬/초점을 허용하여 카메라 칩 상에 선명한 이미지를 생성할 수 있도록 하는 링 레귤레이터가 있는 내장형 광 시준 광학 장치.
조립된 이미저에서 카메라 모듈은 Cricket 어댑터의 뒷면에 연결되며, 여기에는 광음극, 마이크로 채널 플레이트(MCP), 증폭기 및 고속 신틸레이터인 P47 형광체로 구성된 이미지 강화 장치도 있습니다. 크리켓 내부에는 760nm ± 50nm 방출 필터가 장착되어 있으며 대물 렌즈인 NMV-50M11''이 전면 C-마운트 어댑터에 부착되어 있습니다. 마지막으로 렌즈와 카메라는 링 레귤레이터와 광학적으로 정렬됩니다.
증광기의 역할은 들어오는 광자를 감지하여 카메라 칩에서 빠른 빛의 폭발로 변환하여 등록하고 방출 감쇠 및 수명 이미지를 생성하는 데 사용하는 것입니다. 카메라 모듈은 고급 TCSPC 기반 광학 센서 어레이(256픽셀 x 256픽셀)와 차세대 판독 칩 29,30,31,32,33으로 구성되어 1.6ns의 시간 분해능과 80Mpixel/s 판독 속도로 이미징 칩의 각 픽셀에서 광자 버스트의 도착 시간(TOA) 및 임계값 초과 시간(TOT)을 동시에 기록할 수 있습니다.
이 구성에서 증압기가 있는 카메라는 단일 광자 감도를 갖습니다. 이는 데이터 구동형이며, 스피드 픽셀 검출기 판독(SPIDR) 시스템(34)에 기초한다. 이미 저의 공간 해상도는 이전에 평면 인광 O2 센서와 해상도 플레이트 마스크로 특성화되었습니다. 기기 응답 기능(IRF)은 다른 모든 측정에 사용된 것과 동일한 설정에서 평면 형광 센서의 이미징으로 측정되었습니다. 약 2.6ns의 염료 수명은 PLIM 모드에서 IRF 측정에 사용하기에 충분히 짧았습니다. 이미저는 각각 39.4μm 및 30.6ns(절반 최대에서 전체 너비)의 공간 및 시간 해상도로 최대 18mm x 18mm 크기의 물체를 이미지화할 수 있습니다(28).
다음 프로토콜은 이전에 특성화된 근적외선O2 프로브인 NanO2-IR35로 염색된 생물학적 샘플에서O2 농도를 매핑하기 위한 매크로 이미저의 조립 및 후속 사용을 설명합니다. 프로브는 백금(II) 벤조포르피린(PtBP) 염료를 기반으로 하는 밝고 광안정성이 있는 세포 투과성 O2 감지 프로브입니다. 625 nm에서 여기성이고, 760 nm에서 방출하며, 생리학적 범위(0%-21% 또는 0-210 μM의 O2)에서O2에 대한 강력한 광학 반응을 제공합니다. 이미저는 또한 Pt(II)-포르피린 염료를 기반으로 다양한 센서 재료를 특성화하는 것으로 입증되었습니다. 전반적으로 이미저는 일반적인 사진 카메라와 유사하게 작고 유연합니다. 현재 설정에서 이미저는 다양한 광시야 PLIM 애플리케이션에 적합합니다. LED를 빠른 레이저 소스로 대체하면 이미저의 성능이 더욱 향상되고 잠재적으로 나노초 FLIM 애플리케이션을 가능하게 할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>627 nm LED</td>
			<td>Parts Express</td>
			<td></td>
			<td>Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>760 &#177; 50 nm emission filter</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>84-788</td>
			<td>Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 &#177; 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balb/c mice</td>
			<td>Envigo, UK</td>
			<td>Balb/c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black box</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25C9/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cricket Adapter</td>
			<td>Photonis</td>
			<td>Cricket-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CT26 cells&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CT26.WT</td>
			<td>https://www.atcc.org/products/crl-2638</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0697</td>
			<td>Other media can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen</td>
			<td>Photonis</td>
			<td>PP0360EF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900.300</td>
			<td>35 mm diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar plastic film, 75 micron&#160;</td>
			<td>RS Ireland</td>
			<td>785-0795</td>
			<td>Othe plastic substrates can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanO2-IR</td>
			<td>home-made</td>
			<td>n/a</td>
			<td>The probe can be synthesised according to the published method &#39;Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.&#39; or provided by our lab.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMV-50M11&#8221; 50 mm lens</td>
			<td>Navitar</td>
			<td></td>
			<td>Other lenses compatibel with C-mount adators can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB1836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1472.001</td>
			<td>92 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Supply</td>
			<td>Tenma</td>
			<td>72-10495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse Generator</td>
			<td>Tenma</td>
			<td>TGP110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sophy</td>
			<td>Amsterdam Scientific Instruments</td>
			<td>n/z</td>
			<td>Provided by ASI together with the Tpx3Cam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tpx3Cam</td>
			<td>Amsterdam Scientific Instruments</td>
			<td>TPXCAM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri2 Software</td>
			<td>University of Oxford</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ Translation Stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LT3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence lifetime macro imager for biomedical applications

이 논문은 고체 상태의O2 민감성 코팅에서 용해성O2 민감성 프로브로 염색된 살아있는 동물 조직 샘플에 이르기까지 다양한 인광 샘플에서 분자 산소(O 2) 농도를 매핑하도록 설계된 새로운 광발광 수명 이미저를 제시합니다. 특히, 625nm 발광다이오드(LED)로 여기성이 있고 760nm에서 방출되는 나노입자 기반 근적외선 프로브 NanO2-IR을 사용하였다. 이미징 시스템은 Timepix3 카메라(Tpx3Cam)와 이미지 강화 장치도 있는 광학 기계식 어댑터를 기반으로 합니다. O2 인광 수명 이미징 현미경(PLIM)은 일반적으로 다양한 연구에 필요하지만 현재 플랫폼은 정확도, 일반적인 유연성 및 유용성에 한계가 있습니다.
여기에 제시된 시스템은 통합 광학 센서 및 판독 칩 모듈인 Tpx3Cam을 기반으로 하는 빠르고 고감도 이미저입니다. 표면 염색된 장 조직 샘플 또는 대장의 내강내 염색된 단편으로부터 고강도 인광 신호 및 안정적인 수명 값을 생성하는 것으로 나타났으며 약 20초 이내에 조직O2 수준의 상세한 매핑을 허용합니다. 무의식 동물에서 이식 된 종양에서 저산소증의 영상화에 대한 초기 실험도 제시된다. 또한 여기를 위한 390nm LED와 방출을 위한 대역통과 650nm 필터를 사용하여 Pt-포르피린 염료를 기반으로 하는 O2 민감성 물질과 함께 사용하도록 이미저를 재구성하는 방법에 대해서도 설명합니다. 전반적으로, PLIM 이미저는 사용된 프로브에 대한 수명 값의 정확한 정량적 측정과O2 농도의 각각의 2차원 맵을 생성하는 것으로 밝혀졌습니다. 또한 생체 외 조직 모델 및 살아있는 동물의 대사 이미징에도 유용합니다.

생체 외 이미징 적용의 경우, 장 조직의 단편은 조직의 장액 쪽에 NanO2-IR 프로브의 국소 적용에 의해 염색되었습니다. 더 깊은 염색을 위해 1μL의 프로브를 내강에 주입했습니다. 후자의 경우, 0.2-0.25mm 두께의 장벽이 프로브를 카메라로부터 보호했습니다. 두 가지 염색 공정이 도 2A에 예시되어 있다.
결과 강도 및 PLIM 이미지는 그림 ...

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Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications

이 논문은 긴 붕괴 방출 샘플의 거시적 광발광 수명 이미징을 위한 새롭고 빠른 광학 이미저의 사용에 대해 설명합니다. 통합, 이미지 획득 및 분석 절차는 이미징을 위한 센서 재료의 준비 및 특성화와 생물학적 샘플 연구에서 이미저의 적용과 함께 설명됩니다.

생물 의학 응용 분야를 위한 Fluorescence Lifetime Macro Imager

This paper presents a new photoluminescence lifetime imager designed to map the molecular oxygen (O2) concentration in different phosphorescent samples ...

당사의 프로토콜은 전용 프로브 및 감지 재료를 통해 거시적 물체, 특히 살아있는 동물 조직 및 전체 동물의 인광 수명과 산소 농도에 대한 상세한 2D 매핑을 제공합니다. 이 정보는 많은 연구 분야에서 중요합니다. 당사의 프로토콜은 TCSPC 모드에서 작동하는 통합 및 소형 이미징 모듈을 사용하며 생명 조직과 같은 복잡한 생물학적 샘플의 수명 및 산소 분포를 쉽고 정확하게 시각화합니다.크리켓 어댑터를 가지고 다른 쪽에서 검사하십시오. Cricket에 들어 있는 Photonis PP0360EF 증압기를 표시하기 위해 전면의 C-마운트 어댑터를 제거한 다음 C-마운트 어댑터를 다시 끼웁니다. 크리켓의 전면 C-마운트 어댑터를 제거하고 650 플러스/마이너스 50나노미터 방출 필터를 삽입합니다.C-마운트를 다시 넣어 고정하십시오. 그런 다음 TPX 3캠 카메라 모듈을 링 어댑터를 통해 크리켓 모듈 뒷면에 연결합니다. C-마운트 어댑터를 통해 크리켓 모듈의 전면에 렌즈를 연결합니다.LED를 전원 공급 장치 및 펄스 발생기에 연결합니다. 이제 390나노미터의 고휘도 LED를 블랙박스 내부의 브레드보드에 부착된 포스트에 장착합니다. LED를 켜고 초점을 맞춰 이미징 중인 샘플의 효과적이고 균일한 여기를 보장합니다.광학 블랙박스 위에 카메라 어셈블리를 장착하여 s를 향하도록 합니다.tage s가 이미징됩니다. 카메라와 LED를 2펄스 발생기와 4채널 오실로스코프에 연결합니다. 오실로스코프 및 펄스 발생기의 설정을 사용하여 카메라와 LED로 전송된 펄스를 동기화합니다.크리켓 장치의 특수 케이블과 소켓을 사용하여 증압기를 표준 전원 공급 장치에 연결하고 게인을 2.7볼트로 설정합니다. 카메라 렌즈 앞에 샘플을 놓습니다. 그런 다음 카메라와 증압기를 제외한 모든 전기 모듈을 켭니다.SOFI 소프트웨어를 활성화하여 초점 및 시료 정렬과 같은 작동 파라미터를 조정할 수 있습니다. 모듈에서 프레임 노출을 0.01초로 설정합니다. 무한 프레임을 선택하고 픽셀 작동 모드를 임계값 초과 시간으로 설정합니다.그런 다음 Preview(미리 보기)로 이동하여 Active module(활성 모듈)을 선택하여 Medipix/Timepix 프레임 창을 엽니다. 다음 단계에서는 녹화를 시작한 후 색상 스케일을 조정하고 이미지를 원하는 방향으로 회전합니다. 그런 다음 방의 조명을 끄고 증압기를 켭니다.렌즈와 Cricket 어댑터의 초점 기능을 사용하여 샘플 스테이지에 카메라 광학 장치의 초점을 맞춰 대비와 밝기가 좋은 샘플의 선명한 이미지를 생성합니다. 포커스가 완료되면 SOFI 소프트웨어를 닫습니다. 그런 다음 터미널로 이동하여 맞춤형 설계 소프트웨어의 명령을 실행하여 바이너리 형식의 원시 데이터를 획득하고 터미널을 닫습니다.수집된 데이터를 처리하기 위해 새 터미널을 엽니다. 데이터 파일을 로드하고 데이터 리듀서를 실행합니다. 데이터를 ICS 이미지 파일에 기록하는 C 언어로 작성된 전용 프로그램으로 후처리 데이터를 분석합니다.그런 다음 무료로 사용할 수 있는 Time Resolved Imaging 소프트웨어를 사용하여 ICS 이미지 파일을 열고 두 개의 지수 함수를 사용하여 인광 감쇠에 맞춥니다. 마지막으로 Fitted를 엽니다. ICS 이미지 파일을 사용 가능한 이미지 분석 소프트웨어와 함께 사용할 수 있습니다.룩업 테이블을 사용하여 인광 수명 이미지를 생성하고 의사 색상 스케일로 코딩합니다. 측정 기능을 사용하여 전체 이미지 또는 관심 영역에 대한 평균 수명 값을 계산합니다. 산소화 및 탈산소화 상태의 백금 옥타에틸포르피린 염료 센서 스팟의 인광 강도 및 인광 수명 이미징 현미경 이미지가 표시됩니다.올바른 배출 필터가 크리켓 내부에 장착되어 있고 올바른 LED, 케이블 연결 및 펄스 설정이 사용되는지 확인하십시오. 현재, 이 프로토콜은 동물 모델로 제한되지만, 잠재적으로 암, 뇌졸중 및 염증과 같은 조직 저산소증과 관련된 병리학적 상태를 진단하고 치료하기 위해 적용될 수 있다.

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