Name: fluorescence lifetime macro imager for biomedical applications
Uploaded: 2023-04-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications at JoVE.com

Økonomisk støtte til dette arbeidet fra Science Foundation Ireland, tilskudd SFI/12/RC/2276_P2, SFI/17/RC-PhD/3484 og 18/SP/3522, og Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland) er takknemlig anerkjent.

Alle prosedyrene med dyr ble utført under autorisasjoner utstedt av Health Products Regulatory Authority (HPRA, Irland) i samsvar med European Communities Council Directive (2010/63 / EU) og ble godkjent av Animal Experimentation Ethics Committee ved University College Cork.
1. Forberedelse av prøver
<ol><li>Farging med sonden av levende vevsprøver ex vivo<ol><li>For ex vivo applikasjoner, bruk ferskt isolerte vevsprøver fra 4 uker gamle kvinnelige Balb...

<ol>
	<li>Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+oxygen+and+hypoxia+in+cell+and+tissue+samples.">Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).</li><li>Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+is+the+partial+oxygen+pressure+of+human+tissues+a+crucial+parameter?+Small+molecules+and+hypoxia.">Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 15 (6), 1239-1253 (2011).</li><li>Yoshihara, T., Hirakawa, Y., Hosaka, M., Nangaku, M., Tobita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+imaging+of+living+cells+and+tissues+using+luminescent+molecular+probes.">Oxygen imaging of living cells and tissues using luminescent molecular probes.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews. 30, 71-95 (2017).</li><li>Papkovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescence+based+oxygen+sensors+essential+tools+for+cell+biology+and+life+science+research.">Phosphorescence based oxygen sensors essential tools for cell biology and life science research.</a> 17th International Meeting on Chemical Sensors - IMCS. , 71-72 (2018).</li><li>Tsytsarev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+brain+metabolism+activity+using+a+phosphorescent+oxygen-sensitive+probe.">In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe.</a> Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).</li><li>O'Donovan, C., Hynes, J., Yashunski, D., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescent+oxygen-sensitive+materials+for+biological+applications.">Phosphorescent oxygen-sensitive materials for biological applications.</a> Journal of Materials Chemistry. 15, 2946-2951 (2005).</li><li>Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+probes+and+techniques+for+O+2+measurement+in+live+cells+and+tissue.">Optical probes and techniques for O 2 measurement in live cells and tissue.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (12), 2025-2039 (2012).</li><li>Papkovsky, D. B., Zhdanov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescence+based+oxygen+sensors+and+probes+for+biomedical+research.">Phosphorescence based oxygen sensors and probes for biomedical research.</a> Advanced Environmental, Chemical, and Biological Sensing Technologies XIV. 10215, 102150 (2017).</li><li>Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+phosphorescence:+A+novel+method+for+measuring+oxygen+distribution+in+perfused+tissue.">Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue.</a> Science. 241 (4873), 1649-1651 (1988).</li><li>Hogan, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescence+quenching+method+for+measurement+of+intracellular+PO+2+in+isolated+skeletal+muscle+fibers.">Phosphorescence quenching method for measurement of intracellular PO 2 in isolated skeletal muscle fibers.</a> Journal of Applied Physiology. 86 (2), 720-724 (1999).</li><li>Apreleva, S. V., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomographic+imaging+of+oxygen+by+phosphorescence+lifetime.">Tomographic imaging of oxygen by phosphorescence lifetime.</a> Applied Optics. 45 (33), 8547-8559 (2006).</li><li>Becker, W., Shcheslavskiy, V., R&#252;ck, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+phosphorescence+and+fluorescence+lifetime+imaging+by+multi-dimensional+TCSPC+and+multi-pulse+excitation.">Simultaneous phosphorescence and fluorescence lifetime imaging by multi-dimensional TCSPC and multi-pulse excitation.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 19-30 (2017).</li><li>Wolfbeis, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescent+sensing+and+imaging+of+oxygen:+Fierce+competition+to+the+Clark+electrode.">Luminescent sensing and imaging of oxygen: Fierce competition to the Clark electrode.</a> BioEssays. 37 (8), 921-928 (2015).</li><li>Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+neurosphere+oxygenation+with+phosphorescent+probes.">Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes.</a> Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).</li><li>Shcheslavskiy, V. I., Neubauer, A., Bukowiecki, R., Dinter, F., Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+fluorescence+and+phosphorescence+lifetime+imaging.">Combined fluorescence and phosphorescence lifetime imaging.</a> Applied Physics Letters. 108, 091111 (2016).</li><li>Babilas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+phosphorescence+imaging+of+pO2+using+planar+oxygen+sensors.">In vivo phosphorescence imaging of pO2 using planar oxygen sensors.</a> Microcirculation. 12 (6), 477-487 (2005).</li><li>Babilas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+pO2+imaging+during+tourniquet-induced+forearm+ischemia+using+planar+optical+oxygen+sensors.">Transcutaneous pO2 imaging during tourniquet-induced forearm ischemia using planar optical oxygen sensors.</a> Skin Research and Technology. 14 (3), 304-311 (2008).</li><li>Golub, A. S., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PO2+measurements+in+the+microcirculation+using+phosphorescence+quenching+microscopy+at+high+magnification.">PO2 measurements in the microcirculation using phosphorescence quenching microscopy at high magnification.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2905-2916 (2008).</li><li>Zhdanov, A. V., Golubeva, A. V., Okkelman, I. A., Cryan, J. F., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+oxygen+gradients+in+giant+umbrella+cells:+An+ex+vivo+PLIM+study.">Imaging of oxygen gradients in giant umbrella cells: An ex vivo PLIM study.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 309 (7), 501-509 (2015).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+-+Techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging - Techniques and applications.</a> Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).</li><li>Jenkins, J., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B., Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cell+and+tissue+O+2+by+TCSPC-PLIM.">Imaging cell and tissue O 2 by TCSPC-PLIM.</a> Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Applications. , 225-247 (2015).</li><li>Becker, W., K&#246;nig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+TCSPC-FLIM+techniques.">Advanced TCSPC-FLIM techniques.</a> Multiphoton Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging: Applications in Biology and Medicine. , 23-52 (2018).</li><li>Wei, L., Yan, W., Ho, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+fluorescence+lifetime+analytical+microsystems:+Contact+optics+and+CMOS+time-resolved+electronics.">Recent advances in fluorescence lifetime analytical microsystems: Contact optics and CMOS time-resolved electronics.</a> Sensors. 17 (12), 2800 (2017).</li><li>Hirvonen, L. M., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wide-field+TCSPC:+Methods+and+applications.">Wide-field TCSPC: Methods and applications.</a> Measurement Science and Technology. 28, 012003 (2017).</li><li>Hirvonen, L. M., Festy, F., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wide-field+time-correlated+single-photon+counting+(TCSPC)+lifetime+microscopy+with+microsecond+time+resolution.">Wide-field time-correlated single-photon counting (TCSPC) lifetime microscopy with microsecond time resolution.</a> Optics Letters. 39 (19), 5602 (2014).</li><li>Sparks, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+new+gated+optical+image+intensifiers+for+fluorescence+lifetime+imaging.">Characterisation of new gated optical image intensifiers for fluorescence lifetime imaging.</a> Review of Scientific Instruments. 88 (1), 013707 (2017).</li><li>Chelushkin, P. S., Tunik, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Progress in Photon Science: Emerging New Directions. 115, (2017).</li><li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+macro-imager+based+on+Tpx3Cam+optical+camera+for+PLIM+applications.">A new macro-imager based on Tpx3Cam optical camera for PLIM applications.</a> Proceedings of SPIE. , 113591 (2020).</li><li>Fisher-Levine, M., Nomerotski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TimepixCam:+A+fast+optical+imager+with+time-stamping.">TimepixCam: A fast optical imager with time-stamping.</a> Journal of Instrumentation. 11, (2016).</li><li>Nomerotski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+time+stamping+of+photons+with+nanosecond+resolution+in+Timepix+based+optical+cameras.">Imaging and time stamping of photons with nanosecond resolution in Timepix based optical cameras.</a> Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 937. 937, 26-30 (2019).</li><li>Poikela, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timepix3:+A+65K+channel+hybrid+pixel+readout+chip+with+simultaneous+ToA/ToT+and+sparse+readout.">Timepix3: A 65K channel hybrid pixel readout chip with simultaneous ToA/ToT and sparse readout.</a> Journal of Instrumentation. 9, 05013 (2014).</li><li>Nomerotski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+TimepixCam,+a+fast+imager+for+the+time-stamping+of+optical+photons.">Characterization of TimepixCam, a fast imager for the time-stamping of optical photons.</a> Journal of Instrumentation. 12, 01017 (2017).</li><li>Hirvonen, L. M., Fisher-Levine, M., Suhling, K., Nomerotski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photon+counting+phosphorescence+lifetime+imaging+with+TimepixCam.">Photon counting phosphorescence lifetime imaging with TimepixCam.</a> Review of Scientific Instruments. 88, 013104 (2017).</li><li>Visser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDR:+A+read-out+system+for+Medipix3+&amp;+Timepix3.">SPIDR: A read-out system for Medipix3 &amp; Timepix3.</a> Journal of Instrumentation. 10, 12028 (2015).</li><li>Tsytsarev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+brain+metabolism+activity+using+a+phosphorescent+oxygen-sensitive+probe.">In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe.</a> Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).</li><li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+O2+concentration+in+ex-vivo+tissue+samples+on+a+fast+PLIM+macro-imager.">Mapping O2 concentration in ex-vivo tissue samples on a fast PLIM macro-imager.</a> Scientific Reports. 10, 19006 (2020).</li><li>Kersemans, V., Cornelissen, B., Allen, P. D., Beech, J. S., Smart, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+tumor+volume+measurement+in+the+awake,+manually+restrained+mouse+using+MRI.">Subcutaneous tumor volume measurement in the awake, manually restrained mouse using MRI.</a> Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (6), 1499-1504 (2013).</li><li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+luminescence+lifetime+macro-imager+based+on+a+Tpx3Cam+optical+camera.">New luminescence lifetime macro-imager based on a Tpx3Cam optical camera.</a> Biomedical Optics Express. 11 (1), 77-88 (2020).</li><li>Papkovsky, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescent+polymer+films+for+optical+oxygen+sensors.">Phosphorescent polymer films for optical oxygen sensors.</a> Biosensors and Bioelectronics. 7 (3), 199-206 (1992).</li><li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+planar+phosphorescence+based+oxygen+sensors+on+a+TCSPC-PLIM+macro-imager.">Characterization of planar phosphorescence based oxygen sensors on a TCSPC-PLIM macro-imager.</a> Sensors and Actuators, B: Chemical. 321, 128459 (2020).</li><li>Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Berndt, K. W., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging.">Fluorescence lifetime imaging.</a> Analytical Biochemistry. 202 (2), 316-330 (1992).</li></ol>

Protokollene ovenfor gir en detaljert beskrivelse av monteringen av den nye bildeapparatet og dens drift i mikrosekund FLIM / PLIM-modus. Den TCSPC-baserte nye generasjonen Tpx3Cam-kamera, kombinert ved hjelp av den optomekaniske adapteren Cricket med bildeforsterkeren, utslippsfilteret og makroobjektivet, produserer en stabil, kompakt og fleksibel optisk modul som er enkel å betjene. Bildeapparatet ble vist å fungere godt med en rekke forskjellige prøver og analytiske oppgaver, som inkluderte karakterisering av fosfo...

O 2 er en av de viktigste miljøparametrene for levende systemer, og kunnskap om fordelingen av O 2 og dens dynamikk er viktig for mange biologiske studier 1,2,3. Vurderingen av oksygenering av vev ved hjelp av fosforescerende sonder 4,5,6,7,8 og PLIM 9,10,11,12,13 blir stadig mer populær i biologisk og medisinsk forskning 3,9,14,15,16, 17,18,19. Dette skyldes at PLIM, i motsetning til fluorescens- eller fosforescensintensitetsmålinger, ikke påvirkes av eksterne faktorer som sondekonsentrasjon, fotobleking, eksitasjonsintensitet, optisk justering, spredning og autofluorescens.
Imidlertid er nåværende O2 PLIM-plattformer begrenset av følsomhet, bildeinnsamlingshastighet, nøyaktighet og generell brukervennlighet. Tidskorrelert enkeltfoton telling (TCSPC), kombinert med en rasterskanningsprosedyre, brukes ofte i PLIM og fluorescens levetid imaging mikroskopi (FLIM) enheter20,21,22. Men siden PLIM krever lang pikseloppholdstid (i millisekundområdet), er tiden for bildeinnsamling mye lengre enn det som kreves for FLIM-applikasjoner20,22,23. Andre teknikker, for eksempel gated CCD / CMOS-kameraer, mangler enkeltfotonfølsomhet og har lave bildefrekvenser20,24,25,26. Videre er de eksisterende PLIM-systemene mest brukt i mikroskopisk format, mens makroskopiske systemer er mindre vanlige27.
Den TCSPC-baserte PLIM macro imager28 ble satt opp for å overvinne mange av disse begrensningene. Utformingen av bildeapparatet ble sterkt tilrettelagt ved bruk av en ny optomekanisk adapter, Cricket, som har følgende: i) to C-mount-adaptere, som gir enkel kobling av kameramodulen på baksiden og objektivlinsen på forsiden; ii) et internt hus for en bildeforsterker og en stikkontakt for sistnevnte på ytre side av Cricket; iii) et internt rom bak den fremre C-mount-adapteren der et standard 25 mm utslippsfilter kan plasseres foran forsterkeren; og iv) en innebygd lyskollimerende optikk med ringregulatorer, som tillater optisk justering / fokusering mellom linsen og kameraet for å produsere skarpe bilder på kamerabrikken.
I det monterte bildeapparatet er kameramodulen koblet til baksiden av Cricket-adapteren, som også inneholder en bildeforsterker bestående av en fotokatode etterfulgt av en mikrokanalplate (MCP), en forsterker og en rask scintillator, P47-fosfor. Et 760 nm ± 50 nm utslippsfilter er montert inne i Cricket, og et objektivobjektiv, NMV-50M11'', er festet til forsiden av C-mount-adapteren. Til slutt er linsen og kameraet justert optisk med ringregulatorer.
Forsterkerens rolle er å oppdage innkommende fotoner og konvertere dem til raske lysutbrudd på kamerabrikken, som registreres og brukes til å generere utslippsfall og levetidsbilder. Kameramodulen består av en avansert TCSPC-basert optisk sensorgruppe (256 piksler x 256 piksler) og en ny generasjons avlesningsbrikke 29,30,31,32,33, som tillater samtidig registrering av ankomsttid (TOA) og tid over terskel (TOT) av fotonutbrudd ved hver piksel av bildebrikken med en tidsoppløsning på 1,6 ns og en 80 Mpixel / s avlesningshastighet.
I denne konfigurasjonen har kameraet med forsterkeren enkeltfotonfølsomhet. Den er datadrevet og basert på SPIDR-systemet (Speedy Pixel Detector Readout)34. Den romlige oppløsningen til bildeapparatet ble tidligere karakterisert med plane fosforescerendeO2-sensorer og en oppløsningsplatemaske. Instrumentresponsfunksjonen (IRF) ble målt ved avbildning av en plan fluorescerende sensor under de samme innstillingene som ble brukt for alle de andre målingene. Levetiden til fargestoffet på rundt 2,6 ns var kort nok til at det kunne brukes til IRF-måling i PLIM-modus. Bildeapparatet kan avbilde objekter på opptil 18 mm x 18 mm i størrelse med romlige og tidsmessige oppløsninger på henholdsvis 39,4 μm og 30,6 ns (full bredde ved halv maksimum), henholdsvis28.
Følgende protokoller beskriver samlingen av makrobildeapparatet og dets påfølgende bruk for å kartlegge O2-konsentrasjonen i biologiske prøver farget med den tidligere karakteriserte nær-infrarødeO2-sonden, NanO2-IR35. Sonden er en lys, fotostabil, cellegjennomtrengelig O 2-sensorsonde basert på platina (II) benzoporfyrin (PtBP) fargestoff. Det er spennende ved 625 nm, avgir ved 760 nm, og gir en robust optisk respons på O 2 i det fysiologiske området (0% -21% eller 0-210 μM av O2). Bildeapparatet er også demonstrert for å karakterisere forskjellige sensormaterialer basert på Pt(II)-porfyrinfargestoffer. Samlet sett er bildeapparatet kompakt og fleksibelt, i likhet med et vanlig fotografisk kamera. I det nåværende oppsettet er bildeapparatet egnet for forskjellige bredfelts PLIM-applikasjoner. Å erstatte LED-lampen med en rask laserkilde vil forbedre ytelsen til bildeapparatet ytterligere og potensielt muliggjøre nanosekund FLIM-applikasjoner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>627 nm LED</td>
			<td>Parts Express</td>
			<td></td>
			<td>Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>760 &#177; 50 nm emission filter</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>84-788</td>
			<td>Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 &#177; 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balb/c mice</td>
			<td>Envigo, UK</td>
			<td>Balb/c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black box</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25C9/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cricket Adapter</td>
			<td>Photonis</td>
			<td>Cricket-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CT26 cells&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CT26.WT</td>
			<td>https://www.atcc.org/products/crl-2638</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0697</td>
			<td>Other media can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen</td>
			<td>Photonis</td>
			<td>PP0360EF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900.300</td>
			<td>35 mm diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar plastic film, 75 micron&#160;</td>
			<td>RS Ireland</td>
			<td>785-0795</td>
			<td>Othe plastic substrates can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanO2-IR</td>
			<td>home-made</td>
			<td>n/a</td>
			<td>The probe can be synthesised according to the published method &#39;Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.&#39; or provided by our lab.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMV-50M11&#8221; 50 mm lens</td>
			<td>Navitar</td>
			<td></td>
			<td>Other lenses compatibel with C-mount adators can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB1836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1472.001</td>
			<td>92 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Supply</td>
			<td>Tenma</td>
			<td>72-10495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse Generator</td>
			<td>Tenma</td>
			<td>TGP110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sophy</td>
			<td>Amsterdam Scientific Instruments</td>
			<td>n/z</td>
			<td>Provided by ASI together with the Tpx3Cam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tpx3Cam</td>
			<td>Amsterdam Scientific Instruments</td>
			<td>TPXCAM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri2 Software</td>
			<td>University of Oxford</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ Translation Stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LT3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence lifetime macro imager for biomedical applications

Dette papiret presenterer en ny fotoluminescens levetid imager designet for å kartlegge molekylært oksygen (O 2) konsentrasjon i forskjellige fosforescerende prøver som spenner fra solid-state, O 2-sensitive belegg til levende dyr vevsprøver farget med løselige O 2-sensitive sonder. Spesielt ble den nanopartikkelbaserte nær-infrarøde sonden NanO2-IR, som er spennende med en 625 nm lysemitterende diode (LED) og avgir ved 760 nm, brukt. Bildesystemet er basert på Timepix3-kameraet (Tpx3Cam) og den optomekaniske adapteren, som også huser en bildeforsterker. O2 fosforescens levetid imaging mikroskopi (PLIM) er vanligvis nødvendig for ulike studier, men dagens plattformer har begrensninger i nøyaktighet, generell fleksibilitet og brukervennlighet.
Systemet som presenteres her er et raskt og svært følsomt bildeapparat, som er bygget på en integrert optisk sensor og avlesningsbrikkemodul, Tpx3Cam. Det er vist å produsere fosforescenssignaler med høy intensitet og stabile levetidsverdier fra overflatefargede tarmvevsprøver eller intraluminalt fargede fragmenter av tyktarmen og tillater detaljert kartlegging av vev O2-nivåer på ca. 20 s eller mindre. Innledende eksperimenter på avbildning av hypoksi i podede svulster i bevisstløse dyr presenteres også. Vi beskriver også hvordan imageren kan konfigureres på nytt for bruk med O2-sensitive materialer basert på Pt-porfyrinfargestoffer ved hjelp av en 390 nm LED for eksitasjonen og et båndpass 650 nm filter for utslipp. Samlet sett ble PLIM-avbildningen funnet å produsere nøyaktige kvantitative målinger av levetidsverdier for sondene som ble brukt og respektive todimensjonale kart overO2-konsentrasjonen . Det er også nyttig for metabolsk avbildning av ex vivo vevsmodeller og levende dyr.

For ex vivo avbildningsapplikasjoner ble fragmenter av tarmvev farget ved lokal påføring av NanO2-IR-sonden på serosalsiden av vevet. For dypere farging ble 1 μL av sonden injisert i lumen. I sistnevnte tilfelle skjermet den 0,2-0,25 mm tykke tarmveggen sonden fra kameraet. De to fargeprosessene er vist i figur 2A.
De resulterende intensitets- og PLIM-bildene er presentert i figur 2B-G. F...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications at JoVE.com

Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications

Denne artikkelen beskriver bruken av et nytt, raskt optisk bildeapparat for makroskopisk fotoluminescens levetidsavbildning av prøver med langt henfall. Integrasjons-, bildeinnsamlings- og analyseprosedyrene beskrives, sammen med forberedelse og karakterisering av sensormaterialene for avbildning og anvendelse av bildeapparatet i studier av biologiske prøver.

Fluorescens levetid makro imager for biomedisinske applikasjoner

This paper presents a new photoluminescence lifetime imager designed to map the molecular oxygen (O2) concentration in different phosphorescent samples ...

Vår protokoll gir detaljert 2D-kartlegging av fosforescens levetid og oksygenkonsentrasjon i makroskopiske objekter, spesielt levende dyrevev og hele dyr, ved hjelp av dedikerte sonder og sensormaterialer. Denne informasjonen er viktig for mange forskningsområder. Vår protokoll bruker en integrert og kompakt bildemodul som opererer i TCSPC-modus og gir enkel og nøyaktig visualisering av levetid og oksygenfordeling i komplekse biologiske prøver, for eksempel livsvev.Ta Cricket-adapteren og inspiser den fra forskjellige sider. Fjern den fremre C-mount-adapteren for å vise Photonis PP0360EF-forsterkeren som er plassert i Cricket, og sett deretter C-mount-adapteren tilbake. Fjern Crickets C-mount-adapter på forsiden og sett inn utslippsfilteret på 650 pluss / minus 50 nanometer.Fiks det ved å sette tilbake C-fatningen. Deretter kobler du TPX tre-cam kameramodulen til baksiden av Cricket-modulen via ringadapterne. Koble linsen til forsiden av Cricket-modulen via C-mount-adapteren.Koble LED-lampen til en strømforsyning og en pulsgenerator. Monter nå den 390 nanometer superlyse LED-lampen på en stolpe festet til et brødbrett inne i den svarte boksen. Slå på LED-lampen og fokuser den for å sikre effektiv og jevn eksitering av prøven som avbildes.Monter kameraenheten på toppen av den optiske svarte boksen som vender ned mot scenen der prøvene skal avbildes. Koble kameraet og LED-en til topulsgeneratorer og et firekanals oscilloskop. Bruk innstillingene på oscilloskopet og pulsgeneratorene til å synkronisere pulsene som sendes til kameraet og LED-lampen.Bruk den spesielle kabelen og kontakten på Cricket-enheten for å koble forsterkeren til en standard strømforsyning og sett forsterkningen til 2,7 volt. Plasser prøven foran kameralinsen. Slå deretter på kameraet og alle elektriske moduler, unntatt forsterkeren.Aktiver SOFI-programvaren for å justere driftsparametrene, som fokusering og prøvejustering. I modulene setter du bildeeksponeringen til 0,01 sekunder. Velg Uendelige delbilder, og angi bildepunktdriftsmodusen til tid over terskel.Gå deretter til Forhåndsvisning og velg Aktiv modul for å åpne Medipix/Timepix-rammevinduet. I neste trinn, etter at du har startet opptaket, justerer du fargeskalaen og roterer bildet til ønsket retning. Deretter slår du av lysene i rommet og slår på forsterkeren.Fokuser kameraoptikken på prøvestadiet med fokuseringsegenskapene til objektivet og Cricket-adapteren for å generere klare bilder av prøver med god kontrast og lysstyrke. Når fokuset er fullført, lukker du SOFI-programvaren. Gå deretter til terminalen, utfør kommandoene til den tilpassede designprogramvaren for å skaffe rådataene i binært format og lukke terminalen.Åpne en ny terminal for å behandle de oppkjøpte dataene. Last inn datafilen og kjør datareduksjonen. Analyser etterbehandlingsdataene med et dedikert program skrevet på C-språk som vil skrive dataene inn i en ICS-bildefil.Deretter åpner du ICS-bildefilene ved hjelp av den fritt tilgjengelige Time Resolved Imaging-programvaren, og bruker to eksponentialfunksjoner for å passe fosforescenshenfallene. Til slutt åpner du Fitted. ICS-bildefiler med den tilgjengelige bildeanalyseprogramvaren.Generer livstidsbilder med fosforescens ved hjelp av oppslagstabeller og kode dem i pseudofargeskala. Bruk Measure-funksjonen til å beregne gjennomsnittlige levetidsverdier for hele bildet eller interesseområdene. Fosforescensintensitet og fosforescens levetidsavbildningsmikroskopibilder av platinaoktaetylporfyrinfargestoffsensoren i de oksygenerte og deoksygenerte tilstandene er vist.Forsikre deg om at riktig utslippsfilter er montert inne i Cricket, og at riktig LED, kabeltilkoblinger og pulsinnstillinger brukes. For tiden er denne protokollen begrenset til dyremodeller, men potensielt kan brukes til å diagnostisere og behandle patologiske tilstander assosiert med vevshypoksi, som kreft, hjerneslag og betennelse.

Research

JoVE Journal

Biology

BioMEMS and Cellular Biology: Perspectives and Applications

The ability to culture cells has revolutionized hypothesis testing in basic cell and molecular biology research. It has become a standard methodology in ...

Microfluidic Applications for Disposable Diagnostics

In this interview, Dr. Klapperich discusses the fabrication of thermoplastic microfluidic devices and their application for development of new ...

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Absolute kvanteutbytte Måling av Powder Samples

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Infinium analyse for Storskala SNP genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Utvinning av Voksen sebrafisk Hearts for høy gjennomstrømming Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Genetisk strekkoding med Fluorescent Proteiner for multiplekset Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...