Name: fluorescence lifetime macro imager for biomedical applications
Uploaded: 2023-04-07T12:30:00
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O apoio financeiro para este trabalho da Science Foundation Ireland, subsídios SFI/12/RC/2276_P2, SFI/17/RC-PhD/3484 e 18/SP/3522, e Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland) é reconhecido com gratidão.

Todos os procedimentos com animais foram realizados sob autorizações emitidas pela Health Products Regulatory Authority (HPRA, Irlanda) de acordo com a Diretiva do Conselho das Comunidades Europeias (2010/63/EU) e foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da University College Cork.
1. Preparação da amostra
<ol><li>Coloração com sonda de amostras de tecidos vivos ex vivo<ol><li>Para aplicações ex vivo , use amostras de tecido...

<ol>
	<li>Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+oxygen+and+hypoxia+in+cell+and+tissue+samples.">Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).</li><li>Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+is+the+partial+oxygen+pressure+of+human+tissues+a+crucial+parameter?+Small+molecules+and+hypoxia.">Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 15 (6), 1239-1253 (2011).</li><li>Yoshihara, T., Hirakawa, Y., Hosaka, M., Nangaku, M., Tobita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+imaging+of+living+cells+and+tissues+using+luminescent+molecular+probes.">Oxygen imaging of living cells and tissues using luminescent molecular probes.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews. 30, 71-95 (2017).</li><li>Papkovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescence+based+oxygen+sensors+essential+tools+for+cell+biology+and+life+science+research.">Phosphorescence based oxygen sensors essential tools for cell biology and life science research.</a> 17th International Meeting on Chemical Sensors - IMCS. , 71-72 (2018).</li><li>Tsytsarev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+brain+metabolism+activity+using+a+phosphorescent+oxygen-sensitive+probe.">In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe.</a> Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).</li><li>O'Donovan, C., Hynes, J., Yashunski, D., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescent+oxygen-sensitive+materials+for+biological+applications.">Phosphorescent oxygen-sensitive materials for biological applications.</a> Journal of Materials Chemistry. 15, 2946-2951 (2005).</li><li>Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+probes+and+techniques+for+O+2+measurement+in+live+cells+and+tissue.">Optical probes and techniques for O 2 measurement in live cells and tissue.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (12), 2025-2039 (2012).</li><li>Papkovsky, D. B., Zhdanov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescence+based+oxygen+sensors+and+probes+for+biomedical+research.">Phosphorescence based oxygen sensors and probes for biomedical research.</a> Advanced Environmental, Chemical, and Biological Sensing Technologies XIV. 10215, 102150 (2017).</li><li>Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+phosphorescence:+A+novel+method+for+measuring+oxygen+distribution+in+perfused+tissue.">Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue.</a> Science. 241 (4873), 1649-1651 (1988).</li><li>Hogan, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescence+quenching+method+for+measurement+of+intracellular+PO+2+in+isolated+skeletal+muscle+fibers.">Phosphorescence quenching method for measurement of intracellular PO 2 in isolated skeletal muscle fibers.</a> Journal of Applied Physiology. 86 (2), 720-724 (1999).</li><li>Apreleva, S. V., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomographic+imaging+of+oxygen+by+phosphorescence+lifetime.">Tomographic imaging of oxygen by phosphorescence lifetime.</a> Applied Optics. 45 (33), 8547-8559 (2006).</li><li>Becker, W., Shcheslavskiy, V., R&#252;ck, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+phosphorescence+and+fluorescence+lifetime+imaging+by+multi-dimensional+TCSPC+and+multi-pulse+excitation.">Simultaneous phosphorescence and fluorescence lifetime imaging by multi-dimensional TCSPC and multi-pulse excitation.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 19-30 (2017).</li><li>Wolfbeis, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescent+sensing+and+imaging+of+oxygen:+Fierce+competition+to+the+Clark+electrode.">Luminescent sensing and imaging of oxygen: Fierce competition to the Clark electrode.</a> BioEssays. 37 (8), 921-928 (2015).</li><li>Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+neurosphere+oxygenation+with+phosphorescent+probes.">Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes.</a> Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).</li><li>Shcheslavskiy, V. I., Neubauer, A., Bukowiecki, R., Dinter, F., Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+fluorescence+and+phosphorescence+lifetime+imaging.">Combined fluorescence and phosphorescence lifetime imaging.</a> Applied Physics Letters. 108, 091111 (2016).</li><li>Babilas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+phosphorescence+imaging+of+pO2+using+planar+oxygen+sensors.">In vivo phosphorescence imaging of pO2 using planar oxygen sensors.</a> Microcirculation. 12 (6), 477-487 (2005).</li><li>Babilas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+pO2+imaging+during+tourniquet-induced+forearm+ischemia+using+planar+optical+oxygen+sensors.">Transcutaneous pO2 imaging during tourniquet-induced forearm ischemia using planar optical oxygen sensors.</a> Skin Research and Technology. 14 (3), 304-311 (2008).</li><li>Golub, A. S., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PO2+measurements+in+the+microcirculation+using+phosphorescence+quenching+microscopy+at+high+magnification.">PO2 measurements in the microcirculation using phosphorescence quenching microscopy at high magnification.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2905-2916 (2008).</li><li>Zhdanov, A. V., Golubeva, A. V., Okkelman, I. A., Cryan, J. F., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+oxygen+gradients+in+giant+umbrella+cells:+An+ex+vivo+PLIM+study.">Imaging of oxygen gradients in giant umbrella cells: An ex vivo PLIM study.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 309 (7), 501-509 (2015).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+-+Techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging - Techniques and applications.</a> Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).</li><li>Jenkins, J., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B., Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cell+and+tissue+O+2+by+TCSPC-PLIM.">Imaging cell and tissue O 2 by TCSPC-PLIM.</a> Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Applications. , 225-247 (2015).</li><li>Becker, W., K&#246;nig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+TCSPC-FLIM+techniques.">Advanced TCSPC-FLIM techniques.</a> Multiphoton Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging: Applications in Biology and Medicine. , 23-52 (2018).</li><li>Wei, L., Yan, W., Ho, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+fluorescence+lifetime+analytical+microsystems:+Contact+optics+and+CMOS+time-resolved+electronics.">Recent advances in fluorescence lifetime analytical microsystems: Contact optics and CMOS time-resolved electronics.</a> Sensors. 17 (12), 2800 (2017).</li><li>Hirvonen, L. M., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wide-field+TCSPC:+Methods+and+applications.">Wide-field TCSPC: Methods and applications.</a> Measurement Science and Technology. 28, 012003 (2017).</li><li>Hirvonen, L. M., Festy, F., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wide-field+time-correlated+single-photon+counting+(TCSPC)+lifetime+microscopy+with+microsecond+time+resolution.">Wide-field time-correlated single-photon counting (TCSPC) lifetime microscopy with microsecond time resolution.</a> Optics Letters. 39 (19), 5602 (2014).</li><li>Sparks, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+new+gated+optical+image+intensifiers+for+fluorescence+lifetime+imaging.">Characterisation of new gated optical image intensifiers for fluorescence lifetime imaging.</a> Review of Scientific Instruments. 88 (1), 013707 (2017).</li><li>Chelushkin, P. S., Tunik, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Progress in Photon Science: Emerging New Directions. 115, (2017).</li><li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+macro-imager+based+on+Tpx3Cam+optical+camera+for+PLIM+applications.">A new macro-imager based on Tpx3Cam optical camera for PLIM applications.</a> Proceedings of SPIE. , 113591 (2020).</li><li>Fisher-Levine, M., Nomerotski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TimepixCam:+A+fast+optical+imager+with+time-stamping.">TimepixCam: A fast optical imager with time-stamping.</a> Journal of Instrumentation. 11, (2016).</li><li>Nomerotski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+time+stamping+of+photons+with+nanosecond+resolution+in+Timepix+based+optical+cameras.">Imaging and time stamping of photons with nanosecond resolution in Timepix based optical cameras.</a> Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 937. 937, 26-30 (2019).</li><li>Poikela, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timepix3:+A+65K+channel+hybrid+pixel+readout+chip+with+simultaneous+ToA/ToT+and+sparse+readout.">Timepix3: A 65K channel hybrid pixel readout chip with simultaneous ToA/ToT and sparse readout.</a> Journal of Instrumentation. 9, 05013 (2014).</li><li>Nomerotski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+TimepixCam,+a+fast+imager+for+the+time-stamping+of+optical+photons.">Characterization of TimepixCam, a fast imager for the time-stamping of optical photons.</a> Journal of Instrumentation. 12, 01017 (2017).</li><li>Hirvonen, L. M., Fisher-Levine, M., Suhling, K., Nomerotski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photon+counting+phosphorescence+lifetime+imaging+with+TimepixCam.">Photon counting phosphorescence lifetime imaging with TimepixCam.</a> Review of Scientific Instruments. 88, 013104 (2017).</li><li>Visser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDR:+A+read-out+system+for+Medipix3+&amp;+Timepix3.">SPIDR: A read-out system for Medipix3 &amp; Timepix3.</a> Journal of Instrumentation. 10, 12028 (2015).</li><li>Tsytsarev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+brain+metabolism+activity+using+a+phosphorescent+oxygen-sensitive+probe.">In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe.</a> Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).</li><li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+O2+concentration+in+ex-vivo+tissue+samples+on+a+fast+PLIM+macro-imager.">Mapping O2 concentration in ex-vivo tissue samples on a fast PLIM macro-imager.</a> Scientific Reports. 10, 19006 (2020).</li><li>Kersemans, V., Cornelissen, B., Allen, P. D., Beech, J. S., Smart, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+tumor+volume+measurement+in+the+awake,+manually+restrained+mouse+using+MRI.">Subcutaneous tumor volume measurement in the awake, manually restrained mouse using MRI.</a> Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (6), 1499-1504 (2013).</li><li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+luminescence+lifetime+macro-imager+based+on+a+Tpx3Cam+optical+camera.">New luminescence lifetime macro-imager based on a Tpx3Cam optical camera.</a> Biomedical Optics Express. 11 (1), 77-88 (2020).</li><li>Papkovsky, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescent+polymer+films+for+optical+oxygen+sensors.">Phosphorescent polymer films for optical oxygen sensors.</a> Biosensors and Bioelectronics. 7 (3), 199-206 (1992).</li><li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+planar+phosphorescence+based+oxygen+sensors+on+a+TCSPC-PLIM+macro-imager.">Characterization of planar phosphorescence based oxygen sensors on a TCSPC-PLIM macro-imager.</a> Sensors and Actuators, B: Chemical. 321, 128459 (2020).</li><li>Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Berndt, K. W., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging.">Fluorescence lifetime imaging.</a> Analytical Biochemistry. 202 (2), 316-330 (1992).</li></ol>

Os protocolos acima fornecem uma descrição detalhada da montagem do novo imageador e seu funcionamento no modo FLIM/PLIM de microssegundos. A câmera Tpx3Cam de nova geração baseada em TCSPC, acoplada por meio do adaptador optomecânico Cricket com o intensificador de imagem, filtro de emissão e macrolente, produz um módulo óptico estável, compacto e flexível que é fácil de operar. O imageador mostrou um bom desempenho com uma variedade de diferentes amostras e tarefas analíticas, que incluíram a caracteriza...

O 2 é um dos principais parâmetros ambientais para sistemas vivos, e o conhecimento da distribuição do O 2 e sua dinâmica é importante para muitos estudos biológicos 1,2,3. A avaliação da oxigenação tecidual por meio de sondas fosforescentes 4,5,6,7,8 e PLIM 9,10,11,12,13 vem ganhando popularidade nas pesquisas biológicas e médicas 3,9,14,15,16, 17,18,19. Isso ocorre porque o PLIM, ao contrário das medidas de fluorescência ou intensidade de fosforescência, não é afetado por fatores externos, como concentração de sonda, fotobranqueamento, intensidade de excitação, alinhamento óptico, espalhamento e autofluorescência.
No entanto, as plataformas PLIM O2 atuais são limitadas por sua sensibilidade, velocidade de aquisição de imagem, precisão e usabilidade geral. A contagem de fótons únicos correlacionada ao tempo (TCSPC), combinada com um procedimento de varredura raster, é frequentemente usada em dispositivos de PLIM e fluorescência de microscopia de imagem de tempo de vida (FLIM)20,21,22. No entanto, como o PLIM requer um longo tempo de permanência de pixels (na faixa de milissegundos), o tempo de aquisição da imagem é muito maior do que o necessário para aplicações FLIM20,22,23. Outras técnicas, como câmeras CCD/CMOS fechadas, não possuem sensibilidade a fótons únicos e apresentam baixas taxas de quadros20,24,25,26. Além disso, os sistemas PLIM existentes são mais utilizados no formato microscópico, enquanto os sistemas macroscópicos são menos comuns27.
O imageador de macro PLIM28 baseado em TCSPC foi configurado para superar muitas dessas limitações. O design do imageador foi muito facilitado pelo uso de um novo adaptador optomecânico, Cricket, que tem o seguinte: i) dois adaptadores C-mount, que fornecem fácil acoplamento do módulo da câmera no lado traseiro e lente objetiva no lado frontal; ii) uma carcaça interna para um intensificador de imagem e uma tomada para este último no lado externo do Grilo; iii) um espaço interno atrás do adaptador de montagem em C frontal, onde um filtro de emissão padrão de 25 mm pode ser alojado na frente do intensificador; e iv) uma óptica de colima de luz integrada com reguladores de anel, que permitem o alinhamento/focalização óptico entre a lente e a câmera para produzir imagens nítidas no chip da câmera.
No imageador montado, o módulo da câmera é acoplado à parte traseira do adaptador Cricket, que também abriga um intensificador de imagem composto por um fotocátodo seguido por uma placa de microcanal (MCP), um amplificador e um cintilador rápido, fósforo P47. Um filtro de emissão de 760 nm ± 50 nm é instalado dentro do Cricket, e uma lente objetiva, NMV-50M11'', é conectada ao adaptador de montagem C frontal lateral. Finalmente, a lente e a câmera estão alinhadas opticamente com reguladores de anel.
O papel do intensificador é detectar fótons de entrada e convertê-los em rajadas rápidas de luz no chip da câmera, que são registradas e usadas para gerar decaimentos de emissão e imagens vitalícias. O módulo da câmera é composto por um avançado conjunto de sensores ópticos baseados em TCSPC (256 pixels x 256 pixels) e um chip de leitura de nova geração 29,30,31,32,33, que permitem a gravação simultânea do tempo de chegada (TOA) e do tempo sobre o limiar (TOT) de rajadas de fótons em cada pixel do chip de imagem com uma resolução de tempo de 1,6 ns e uma taxa de leitura de 80 Mpixel/s.
Nessa configuração, a câmera com o intensificador tem sensibilidade de fóton único. É orientado por dados e baseado no sistema de leitura rápida do detector de pixels (SPIDR)34. A resolução espacial do imageador foi previamente caracterizada com sensores planares fosforescentes O2 e uma máscara de placa de resolução. A função de resposta do instrumento (IRF) foi medida pela imagem de um sensor fluorescente planar sob as mesmas configurações usadas para todas as outras medidas. A vida útil do corante de cerca de 2,6 ns foi curta o suficiente para que ele fosse usado para a medição de IRF no modo PLIM. O imageador pode obter imagens de objetos de até 18 mm x 18 mm de tamanho com resoluções espaciais e temporais de 39,4 μm e 30,6 ns (largura total na metade do máximo), respectivamente28.
Os protocolos a seguir descrevem a montagem do macroimageador e seu posterior uso para mapeamento da concentração de O 2 em amostras biológicas coradas com a sonda de infravermelho próximo O2 previamente caracterizada, NanO2-IR35. A sonda é uma sonda de detecção de O2 brilhante, fotoestável, permeável a células, baseada no corante de platina (II) benzoporfirina (PtBP). É excitável a 625 nm, emite a 760 nm e fornece uma resposta óptica robusta ao O 2 na faixa fisiológica (0%-21% ou 0-210 μM de O2). O imageador também demonstrou caracterizar diferentes materiais sensores baseados em corantes Pt(II)-porfirina. No geral, o imageador é compacto e flexível, semelhante a uma câmera fotográfica comum. Na configuração atual, o imageador é apropriado para diferentes aplicações PLIM de campo amplo. A substituição do LED por uma fonte de laser rápida melhorará ainda mais o desempenho do imageador e poderá potencialmente permitir aplicações FLIM de nanossegundos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>627 nm LED</td>
			<td>Parts Express</td>
			<td></td>
			<td>Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>760 &#177; 50 nm emission filter</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>84-788</td>
			<td>Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 &#177; 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balb/c mice</td>
			<td>Envigo, UK</td>
			<td>Balb/c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black box</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25C9/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cricket Adapter</td>
			<td>Photonis</td>
			<td>Cricket-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CT26 cells&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CT26.WT</td>
			<td>https://www.atcc.org/products/crl-2638</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0697</td>
			<td>Other media can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen</td>
			<td>Photonis</td>
			<td>PP0360EF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900.300</td>
			<td>35 mm diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar plastic film, 75 micron&#160;</td>
			<td>RS Ireland</td>
			<td>785-0795</td>
			<td>Othe plastic substrates can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanO2-IR</td>
			<td>home-made</td>
			<td>n/a</td>
			<td>The probe can be synthesised according to the published method &#39;Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.&#39; or provided by our lab.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMV-50M11&#8221; 50 mm lens</td>
			<td>Navitar</td>
			<td></td>
			<td>Other lenses compatibel with C-mount adators can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB1836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1472.001</td>
			<td>92 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Supply</td>
			<td>Tenma</td>
			<td>72-10495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse Generator</td>
			<td>Tenma</td>
			<td>TGP110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sophy</td>
			<td>Amsterdam Scientific Instruments</td>
			<td>n/z</td>
			<td>Provided by ASI together with the Tpx3Cam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tpx3Cam</td>
			<td>Amsterdam Scientific Instruments</td>
			<td>TPXCAM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri2 Software</td>
			<td>University of Oxford</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ Translation Stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LT3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence lifetime macro imager for biomedical applications

Este trabalho apresenta um novo imageador de vida útil de fotoluminescência projetado para mapear a concentração de oxigênio molecular (O 2) em diferentes amostras fosforescentes, desde revestimentos sensíveis ao estado sólido do tipo O 2 até amostras de tecido animal vivo coradas com sondas solúveis sensíveis ao O2. Em particular, a sonda de infravermelho próximo NanO2-IR, baseada em nanopartículas, que é excitável com um diodo emissor de luz (LED) de 625 nm e emite a 760 nm, foi usada. O sistema de imagem é baseado na câmera Timepix3 (Tpx3Cam) e no adaptador optomecânico, que também abriga um intensificador de imagem. A microscopia de imagem ao longo da vida da fosforescência (PLIM) do O2 é comumente necessária para vários estudos, mas as plataformas atuais têm limitações em sua precisão, flexibilidade geral e usabilidade.
O sistema apresentado aqui é um imager rápido e altamente sensível, que é construído sobre um sensor óptico integrado e módulo de chip de leitura, Tpx3Cam. É mostrado para produzir sinais de fosforescência de alta intensidade e valores estáveis de vida a partir de amostras de tecido intestinal corados superficialmente ou fragmentos intraluminalmente corados do intestino grosso e permite o mapeamento detalhado dos níveis de tecido O2 em cerca de 20 s ou menos. Experimentos iniciais sobre a imagem de hipóxia em tumores enxertados em animais inconscientes também são apresentados. Também descrevemos como o imageador pode ser reconfigurado para uso com materiais sensíveis ao O2 baseados em corantes Pt-porfirina usando um LED de 390 nm para a excitação e um filtro passa-banda de 650 nm para emissão. Em geral, o imageador PLIM produziu medidas quantitativas precisas dos valores de vida útil das sondas usadas e respectivos mapas bidimensionais da concentração de O2 . Também é útil para a obtenção de imagens metabólicas de modelos teciduais ex vivo e animais vivos.

Para aplicações de imagem ex vivo , fragmentos de tecido intestinal foram corados pela aplicação tópica da sonda NanO2-IR no lado seroso do tecido. Para uma coloração mais profunda, 1 μL da sonda foi injetado no lúmen. Neste último caso, a parede intestinal de 0,2-0,25 mm de espessura protegeu a sonda da câmera. Os dois processos de coloração estão demonstrados na Figura 2A.
As imagens resultantes de intensidade e PLIM estão apresentadas na...

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Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications

Este artigo descreve o uso de um novo imageador óptico rápido para a imagem macroscópica da vida útil da fotoluminescência de amostras emissoras de decaimento longo. Os procedimentos de integração, aquisição e análise das imagens são descritos, juntamente com a preparação e caracterização dos materiais sensores para a aquisição de imagens e a aplicação do imageador no estudo de amostras biológicas.

Fluorescence Lifetime Macro Imager para aplicações biomédicas

This paper presents a new photoluminescence lifetime imager designed to map the molecular oxygen (O2) concentration in different phosphorescent samples ...

Nosso protocolo fornece mapeamento 2D detalhado da vida útil da fosforescência e da concentração de oxigênio em objetos macroscópicos, particularmente tecidos de animais vivos e animais inteiros, por meio de sondas dedicadas e materiais de detecção. Essas informações são importantes para muitas áreas de pesquisa. Nosso protocolo usa um módulo de imagem integrado e compacto que opera no modo TCSPC e fornece visualização fácil e precisa da vida útil e da distribuição de oxigênio em amostras biológicas complexas, como tecido vital.Pegue o adaptador de críquete e inspecione-o de diferentes lados. Remova o adaptador de montagem C frontal para mostrar o intensificador de PP0360EF Photonis alojado no Cricket e, em seguida, coloque o adaptador de montagem em C de volta. Remova o adaptador de montagem C frontal do Cricket e insira o filtro de emissão de 650 mais/menos 50 nanômetros.Corrija-o colocando de volta o C-mount. Em seguida, conecte o módulo de câmera de três cames TPX à parte traseira do módulo Cricket através de seus adaptadores de anel. Conecte a lente à parte frontal do módulo Cricket através do adaptador C-mount.Conecte o LED a uma fonte de alimentação e a um gerador de pulsos. Agora, monte o LED super brilhante de 390 nanômetros em um poste preso a uma protoboard dentro da caixa preta. Ligue o LED e foque-o para garantir a excitação eficaz e uniforme da amostra que está sendo fotografada.Monte o conjunto da câmera em cima da caixa preta óptica voltada para baixo em direção ao palco onde as amostras serão fotografadas. Conecte a câmera e o LED a geradores de dois pulsos e a um osciloscópio de quatro canais. Usando configurações no osciloscópio e geradores de pulsos, sincronize os pulsos enviados para a câmera e o LED.Utilize o cabo e a tomada especiais na unidade Cricket para conectar o intensificador a uma fonte de alimentação padrão e defina o ganho para 2,7 volts. Posicione a amostra antes da lente da câmera. Em seguida, ligue a câmera e todos os módulos elétricos, exceto o intensificador.Ative o software SOFI para ajustar os parâmetros operacionais, como foco e alinhamento de amostras. Nos módulos, defina a exposição de quadros como 0,01 segundos. Selecione Quadros infinitos e defina o modo de operação de pixel para tempo acima do limite.Em seguida, vá para Visualizar e selecione Módulo ativo para abrir a janela de quadros Medipix/Timepix. Na etapa seguinte, após iniciar a gravação, ajuste a escala de cores e gire a imagem para a orientação desejada. Depois disso, apague as luzes da sala e ligue o intensificador.Concentre a óptica da câmera no estágio de amostra com os recursos de foco da lente e do adaptador Cricket para gerar imagens claras de amostras com bom contraste e brilho. Quando o foco estiver concluído, feche o software SOFI. Em seguida, vá para o terminal, execute os comandos do software de design personalizado para adquirir os dados brutos no formato binário e feche o terminal.Abra um novo terminal para processar os dados adquiridos. Carregue o arquivo de dados e execute o redutor de dados. Analise os dados pós-processo com um programa dedicado escrito em linguagem C que gravará os dados em um arquivo de imagem ICS.Posteriormente, abra os arquivos de imagem ICS usando o software Time Resolved Imaging disponível gratuitamente e use duas funções exponenciais para ajustar os decaimentos de fosforescência. Por fim, abra o Fitted. Arquivos de imagem ICS com o software de análise de imagem disponível.Gere imagens de vida útil de fosforescência usando tabelas de pesquisa e codifique-as em pseudoescala de cores. Utilize a função Medir para calcular os valores médios de tempo de vida para toda a imagem ou regiões de interesse. Imagens de microscopia de imagem de intensidade de fosforescência e tempo de vida de fosforescência do ponto sensor do corante octaetilporfirina de platina nos estados oxigenado e desoxigenado são mostradas.Certifique-se de que o filtro de emissão correto esteja montado dentro do Cricket e que o LED, as conexões de cabo e as configurações de pulso corretos sejam usados. Atualmente, esse protocolo é limitado a modelos animais, mas potencialmente pode ser aplicado para diagnosticar e tratar estados patológicos associados à hipóxia tecidual, como câncer, acidente vascular cerebral e inflamação.

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