Name: fluorescence lifetime macro imager for biomedical applications
Uploaded: 2023-04-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications at JoVE.com

İrlanda Bilim Vakfı'ndan bu çalışma için mali destek, SFI / 12 / RC / 2276_P2, SFI / 17 / RC-PhD / 3484 ve 18 / SP / 3522 ve Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland) için minnetle kabul edilmektedir.

Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler, Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi (2010/63/EU) uyarınca Sağlık Ürünleri Düzenleme Kurumu (HPRA, İrlanda) tarafından verilen izinler altında gerçekleştirilmiş ve University College Cork Hayvan Deneyleri Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Numune hazırlama
<ol><li>Canlı doku örneklerinin ex vivo probu ile boyanması<ol><li>Ex vivo uygulamalar için, 4 haftalık dişi Balb / c farelerinden ta...

<ol>
	<li>Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+oxygen+and+hypoxia+in+cell+and+tissue+samples.">Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).</li><li>Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+is+the+partial+oxygen+pressure+of+human+tissues+a+crucial+parameter?+Small+molecules+and+hypoxia.">Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 15 (6), 1239-1253 (2011).</li><li>Yoshihara, T., Hirakawa, Y., Hosaka, M., Nangaku, M., Tobita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+imaging+of+living+cells+and+tissues+using+luminescent+molecular+probes.">Oxygen imaging of living cells and tissues using luminescent molecular probes.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews. 30, 71-95 (2017).</li><li>Papkovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescence+based+oxygen+sensors+essential+tools+for+cell+biology+and+life+science+research.">Phosphorescence based oxygen sensors essential tools for cell biology and life science research.</a> 17th International Meeting on Chemical Sensors - IMCS. , 71-72 (2018).</li><li>Tsytsarev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+brain+metabolism+activity+using+a+phosphorescent+oxygen-sensitive+probe.">In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe.</a> Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).</li><li>O'Donovan, C., Hynes, J., Yashunski, D., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescent+oxygen-sensitive+materials+for+biological+applications.">Phosphorescent oxygen-sensitive materials for biological applications.</a> Journal of Materials Chemistry. 15, 2946-2951 (2005).</li><li>Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+probes+and+techniques+for+O+2+measurement+in+live+cells+and+tissue.">Optical probes and techniques for O 2 measurement in live cells and tissue.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (12), 2025-2039 (2012).</li><li>Papkovsky, D. B., Zhdanov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescence+based+oxygen+sensors+and+probes+for+biomedical+research.">Phosphorescence based oxygen sensors and probes for biomedical research.</a> Advanced Environmental, Chemical, and Biological Sensing Technologies XIV. 10215, 102150 (2017).</li><li>Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+phosphorescence:+A+novel+method+for+measuring+oxygen+distribution+in+perfused+tissue.">Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue.</a> Science. 241 (4873), 1649-1651 (1988).</li><li>Hogan, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescence+quenching+method+for+measurement+of+intracellular+PO+2+in+isolated+skeletal+muscle+fibers.">Phosphorescence quenching method for measurement of intracellular PO 2 in isolated skeletal muscle fibers.</a> Journal of Applied Physiology. 86 (2), 720-724 (1999).</li><li>Apreleva, S. V., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomographic+imaging+of+oxygen+by+phosphorescence+lifetime.">Tomographic imaging of oxygen by phosphorescence lifetime.</a> Applied Optics. 45 (33), 8547-8559 (2006).</li><li>Becker, W., Shcheslavskiy, V., R&#252;ck, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+phosphorescence+and+fluorescence+lifetime+imaging+by+multi-dimensional+TCSPC+and+multi-pulse+excitation.">Simultaneous phosphorescence and fluorescence lifetime imaging by multi-dimensional TCSPC and multi-pulse excitation.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 19-30 (2017).</li><li>Wolfbeis, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescent+sensing+and+imaging+of+oxygen:+Fierce+competition+to+the+Clark+electrode.">Luminescent sensing and imaging of oxygen: Fierce competition to the Clark electrode.</a> BioEssays. 37 (8), 921-928 (2015).</li><li>Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+neurosphere+oxygenation+with+phosphorescent+probes.">Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes.</a> Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).</li><li>Shcheslavskiy, V. I., Neubauer, A., Bukowiecki, R., Dinter, F., Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+fluorescence+and+phosphorescence+lifetime+imaging.">Combined fluorescence and phosphorescence lifetime imaging.</a> Applied Physics Letters. 108, 091111 (2016).</li><li>Babilas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+phosphorescence+imaging+of+pO2+using+planar+oxygen+sensors.">In vivo phosphorescence imaging of pO2 using planar oxygen sensors.</a> Microcirculation. 12 (6), 477-487 (2005).</li><li>Babilas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+pO2+imaging+during+tourniquet-induced+forearm+ischemia+using+planar+optical+oxygen+sensors.">Transcutaneous pO2 imaging during tourniquet-induced forearm ischemia using planar optical oxygen sensors.</a> Skin Research and Technology. 14 (3), 304-311 (2008).</li><li>Golub, A. S., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PO2+measurements+in+the+microcirculation+using+phosphorescence+quenching+microscopy+at+high+magnification.">PO2 measurements in the microcirculation using phosphorescence quenching microscopy at high magnification.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2905-2916 (2008).</li><li>Zhdanov, A. V., Golubeva, A. V., Okkelman, I. A., Cryan, J. F., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+oxygen+gradients+in+giant+umbrella+cells:+An+ex+vivo+PLIM+study.">Imaging of oxygen gradients in giant umbrella cells: An ex vivo PLIM study.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 309 (7), 501-509 (2015).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+-+Techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging - Techniques and applications.</a> Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).</li><li>Jenkins, J., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B., Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cell+and+tissue+O+2+by+TCSPC-PLIM.">Imaging cell and tissue O 2 by TCSPC-PLIM.</a> Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Applications. , 225-247 (2015).</li><li>Becker, W., K&#246;nig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+TCSPC-FLIM+techniques.">Advanced TCSPC-FLIM techniques.</a> Multiphoton Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging: Applications in Biology and Medicine. , 23-52 (2018).</li><li>Wei, L., Yan, W., Ho, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+fluorescence+lifetime+analytical+microsystems:+Contact+optics+and+CMOS+time-resolved+electronics.">Recent advances in fluorescence lifetime analytical microsystems: Contact optics and CMOS time-resolved electronics.</a> Sensors. 17 (12), 2800 (2017).</li><li>Hirvonen, L. M., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wide-field+TCSPC:+Methods+and+applications.">Wide-field TCSPC: Methods and applications.</a> Measurement Science and Technology. 28, 012003 (2017).</li><li>Hirvonen, L. M., Festy, F., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wide-field+time-correlated+single-photon+counting+(TCSPC)+lifetime+microscopy+with+microsecond+time+resolution.">Wide-field time-correlated single-photon counting (TCSPC) lifetime microscopy with microsecond time resolution.</a> Optics Letters. 39 (19), 5602 (2014).</li><li>Sparks, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+new+gated+optical+image+intensifiers+for+fluorescence+lifetime+imaging.">Characterisation of new gated optical image intensifiers for fluorescence lifetime imaging.</a> Review of Scientific Instruments. 88 (1), 013707 (2017).</li><li>Chelushkin, P. S., Tunik, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Progress in Photon Science: Emerging New Directions. 115, (2017).</li><li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+macro-imager+based+on+Tpx3Cam+optical+camera+for+PLIM+applications.">A new macro-imager based on Tpx3Cam optical camera for PLIM applications.</a> Proceedings of SPIE. , 113591 (2020).</li><li>Fisher-Levine, M., Nomerotski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TimepixCam:+A+fast+optical+imager+with+time-stamping.">TimepixCam: A fast optical imager with time-stamping.</a> Journal of Instrumentation. 11, (2016).</li><li>Nomerotski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+time+stamping+of+photons+with+nanosecond+resolution+in+Timepix+based+optical+cameras.">Imaging and time stamping of photons with nanosecond resolution in Timepix based optical cameras.</a> Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 937. 937, 26-30 (2019).</li><li>Poikela, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timepix3:+A+65K+channel+hybrid+pixel+readout+chip+with+simultaneous+ToA/ToT+and+sparse+readout.">Timepix3: A 65K channel hybrid pixel readout chip with simultaneous ToA/ToT and sparse readout.</a> Journal of Instrumentation. 9, 05013 (2014).</li><li>Nomerotski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+TimepixCam,+a+fast+imager+for+the+time-stamping+of+optical+photons.">Characterization of TimepixCam, a fast imager for the time-stamping of optical photons.</a> Journal of Instrumentation. 12, 01017 (2017).</li><li>Hirvonen, L. M., Fisher-Levine, M., Suhling, K., Nomerotski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photon+counting+phosphorescence+lifetime+imaging+with+TimepixCam.">Photon counting phosphorescence lifetime imaging with TimepixCam.</a> Review of Scientific Instruments. 88, 013104 (2017).</li><li>Visser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDR:+A+read-out+system+for+Medipix3+&amp;+Timepix3.">SPIDR: A read-out system for Medipix3 &amp; Timepix3.</a> Journal of Instrumentation. 10, 12028 (2015).</li><li>Tsytsarev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+brain+metabolism+activity+using+a+phosphorescent+oxygen-sensitive+probe.">In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe.</a> Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).</li><li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+O2+concentration+in+ex-vivo+tissue+samples+on+a+fast+PLIM+macro-imager.">Mapping O2 concentration in ex-vivo tissue samples on a fast PLIM macro-imager.</a> Scientific Reports. 10, 19006 (2020).</li><li>Kersemans, V., Cornelissen, B., Allen, P. D., Beech, J. S., Smart, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+tumor+volume+measurement+in+the+awake,+manually+restrained+mouse+using+MRI.">Subcutaneous tumor volume measurement in the awake, manually restrained mouse using MRI.</a> Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (6), 1499-1504 (2013).</li><li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+luminescence+lifetime+macro-imager+based+on+a+Tpx3Cam+optical+camera.">New luminescence lifetime macro-imager based on a Tpx3Cam optical camera.</a> Biomedical Optics Express. 11 (1), 77-88 (2020).</li><li>Papkovsky, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorescent+polymer+films+for+optical+oxygen+sensors.">Phosphorescent polymer films for optical oxygen sensors.</a> Biosensors and Bioelectronics. 7 (3), 199-206 (1992).</li><li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+planar+phosphorescence+based+oxygen+sensors+on+a+TCSPC-PLIM+macro-imager.">Characterization of planar phosphorescence based oxygen sensors on a TCSPC-PLIM macro-imager.</a> Sensors and Actuators, B: Chemical. 321, 128459 (2020).</li><li>Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Berndt, K. W., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging.">Fluorescence lifetime imaging.</a> Analytical Biochemistry. 202 (2), 316-330 (1992).</li></ol>

Yukarıdaki protokoller, yeni görüntüleyicinin montajının ve mikrosaniye FLIM/PLIM modunda çalışmasının ayrıntılı bir açıklamasını verir. TCSPC tabanlı yeni nesil Tpx3Cam kamera, görüntü yoğunlaştırıcı, emisyon filtresi ve makro lens ile opto-mekanik adaptör Cricket ile birleştiğinde, kullanımı kolay, kararlı, kompakt ve esnek bir optik modül üretir. Görüntüleyicinin, fosforlu malzemelerin karakterizasyonu ve canlı dokuO2 görüntülemeyi içeren bir dizi farklı numune ve...

O2, canlı sistemler için anahtar çevresel parametrelerden biridir veO2'nin dağılımı ve dinamikleri hakkında bilgi sahibi olmak birçok biyolojik çalışma için önemlidir 1,2,3. Doku oksijenasyonununfosforlu problar 4,5,6,7,8 ve PLIM 9,10,11,12,13 ile değerlendirilmesi biyolojik ve tıbbi araştırmalarda popülerlik kazanmaktadır 3,9,14,15,16, 17,18,19. Bunun nedeni, PLIM'in, floresan veya fosforesans yoğunluğu ölçümlerinin aksine, prob konsantrasyonu, fotobeyazlatma, uyarma yoğunluğu, optik hizalama, saçılma ve otofloresan gibi dış faktörlerden etkilenmemesidir.
Bununla birlikte, mevcut O2 PLIM platformları hassasiyetleri, görüntü yakalama hızları, doğrulukları ve genel kullanılabilirlikleri ile sınırlıdır. Zaman korelasyonlu tek foton sayımı (TCSPC), raster tarama prosedürü ile birlikte, PLIM ve floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu (FLIM) cihazlarında sıklıkla kullanılır20,21,22. Bununla birlikte, PLIM uzun bir piksel bekleme süresi gerektirdiğinden (milisaniye aralığında), görüntü alma süresi FLIM uygulamaları için gerekenden çok daha uzundur20,22,23. Kapılı CCD / CMOS kameralar gibi diğer teknikler, tek foton hassasiyetinden yoksundur ve düşük kare hızlarına sahiptir20,24,25,26. Ayrıca, mevcut PLIM sistemleri çoğunlukla mikroskobik formatta kullanılırken, makroskobik sistemler daha az yaygındır27.
TCSPC tabanlı PLIM makro görüntüleyici28 , bu sınırlamaların çoğunun üstesinden gelmek için kurulmuştur. Görüntüleyicinin tasarımı, aşağıdakilere sahip yeni bir opto-mekanik adaptör olan Cricket'in kullanılmasıyla büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır: i) arka taraftaki kamera modülünün ve ön taraftaki objektif lensin kolay bağlanmasını sağlayan iki C montaj adaptörü; ii) Kriketin dış tarafında bir görüntü yoğunlaştırıcı için bir iç mahfaza ve ikincisi için bir elektrik prizi; iii) yoğunlaştırıcının önüne standart bir 25 mm emisyon filtresinin yerleştirilebileceği ön taraftaki C-mount adaptörünün arkasındaki bir iç alan; ve iv) kamera çipinde net görüntüler üretmek için lens ve kamera arasında optik hizalama/odaklama sağlayan halka regülatörleri ile optikleri harmanlayan dahili bir ışık.
Birleştirilmiş görüntüleyicide, kamera modülü, bir fotokatottan oluşan bir görüntü yoğunlaştırıcıyı ve ardından bir mikrokanal plakasını (MCP), bir amplifikatör ve hızlı bir sintilatör, P47 fosforu barındıran Kriket adaptörünün arka tarafına bağlanır. Cricket'in içine 760 nm ± 50 nm emisyon filtresi takılmıştır ve ön taraftaki C-mount adaptörüne NMV-50M11 '' objektif bir lens takılmıştır. Son olarak, lens ve kamera halka regülatörleri ile optik olarak hizalanmıştır.
Yoğunlaştırıcının rolü, gelen fotonları tespit etmek ve bunları kamera çipinde emisyon bozunumları ve ömür boyu görüntüler üretmek için kaydedilen ve kullanılan hızlı ışık patlamalarına dönüştürmektir. Kamera modülü, gelişmiş bir TCSPC tabanlı optik sensör dizisi (256 piksel x 256 piksel) veyeni nesil bir okuma çipi 29,30,31,32,33'ten oluşur ve görüntüleme yongasının her pikselinde 1,6 ns zaman çözünürlüğü ve 80 Mpixel/s okuma hızı ile foton patlamalarının varış zamanının (TOA) ve eşik aşımı süresinin (TOT) eşzamanlı olarak kaydedilmesini sağlar.
Bu konfigürasyonda, yoğunlaştırıcılı kamera tek foton hassasiyetine sahiptir. Veriye dayalıdır ve hızlı piksel dedektörü okuma (SPIDR) sistemi34'e dayanır. Görüntüleyicinin uzamsal çözünürlüğü daha önce düzlemsel fosforesanO2 sensörleri ve bir çözünürlük plakası maskesi ile karakterize edildi. Cihaz tepki fonksiyonu (IRF), diğer tüm ölçümlerde kullanılanla aynı ayarlarda düzlemsel bir floresan sensörün görüntülenmesiyle ölçülmüştür. Yaklaşık 2,6 ns'lik boyanın ömrü, PLIM modunda IRF ölçümü için kullanılabilecek kadar kısaydı. Görüntüleyici, sırasıyla 39,4 μm ve 30,6 ns (yarı maksimumda tam genişlik) uzamsal ve zamansal çözünürlüklerle 18 mm x 18 mm boyutlarına kadar nesneleri görüntüleyebilir28.
Aşağıdaki protokoller, makro görüntüleyicinin montajını ve daha önce karakterize edilen yakın kızılötesi O2 probuNanO2-IR 35 ile boyanmış biyolojik numunelerdeO2 konsantrasyonunun haritalanması için daha sonraki kullanımını açıklamaktadır. Prob, platin (II) benzoporfirin (PtBP) boyasına dayanan parlak, fotostabil, hücre geçirgen birO2 algılama probudur. 625 nm'de uyarılabilir, 760 nm'de yayılır ve fizyolojik aralıktaO2'ye sağlam bir optik yanıt sağlar (% 0 -% 21 veya 0-210 μMO2). Görüntüleyicinin ayrıca Pt(II)-porfirin boyalarına dayalı farklı sensör malzemelerini karakterize ettiği gösterilmiştir. Genel olarak, görüntüleyici yaygın bir fotoğraf makinesine benzer şekilde kompakt ve esnektir. Mevcut kurulumda, görüntüleyici farklı geniş alan PLIM uygulamaları için uygundur. LED'in hızlı bir lazer kaynağı ile değiştirilmesi, görüntüleyicinin performansını daha da artıracak ve potansiyel olarak nanosaniye FLIM uygulamalarını etkinleştirebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>627 nm LED</td>
			<td>Parts Express</td>
			<td></td>
			<td>Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>760 &#177; 50 nm emission filter</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>84-788</td>
			<td>Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 &#177; 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balb/c mice</td>
			<td>Envigo, UK</td>
			<td>Balb/c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black box</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25C9/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cricket Adapter</td>
			<td>Photonis</td>
			<td>Cricket-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CT26 cells&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CT26.WT</td>
			<td>https://www.atcc.org/products/crl-2638</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0697</td>
			<td>Other media can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen</td>
			<td>Photonis</td>
			<td>PP0360EF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900.300</td>
			<td>35 mm diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar plastic film, 75 micron&#160;</td>
			<td>RS Ireland</td>
			<td>785-0795</td>
			<td>Othe plastic substrates can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanO2-IR</td>
			<td>home-made</td>
			<td>n/a</td>
			<td>The probe can be synthesised according to the published method &#39;Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.&#39; or provided by our lab.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMV-50M11&#8221; 50 mm lens</td>
			<td>Navitar</td>
			<td></td>
			<td>Other lenses compatibel with C-mount adators can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB1836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1472.001</td>
			<td>92 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Supply</td>
			<td>Tenma</td>
			<td>72-10495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse Generator</td>
			<td>Tenma</td>
			<td>TGP110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sophy</td>
			<td>Amsterdam Scientific Instruments</td>
			<td>n/z</td>
			<td>Provided by ASI together with the Tpx3Cam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tpx3Cam</td>
			<td>Amsterdam Scientific Instruments</td>
			<td>TPXCAM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri2 Software</td>
			<td>University of Oxford</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ Translation Stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LT3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence lifetime macro imager for biomedical applications

Bu makalede, katı hal, O2'ye duyarlı kaplamalardan çözünür O2'ye duyarlı problarla boyanmış canlı hayvan dokusu örneklerine kadar farklı fosforesan numunelerdeki moleküler oksijen (O2) konsantrasyonunu haritalamak için tasarlanmış yeni bir fotolüminesans ömür boyu görüntüleyici sunulmaktadır. Özellikle, 625 nm ışık yayan diyot (LED) ile uyarılabilen ve 760 nm'de yayılan nanopartikül tabanlı yakın kızılötesi prob NanO2-IR kullanıldı. Görüntüleme sistemi, Timepix3 kameraya (Tpx3Cam) ve aynı zamanda bir görüntü yoğunlaştırıcı barındıran opto-mekanik adaptöre dayanmaktadır. O2 fosforesans ömür boyu görüntüleme mikroskobu (PLIM) çeşitli çalışmalar için yaygın olarak gereklidir, ancak mevcut platformların doğrulukları, genel esneklikleri ve kullanılabilirlikleri konusunda sınırlamaları vardır.
Burada sunulan sistem, entegre bir optik sensör ve okuma çipi modülü olan Tpx3Cam üzerine inşa edilmiş hızlı ve son derece hassas bir görüntüleyicidir. Yüzey lekeli bağırsak dokusu örneklerinden veya kalın bağırsağın intraluminal olarak boyanmış parçalarından yüksek yoğunluklu fosforesans sinyalleri ve stabil ömür değerleri ürettiği gösterilmiştir ve dokuO2 seviyelerinin yaklaşık 20 s veya daha kısa sürede ayrıntılı haritalanmasını sağlar. Bilinçsiz hayvanlarda aşılanmış tümörlerde hipoksi görüntülemeye yönelik ilk deneyler de sunulmuştur. Ayrıca, görüntüleyicinin, uyarma için 390 nm LED ve emisyon için 650 nm bandpass filtre kullanılarak Pt-porfirin boyalarınadayanan O2'ye duyarlı malzemelerle kullanım için nasıl yeniden yapılandırılabileceğini de açıklıyoruz. Genel olarak, PLIM görüntüleyicinin, kullanılan problar veO2 konsantrasyonunun ilgili iki boyutlu haritaları için yaşam boyu değerlerin doğru nicel ölçümlerini ürettiği bulunmuştur. Ayrıca ex vivo doku modellerinin ve canlı hayvanların metabolik görüntülemesi için de yararlıdır.

Ex vivo görüntüleme uygulamaları için, dokunun serozal tarafına NanO2-IR probunun topikal uygulaması ile bağırsak dokusunun parçaları boyandı. Daha derin boyama için, probun 1 μL'si lümene enjekte edildi. İkinci durumda, 0.2-0.25 mm kalınlığındaki bağırsak duvarı, probu kameradan korudu. İki boyama işlemi Şekil 2A'da gösterilmiştir.
Elde edilen yoğunluk ve PLIM görüntüleri Şekil 2B-G'de<strong...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications at JoVE.com

Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications

Bu yazıda, uzun bozunma yayan numunelerin makroskopik fotolüminesans ömür boyu görüntülenmesi için yeni, hızlı bir optik görüntüleyicinin kullanımı açıklanmaktadır. Entegrasyon, görüntü toplama ve analiz prosedürleri, görüntüleme için sensör malzemelerinin hazırlanması ve karakterizasyonu ve görüntüleyicinin biyolojik numunelerin incelenmesinde uygulanması ile birlikte açıklanmaktadır.

Biyomedikal Uygulamalar için Floresan Ömür Boyu Makro Görüntüleyici

This paper presents a new photoluminescence lifetime imager designed to map the molecular oxygen (O2) concentration in different phosphorescent samples ...

Protokolümüz, makroskopik nesnelerde, özellikle canlı hayvan dokusunda ve tüm hayvanlarda, özel problar ve algılama malzemeleri aracılığıyla fosforesans ömrünün ve oksijen konsantrasyonunun ayrıntılı 2D haritalanmasını sağlar. Bu bilgi birçok araştırma alanı için önemlidir. Protokolümüz, TCSPC modunda çalışan entegre ve kompakt bir görüntüleme modülü kullanır ve yaşam dokusu gibi karmaşık biyolojik numunelerde kullanım ömrünün ve oksijen dağılımının kolay ve doğru bir şekilde görselleştirilmesini sağlar.Kriket adaptörünü alın ve farklı yönlerden inceleyin. Kriket'e yerleştirilmiş Photonis PP0360EF yoğunlaştırıcısını göstermek için ön taraftaki C-mount adaptörünü çıkarın ve ardından C-mount adaptörünü geri takın. Cricket'in ön taraf C-mount adaptörünü çıkarın ve 650 artı/eksi 50 nanometre emisyon filtresini takın.C montajını geri koyarak düzeltin. Ardından, TPX üç kameralı kamera modülünü halka adaptörleri aracılığıyla Kriket modülünün arka tarafına bağlayın. Lensi, C-mount adaptörü aracılığıyla Kriket modülünün ön tarafına bağlayın.LED'i bir güç kaynağına ve bir darbe jeneratörüne bağlayın. Şimdi, 390 nanometre süper parlak LED'i kara kutunun içindeki bir breadboard'a bağlı bir direğe monte edin. LED'i açın ve görüntülenen numunenin etkili ve homojen bir şekilde uyarılmasını sağlamak için odaklayın.Kamera tertibatını, örneklerin görüntüleneceği sahneye doğru aşağı bakacak şekilde optik kara kutunun üzerine monte edin. Fotoğraf makinesini ve LED'i iki darbeli jeneratörlere ve dört kanallı bir osiloskoba bağlayın. Osiloskop ve darbe jeneratörlerindeki ayarları kullanarak, kameraya ve LED'e gönderilen darbeleri senkronize edin.Yoğunlaştırıcıyı standart bir güç kaynağına bağlamak ve kazancı 2,7 volta ayarlamak için Kriket ünitesindeki özel kabloyu ve soketi kullanın. Örneği kamera lensinin önüne yerleştirin. Ardından, kamerayı ve yoğunlaştırıcı hariç tüm elektrik modüllerini açın.Odaklama ve numune hizalama gibi operasyonel parametreleri ayarlamak için SOFI yazılımını etkinleştirin. Modüllerde, kare pozlamasını 0,01 saniyeye ayarlayın. Sonsuz kareler'i seçin ve piksel çalışma modunu eşiğin üzerinde zamana ayarlayın.Ardından, Önizleme'ye gidin ve Medipix / Timepix kareleri penceresini açmak için Etkin modül'ü seçin. Bir sonraki adımda, kayda başladıktan sonra, renk ölçeğini ayarlayın ve görüntüyü istediğiniz yöne döndürün. Bundan sonra, odadaki ışıkları kapatın ve yoğunlaştırıcıyı açın.İyi kontrast ve parlaklığa sahip örneklerin net görüntülerini oluşturmak için lensin ve Kriket adaptörünün odaklama özellikleriyle kamera optiklerini örnek sahne alanına odaklayın. Netleme tamamlandıktan sonra SOFI yazılımını kapatın. Ardından, terminale gidin, ham verileri ikili biçimde almak ve terminali kapatmak için özel tasarım yazılımının komutlarını yürütün.Alınan verileri işlemek için yeni bir terminal açın. Veri dosyasını yükleyin ve veri düşürücüyü çalıştırın. İşlem sonrası verileri, verileri bir ICS görüntü dosyasına yazacak C dilinde yazılmış özel bir programla analiz edin.Daha sonra, serbestçe kullanılabilen Time Resolved Imaging yazılımını kullanarak ICS görüntü dosyalarını açın ve fosforesans bozunumlarına uymak için iki üstel işlev kullanın. Son olarak, Fitted'i açın. ICS görüntü dosyaları, mevcut görüntü analiz yazılımına sahiptir.Arama tablolarını kullanarak fosforesans ömrü görüntüleri oluşturun ve bunları sahte renk ölçeğinde kodlayın. Tüm görüntünün veya ilgilenilen bölgelerin ortalama yaşam boyu değerlerini hesaplamak için Ölçüm işlevini kullanın. Fosforesans yoğunluğu ve fosforesans ömür boyu görüntüleme mikroskobu görüntülerinde platin oktaetilporfirin boya sensörünün oksijenli ve oksijensiz haldeki noktaları gösterilmiştir.Doğru emisyon filtresinin Kriket'in içine monte edildiğinden ve doğru LED'in, kablo bağlantılarının ve darbe ayarlarının kullanıldığından emin olun. Şu anda, bu protokol hayvan modelleriyle sınırlıdır, ancak potansiyel olarak kanser, felç ve iltihaplanma gibi doku hipoksisi ile ilişkili patolojik durumları teşhis etmek ve tedavi etmek için uygulanabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

BioMEMS and Cellular Biology: Perspectives and Applications

BioMEMS ve Hücresel Biyoloji: Perspektifler ve Uygulamalar

The ability to culture cells has revolutionized hypothesis testing in basic cell and molecular biology research. It has become a standard methodology in ...

Microfluidic Applications for Disposable Diagnostics

Tek kullanımlık Diagnostics mikroakışkan Uygulamaları

In this interview, Dr. Klapperich discusses the fabrication of thermoplastic microfluidic devices and their application for development of new ...

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Yüzey immobilize Biyomoleküller Tek Molekül Floresans Ölçümler için Otomatik Sistem

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Bir Eski-ovo</emGörüntüleme ve Mikrocerrahi Uygulamaları için uygundur> Tavuk Embriyo Kültürü Sistemi

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Maya İzleme Mitophagy Floresan Mikroskopi Testi Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Toz numuneler mutlak Kuantum Verimi Ölçümü

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Büyük ölçekli SNP Genotiplendirme Uygulamaları için infinium Tahlili

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Yüksek verim Uygulamaları Yetişkin Zebra Hearts Kurtarma

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Multiplexed Uygulamaları için Floresan Proteinleri ile Genetik Barkodlama

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...