Name: fluorescence lifetime macro imager for biomedical applications
Uploaded: 2023-04-07T12:30:00
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Se agradece el apoyo financiero para este trabajo de la Science Foundation Ireland, las subvenciones SFI/12/RC/2276_P2, SFI/17/RC-PhD/3484 y 18/SP/3522, y Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland).

Todos los procedimientos con animales se realizaron bajo autorizaciones emitidas por la Autoridad Reguladora de Productos Sanitarios (HPRA, Irlanda) de acuerdo con la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas (2010/63/UE) y fueron aprobados por el Comité de Ética de Experimentación Animal del University College Cork.
1. Preparación de la muestra
<ol><li>Tinción con la sonda de muestras de tejido vivo ex vivo<ol><li>Para aplicaciones ex vivo , u...

<ol>
	<li>Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+oxygen+and+hypoxia+in+cell+and+tissue+samples.">Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).</li><li>Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+is+the+partial+oxygen+pressure+of+human+tissues+a+crucial+parameter?+Small+molecules+and+hypoxia.">Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 15 (6), 1239-1253 (2011).</li><li>Yoshihara, T., Hirakawa, Y., Hosaka, M., Nangaku, M., Tobita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+imaging+of+living+cells+and+tissues+using+luminescent+molecular+probes.">Oxygen imaging of living cells and tissues using luminescent molecular probes.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews. 30, 71-95 (2017).</li><li>Papkovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescence+based+oxygen+sensors+essential+tools+for+cell+biology+and+life+science+research.">Phosphorescence based oxygen sensors essential tools for cell biology and life science research.</a> 17th International Meeting on Chemical Sensors - IMCS. , 71-72 (2018).</li><li>Tsytsarev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+brain+metabolism+activity+using+a+phosphorescent+oxygen-sensitive+probe.">In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe.</a> Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).</li><li>O'Donovan, C., Hynes, J., Yashunski, D., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescent+oxygen-sensitive+materials+for+biological+applications.">Phosphorescent oxygen-sensitive materials for biological applications.</a> Journal of Materials Chemistry. 15, 2946-2951 (2005).</li><li>Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+probes+and+techniques+for+O+2+measurement+in+live+cells+and+tissue.">Optical probes and techniques for O 2 measurement in live cells and tissue.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (12), 2025-2039 (2012).</li><li>Papkovsky, D. B., Zhdanov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescence+based+oxygen+sensors+and+probes+for+biomedical+research.">Phosphorescence based oxygen sensors and probes for biomedical research.</a> Advanced Environmental, Chemical, and Biological Sensing Technologies XIV. 10215, 102150 (2017).</li><li>Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+phosphorescence:+A+novel+method+for+measuring+oxygen+distribution+in+perfused+tissue.">Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue.</a> Science. 241 (4873), 1649-1651 (1988).</li><li>Hogan, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescence+quenching+method+for+measurement+of+intracellular+PO+2+in+isolated+skeletal+muscle+fibers.">Phosphorescence quenching method for measurement of intracellular PO 2 in isolated skeletal muscle fibers.</a> Journal of Applied Physiology. 86 (2), 720-724 (1999).</li><li>Apreleva, S. V., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomographic+imaging+of+oxygen+by+phosphorescence+lifetime.">Tomographic imaging of oxygen by phosphorescence lifetime.</a> Applied Optics. 45 (33), 8547-8559 (2006).</li><li>Becker, W., Shcheslavskiy, V., R&#252;ck, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+phosphorescence+and+fluorescence+lifetime+imaging+by+multi-dimensional+TCSPC+and+multi-pulse+excitation.">Simultaneous phosphorescence and fluorescence lifetime imaging by multi-dimensional TCSPC and multi-pulse excitation.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 19-30 (2017).</li><li>Wolfbeis, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescent+sensing+and+imaging+of+oxygen:+Fierce+competition+to+the+Clark+electrode.">Luminescent sensing and imaging of oxygen: Fierce competition to the Clark electrode.</a> BioEssays. 37 (8), 921-928 (2015).</li><li>Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+neurosphere+oxygenation+with+phosphorescent+probes.">Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes.</a> Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).</li><li>Shcheslavskiy, V. I., Neubauer, A., Bukowiecki, R., Dinter, F., Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+fluorescence+and+phosphorescence+lifetime+imaging.">Combined fluorescence and phosphorescence lifetime imaging.</a> Applied Physics Letters. 108, 091111 (2016).</li><li>Babilas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+phosphorescence+imaging+of+pO2+using+planar+oxygen+sensors.">In vivo phosphorescence imaging of pO2 using planar oxygen sensors.</a> Microcirculation. 12 (6), 477-487 (2005).</li><li>Babilas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+pO2+imaging+during+tourniquet-induced+forearm+ischemia+using+planar+optical+oxygen+sensors.">Transcutaneous pO2 imaging during tourniquet-induced forearm ischemia using planar optical oxygen sensors.</a> Skin Research and Technology. 14 (3), 304-311 (2008).</li><li>Golub, A. S., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PO2+measurements+in+the+microcirculation+using+phosphorescence+quenching+microscopy+at+high+magnification.">PO2 measurements in the microcirculation using phosphorescence quenching microscopy at high magnification.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2905-2916 (2008).</li><li>Zhdanov, A. V., Golubeva, A. V., Okkelman, I. A., Cryan, J. F., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+oxygen+gradients+in+giant+umbrella+cells:+An+ex+vivo+PLIM+study.">Imaging of oxygen gradients in giant umbrella cells: An ex vivo PLIM study.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 309 (7), 501-509 (2015).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+-+Techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging - Techniques and applications.</a> Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).</li><li>Jenkins, J., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B., Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cell+and+tissue+O+2+by+TCSPC-PLIM.">Imaging cell and tissue O 2 by TCSPC-PLIM.</a> Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Applications. , 225-247 (2015).</li><li>Becker, W., K&#246;nig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+TCSPC-FLIM+techniques.">Advanced TCSPC-FLIM techniques.</a> Multiphoton Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging: Applications in Biology and Medicine. , 23-52 (2018).</li><li>Wei, L., Yan, W., Ho, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+fluorescence+lifetime+analytical+microsystems:+Contact+optics+and+CMOS+time-resolved+electronics.">Recent advances in fluorescence lifetime analytical microsystems: Contact optics and CMOS time-resolved electronics.</a> Sensors. 17 (12), 2800 (2017).</li><li>Hirvonen, L. M., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wide-field+TCSPC:+Methods+and+applications.">Wide-field TCSPC: Methods and applications.</a> Measurement Science and Technology. 28, 012003 (2017).</li><li>Hirvonen, L. M., Festy, F., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wide-field+time-correlated+single-photon+counting+(TCSPC)+lifetime+microscopy+with+microsecond+time+resolution.">Wide-field time-correlated single-photon counting (TCSPC) lifetime microscopy with microsecond time resolution.</a> Optics Letters. 39 (19), 5602 (2014).</li><li>Sparks, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+new+gated+optical+image+intensifiers+for+fluorescence+lifetime+imaging.">Characterisation of new gated optical image intensifiers for fluorescence lifetime imaging.</a> Review of Scientific Instruments. 88 (1), 013707 (2017).</li><li>Chelushkin, P. S., Tunik, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Progress in Photon Science: Emerging New Directions. 115, (2017).</li><li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+macro-imager+based+on+Tpx3Cam+optical+camera+for+PLIM+applications.">A new macro-imager based on Tpx3Cam optical camera for PLIM applications.</a> Proceedings of SPIE. , 113591 (2020).</li><li>Fisher-Levine, M., Nomerotski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TimepixCam:+A+fast+optical+imager+with+time-stamping.">TimepixCam: A fast optical imager with time-stamping.</a> Journal of Instrumentation. 11, (2016).</li><li>Nomerotski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+time+stamping+of+photons+with+nanosecond+resolution+in+Timepix+based+optical+cameras.">Imaging and time stamping of photons with nanosecond resolution in Timepix based optical cameras.</a> Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 937. 937, 26-30 (2019).</li><li>Poikela, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timepix3:+A+65K+channel+hybrid+pixel+readout+chip+with+simultaneous+ToA/ToT+and+sparse+readout.">Timepix3: A 65K channel hybrid pixel readout chip with simultaneous ToA/ToT and sparse readout.</a> Journal of Instrumentation. 9, 05013 (2014).</li><li>Nomerotski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+TimepixCam,+a+fast+imager+for+the+time-stamping+of+optical+photons.">Characterization of TimepixCam, a fast imager for the time-stamping of optical photons.</a> Journal of Instrumentation. 12, 01017 (2017).</li><li>Hirvonen, L. M., Fisher-Levine, M., Suhling, K., Nomerotski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photon+counting+phosphorescence+lifetime+imaging+with+TimepixCam.">Photon counting phosphorescence lifetime imaging with TimepixCam.</a> Review of Scientific Instruments. 88, 013104 (2017).</li><li>Visser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDR:+A+read-out+system+for+Medipix3+&amp;+Timepix3.">SPIDR: A read-out system for Medipix3 &amp; Timepix3.</a> Journal of Instrumentation. 10, 12028 (2015).</li><li>Tsytsarev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+brain+metabolism+activity+using+a+phosphorescent+oxygen-sensitive+probe.">In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe.</a> Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).</li><li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+O2+concentration+in+ex-vivo+tissue+samples+on+a+fast+PLIM+macro-imager.">Mapping O2 concentration in ex-vivo tissue samples on a fast PLIM macro-imager.</a> Scientific Reports. 10, 19006 (2020).</li><li>Kersemans, V., Cornelissen, B., Allen, P. D., Beech, J. S., Smart, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+tumor+volume+measurement+in+the+awake,+manually+restrained+mouse+using+MRI.">Subcutaneous tumor volume measurement in the awake, manually restrained mouse using MRI.</a> Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (6), 1499-1504 (2013).</li><li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+luminescence+lifetime+macro-imager+based+on+a+Tpx3Cam+optical+camera.">New luminescence lifetime macro-imager based on a Tpx3Cam optical camera.</a> Biomedical Optics Express. 11 (1), 77-88 (2020).</li><li>Papkovsky, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescent+polymer+films+for+optical+oxygen+sensors.">Phosphorescent polymer films for optical oxygen sensors.</a> Biosensors and Bioelectronics. 7 (3), 199-206 (1992).</li><li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+planar+phosphorescence+based+oxygen+sensors+on+a+TCSPC-PLIM+macro-imager.">Characterization of planar phosphorescence based oxygen sensors on a TCSPC-PLIM macro-imager.</a> Sensors and Actuators, B: Chemical. 321, 128459 (2020).</li><li>Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Berndt, K. W., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging.">Fluorescence lifetime imaging.</a> Analytical Biochemistry. 202 (2), 316-330 (1992).</li></ol>

Los protocolos anteriores ofrecen una descripción detallada del montaje del nuevo generador de imágenes y su funcionamiento en el modo FLIM/PLIM de microsegundos. La cámara Tpx3Cam de nueva generación basada en TCSPC, acoplada por medio del adaptador optomecánico Cricket con el intensificador de imagen, el filtro de emisión y la lente macro, produce un módulo óptico estable, compacto y flexible que es fácil de operar. Se demostró que el generador de imágenes funciona bien con una variedad de muestras diferente...

El O2 es uno de los parámetros ambientales clave para los sistemas vivos, y el conocimiento de la distribución delO2 y su dinámica es importante para muchos estudios biológicos 1,2,3. La evaluación de la oxigenación tisular por medio de sondas fosforescentes 4,5,6,7,8 y PLIM 9,10,11,12,13 están ganando popularidad en la investigación biológica y médica 3,9,14,15,16, 17,18,19. Esto se debe a que PLIM, a diferencia de las mediciones de intensidad de fluorescencia o fosforescencia, no se ve afectado por factores externos como la concentración de la sonda, el fotoblanqueo, la intensidad de excitación, la alineación óptica, la dispersión y la autofluorescencia.
Sin embargo, las plataformas actuales de O2 PLIM están limitadas por su sensibilidad, velocidad de adquisición de imágenes, precisión y usabilidad general. El conteo de fotones únicos correlacionados en el tiempo (TCSPC), combinado con un procedimiento de escaneo ráster, se utiliza con frecuencia en dispositivos PLIM y microscopía de imágenes de fluorescencia (FLIM)20,21,22. Sin embargo, dado que PLIM requiere un largo tiempo de permanencia en píxeles (en el rango de milisegundos), el tiempo de adquisición de imágenes es mucho más largo que el requerido para las aplicaciones FLIM20,22,23. Otras técnicas, como las cámaras CCD/CMOS cerradas, carecen de sensibilidad de fotón único y tienen bajas velocidades de cuadro20,24,25,26. Además, los sistemas PLIM existentes se utilizan principalmente en formato microscópico, mientras que los sistemas macroscópicos son menos comunes27.
El generador de imágenes macro PLIM28 basado en TCSPC se creó para superar muchas de estas limitaciones. El diseño del generador de imágenes se vio facilitado en gran medida por el uso de un nuevo adaptador optomecánico, Cricket, que tiene lo siguiente: i) dos adaptadores de montura C, que proporcionan un fácil acoplamiento del módulo de la cámara en la parte posterior y la lente del objetivo en la parte frontal; ii) una carcasa interna para un intensificador de imagen y una toma de corriente para este último en el lado exterior del Cricket; iii) un espacio interno detrás del adaptador frontal de montura C donde se puede alojar un filtro de emisión estándar de 25 mm delante del intensificador; y iv) una óptica de colisión de luz incorporada con reguladores de anillo, que permiten la alineación / enfoque óptico entre la lente y la cámara para producir imágenes nítidas en el chip de la cámara.
En el generador de imágenes ensamblado, el módulo de la cámara está acoplado a la parte posterior del adaptador Cricket, que también alberga un intensificador de imagen que consiste en un fotocátodo seguido de una placa de microcanal (MCP), un amplificador y un centelleador rápido, fósforo P47. Un filtro de emisión de 760 nm ± 50 nm está instalado dentro del Cricket, y una lente objetiva, NMV-50M11'', está conectada al adaptador frontal de montura C. Finalmente, la lente y la cámara están alineadas ópticamente con reguladores de anillo.
El papel del intensificador es detectar fotones entrantes y convertirlos en ráfagas rápidas de luz en el chip de la cámara, que se registran y utilizan para generar decaimientos de emisión e imágenes de por vida. El módulo de cámara comprende una matriz avanzada de sensores ópticos basados en TCSPC (256 píxeles x 256 píxeles) y un chip de lectura de nueva generación 29,30,31,32,33, que permiten el registro simultáneo de la hora de llegada (TOA) y el tiempo sobre umbral (TOT) de ráfagas de fotones en cada píxel del chip de imagen con una resolución de tiempo de 1,6 ns y una velocidad de lectura de 80 Mpixel/s.
En esta configuración, la cámara con el intensificador tiene sensibilidad de fotón único. Está basado en datos y se basa en el sistema de lectura rápida del detector de píxeles (SPIDR)34. La resolución espacial del generador de imágenes se caracterizó previamente con sensores fosforescentes planos deO2 y una máscara de placa de resolución. La función de respuesta del instrumento (IRF) se midió mediante la obtención de imágenes de un sensor fluorescente plano bajo la misma configuración que se utilizó para todas las demás mediciones. La vida útil del tinte de alrededor de 2,6 ns fue lo suficientemente corta como para ser utilizado para la medición IRF en modo PLIM. El generador de imágenes puede obtener imágenes de objetos de hasta 18 mm x 18 mm de tamaño con resoluciones espaciales y temporales de 39,4 μm y 30,6 ns (ancho completo a la mitad como máximo), respectivamente28.
Los siguientes protocolos describen el ensamblaje del macrogenerador de imágenes y su posterior uso para mapear la concentración de O2 en muestras biológicas teñidas con la sonda de O2 en el infrarrojo cercano previamente caracterizada,NanO2-IR 35. La sonda es una sonda de detección deO2 brillante, fotoestable y permeable a las células basada en colorante benzoporfirina (PtBP) de platino (II). Es excitable a 625 nm, emite a 760 nm y proporciona una respuesta óptica robusta al O2 en el rango fisiológico (0%-21% o 0-210 μM deO2). También se ha demostrado que el generador de imágenes caracteriza diferentes materiales de sensores basados en colorantes de porfirina Pt (II). En general, el generador de imágenes es compacto y flexible, similar a una cámara fotográfica común. En la configuración actual, el generador de imágenes es apropiado para diferentes aplicaciones PLIM de campo amplio. La sustitución del LED con una fuente láser rápida mejorará aún más el rendimiento del generador de imágenes y podría permitir aplicaciones FLIM de nanosegundos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>627 nm LED</td>
			<td>Parts Express</td>
			<td></td>
			<td>Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>760 &#177; 50 nm emission filter</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>84-788</td>
			<td>Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 &#177; 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balb/c mice</td>
			<td>Envigo, UK</td>
			<td>Balb/c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black box</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25C9/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cricket Adapter</td>
			<td>Photonis</td>
			<td>Cricket-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CT26 cells&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CT26.WT</td>
			<td>https://www.atcc.org/products/crl-2638</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0697</td>
			<td>Other media can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen</td>
			<td>Photonis</td>
			<td>PP0360EF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900.300</td>
			<td>35 mm diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar plastic film, 75 micron&#160;</td>
			<td>RS Ireland</td>
			<td>785-0795</td>
			<td>Othe plastic substrates can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanO2-IR</td>
			<td>home-made</td>
			<td>n/a</td>
			<td>The probe can be synthesised according to the published method &#39;Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.&#39; or provided by our lab.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMV-50M11&#8221; 50 mm lens</td>
			<td>Navitar</td>
			<td></td>
			<td>Other lenses compatibel with C-mount adators can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB1836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1472.001</td>
			<td>92 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Supply</td>
			<td>Tenma</td>
			<td>72-10495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse Generator</td>
			<td>Tenma</td>
			<td>TGP110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sophy</td>
			<td>Amsterdam Scientific Instruments</td>
			<td>n/z</td>
			<td>Provided by ASI together with the Tpx3Cam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tpx3Cam</td>
			<td>Amsterdam Scientific Instruments</td>
			<td>TPXCAM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri2 Software</td>
			<td>University of Oxford</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ Translation Stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LT3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence lifetime macro imager for biomedical applications

Este artículo presenta un nuevo generador de imágenes de vida útil de fotoluminiscencia diseñado para mapear la concentración de oxígeno molecular (O2) en diferentes muestras fosforescentes que van desde recubrimientos de estado sólido sensibles al O2 hasta muestras de tejido animal vivo teñidas con sondas solubles sensibles alO2. En particular, se utilizó la sonda de infrarrojo cercano basada en nanopartículas NanO2-IR, que es excitable con un diodo emisor de luz (LED) de 625 nm y emite a 760 nm. El sistema de imágenes se basa en la cámara Timepix3 (Tpx3Cam) y el adaptador optomecánico, que también alberga un intensificador de imagen. La microscopía de imágenes de por vida de fosforescencia (PLIM) deO2 se requiere comúnmente para varios estudios, pero las plataformas actuales tienen limitaciones en su precisión, flexibilidad general y facilidad de uso.
El sistema presentado aquí es un generador de imágenes rápido y altamente sensible, que se basa en un sensor óptico integrado y un módulo de chip de lectura, Tpx3Cam. Se ha demostrado que produce señales de fosforescencia de alta intensidad y valores estables de vida útil a partir de muestras de tejido intestinal teñido superficialmente o fragmentos teñidos intraluminalmente del intestino grueso y permite el mapeo detallado de los niveles deO2 tisular en aproximadamente 20 s o menos. También se presentan experimentos iniciales sobre la imagen de hipoxia en tumores injertados en animales inconscientes. También describimos cómo se puede reconfigurar el generador de imágenes para su uso con materiales sensibles alO2 basados en colorantes de porfirina Pt utilizando un LED de 390 nm para la excitación y un filtro de paso de banda de 650 nm para la emisión. En general, se encontró que el generador de imágenes PLIM produce mediciones cuantitativas precisas de los valores de vida útil para las sondas utilizadas y los respectivos mapas bidimensionales de la concentración deO2 . También es útil para la obtención de imágenes metabólicas de modelos de tejidos ex vivo y animales vivos.

Para aplicaciones de imágenes ex vivo , se tiñeron fragmentos de tejidos intestinales mediante la aplicación tópica de la sonda NanO2-IR en el lado serosal del tejido. Para una tinción más profunda, se inyectó 1 μL de la sonda en el lumen. En este último caso, la pared intestinal de 0,2-0,25 mm de espesor protegía la sonda de la cámara. Los dos procesos de tinción se muestran en la Figura 2A.
La intensidad resultante y las imágenes PLIM se pr...

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Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications

Este artículo describe el uso de un nuevo y rápido generador de imágenes ópticas para la obtención de imágenes macroscópicas de la vida útil de la fotoluminiscencia de muestras que emiten descomposición larga. Se describen los procedimientos de integración, adquisición de imágenes y análisis, junto con la preparación y caracterización de los materiales del sensor para la obtención de imágenes y la aplicación del generador de imágenes en el estudio de muestras biológicas.

Macro Imager de vida útil de fluorescencia para aplicaciones biomédicas

This paper presents a new photoluminescence lifetime imager designed to map the molecular oxygen (O2) concentration in different phosphorescent samples ...

Nuestro protocolo proporciona un mapeo 2D detallado de la vida útil de la fosforescencia y la concentración de oxígeno en objetos macroscópicos, particularmente tejido animal vivo y animales enteros, por medio de sondas dedicadas y materiales de detección. Esta información es importante para muchas áreas de investigación. Nuestro protocolo utiliza un módulo de imágenes integrado y compacto que funciona en modo TCSPC y proporciona una visualización fácil y precisa de la vida útil y la distribución de oxígeno en muestras biológicas complejas, como el tejido vital.Tome el adaptador Cricket e inspecciónelo desde diferentes lados. Retire el adaptador de montura C frontal para mostrar el intensificador de PP0360EF Photonis alojado en el Cricket y, a continuación, vuelva a colocar el adaptador de montura C. Retire el adaptador de montura C frontal del Cricket e inserte el filtro de emisión de 650 más/menos 50 nanómetros.Arreglarlo volviendo a colocar la montura C. Luego, conecte el módulo de cámara TPX de tres cámaras a la parte posterior del módulo Cricket a través de sus adaptadores de anillo. Conecte la lente a la parte frontal del módulo Cricket a través del adaptador de montura C.Conecte el LED a una fuente de alimentación y a un generador de pulsos. Ahora, monte el LED súper brillante de 390 nanómetros en un poste conectado a una placa de pruebas dentro de la caja negra. Encienda el LED y enfóquelo para garantizar una excitación efectiva y uniforme de la muestra que se está fotografiando.Monte el conjunto de la cámara en la parte superior de la caja negra óptica hacia abajo hacia el escenario donde se tomarán las imágenes. Conecte la cámara y el LED a generadores de dos pulsos y a un osciloscopio de cuatro canales. Utilizando los ajustes del osciloscopio y los generadores de pulsos, sincronice los pulsos enviados a la cámara y al LED.Utilice el cable especial y el enchufe de la unidad Cricket para conectar el intensificador a una fuente de alimentación estándar y ajustar la ganancia a 2,7 voltios. Coloque la muestra delante de la lente de la cámara. A continuación, encienda la cámara y todos los módulos eléctricos, excepto el intensificador.Active el software SOFI para ajustar los parámetros operativos, como el enfoque y la alineación de muestras. En los módulos, establezca la exposición del fotograma en 0,01 segundos. Seleccione Fotogramas infinitos y establezca el modo de operación de píxeles en tiempo por encima del umbral.Luego, vaya a Vista previa y seleccione Módulo activo para abrir la ventana de marcos Medipix / Timepix. En el siguiente paso, después de iniciar la grabación, ajuste la escala de color y gire la imagen a la orientación deseada. Después de eso, apague las luces de la habitación y encienda el intensificador.Enfoque la óptica de la cámara en la etapa de muestra con las capacidades de enfoque de la lente y el adaptador Cricket para generar imágenes claras de muestras con buen contraste y brillo. Una vez completado el enfoque, cierre el software SOFI. Luego, vaya al terminal, ejecute los comandos del software de diseño personalizado para adquirir los datos en bruto en formato binario y cierre el terminal.Abra un nuevo terminal para procesar los datos adquiridos. Cargue el archivo de datos y ejecute el reductor de datos. Analice los datos posteriores al proceso con un programa dedicado escrito en lenguaje C que escribirá los datos en un archivo de imagen ICS.Posteriormente, abra los archivos de imagen ICS utilizando el software Time Resolved Imaging disponible gratuitamente y use dos funciones exponenciales para adaptarse a las desintegraciones de fosforescencia. Por último, abra el Instalado. Archivos de imagen ICS con el software de análisis de imágenes disponible.Genere imágenes de vida útil de fosforescencia utilizando tablas de búsqueda y codifique en pseudo escala de color. Utilice la función Medir para calcular los valores de vida útil promedio para toda la imagen o regiones de interés. Se muestran imágenes de microscopía de imágenes de intensidad de fosforescencia y vida útil de la fosforescencia del punto sensor de colorante octaetilporfirina de platino en los estados oxigenado y desoxigenado.Asegúrese de que el filtro de emisión correcto esté montado dentro del Cricket y que se utilicen los ajustes correctos de LED, conexiones de cable y pulsos. Actualmente, este protocolo se limita a modelos animales, pero potencialmente se puede aplicar para diagnosticar y tratar estados patológicos asociados con la hipoxia tisular, como cáncer, accidente cerebrovascular e inflamación.

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