Name: rapid assessment of membrane protein quality by fluorescent size exclusion chromatography
Uploaded: 2023-01-06T13:05:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography at JoVE.com

نود أن نعترف بمساعدة ودعم فريق Peak Proteins بأكمله. من فريق علوم الخلية ، نود أن نعترف بإيان هامبتون لرؤيته وتوجيهاته القيمة في التعبير عن خلايا الحشرات. نود أن نشكر مارك أبوت على توفير الموارد والفرصة لمتابعة هذا المشروع.

<ol>
	<li>Burgess, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+practical+review+of+size+exclusion+chromatography:+Rules+of+thumb,+limitations,+and+troubleshooting.">A brief practical review of size exclusion chromatography: Rules of thumb, limitations, and troubleshooting.</a> Protein Expression and Purification. 150, 81-85 (2018).</li><li>Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+shape+of+protein+molecules+at+the+nanometer+level+determined+by+sedimentation,+gel+filtration,+and+electron+microscopy.">Size and shape of protein molecules at the nanometer level determined by sedimentation, gel filtration, and electron microscopy.</a> Biological Procedures Online. 11 (1), 32-51 (2009).</li><li>Lathe, G. H., Ruthven, C. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+separation+of+substances+and+estimation+of+their+relative+molecular+sizes+by+the+use+of+columns+of+starch+in+water.">The separation of substances and estimation of their relative molecular sizes by the use of columns of starch in water.</a> Biochemical Journal. 62 (4), 665-674 (1956).</li><li>Lathe, G. H., Ruthven, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+separation+of+substances+on+the+basis+of+their+molecular+weights,+using+columns+of+starch+and+water.">The separation of substances on the basis of their molecular weights, using columns of starch and water.</a> Biochemical Journal. 60 (4), (1955).</li><li>Polson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionation+of+protein+mixtures+on+columns+of+granulated+agar.">Fractionation of protein mixtures on columns of granulated agar.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 50 (3), 565-567 (1961).</li><li>Hjert&#233;n, S., Mosbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=34;Molecular-sieve&amp;#34;+chromatography+of+proteins+on+columns+of+cross-linked+polyacrylamide.">34;Molecular-sieve&amp;#34; chromatography of proteins on columns of cross-linked polyacrylamide.</a> Analytical Biochemistry. 3 (2), 109-118 (1962).</li><li>Porath, J., Flodin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+filtration:+A+method+for+desalting+and+group+separation.">Gel filtration: A method for desalting and group separation.</a> Nature. 183 (4676), 1657-1659 (1959).</li><li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins.">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li><li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening.">A Fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).</li><li>Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction,+purification+and+properties+of+aequorin,+a+bioluminescent+protein+from+the+luminous+hydromedusan,+Aequorea.">Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea.</a> Journal of Cellular and Comparative Physiology. 59 (3), 223-239 (1962).</li><li>Drew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).</li><li>Newstead, S., Kim, H., von Heijne, G., Iwata, S., Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+fluorescent-based+optimization+of+eukaryotic+membrane+protein+overexpression+and+purification+in+Saccharomyces+cerevisiae.">High-throughput fluorescent-based optimization of eukaryotic membrane protein overexpression and purification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 13936-13941 (2007).</li><li>Vaidehi, N., Grisshammer, R., Tate, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+can+mutations+thermostabilize+G-protein-coupled+receptors.">How can mutations thermostabilize G-protein-coupled receptors.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 37 (1), 37-46 (2016).</li><li>Hardy, D., Bill, R. M., Jawhari, A., Rothnie, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+bottlenecks+in+the+membrane+protein+structural+biology+pipeline.">Overcoming bottlenecks in the membrane protein structural biology pipeline.</a> Biochemical Society Transactions. 44 (3), 838-844 (2016).</li><li>Hanson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+lipid+G+protein-coupled+receptor.">Crystal structure of a lipid G protein-coupled receptor.</a> Science. 335 (6070), 851-855 (2012).</li><li>Alexandrov, A. I., Mileni, M., Chien, E. Y. T., Hanson, M. A., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+fluorescent+thermal+stability+assay+for+membrane+proteins.">Microscale fluorescent thermal stability assay for membrane proteins.</a> Structure. 16 (3), 351-359 (2008).</li><li>Harborne, S. P. D., King, M. S., Kunji, E. R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermostability+assays:+A+generic+and+versatile+tool+for+studying+the+functional+and+structural+properties+of+membrane+proteins+in+detergents.">Thermostability assays: A generic and versatile tool for studying the functional and structural properties of membrane proteins in detergents.</a> Biophysical Journal. 118 (4), 105-121 (2020).</li><li>Nji, E., Chatzikyriakidou, Y., Landreh, M., Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineered+thermal-shift+screen+reveals+specific+lipid+preferences+of+eukaryotic+and+prokaryotic+membrane+proteins.">An engineered thermal-shift screen reveals specific lipid preferences of eukaryotic and prokaryotic membrane proteins.</a> Nature Communications. 9 (1), 4253 (2018).</li><li>Harborne, S. P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMPROvER:+The+Integral+Membrane+Protein+Stability+Selector.">IMPROvER: The Integral Membrane Protein Stability Selector.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15165 (2020).</li><li>Ashok, Y., Nanekar, R., Jaakola, V. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+thermostability+of+membrane+proteins+by+western+blotting.">Defining thermostability of membrane proteins by western blotting.</a> Protein Engineering Design and Selection. 28 (12), 539-542 (2015).</li><li>Pedersen, M. E., &#216;stergaard, J., Jensen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-induced+dispersion+analysis+(FIDA)+for+protein+quantification+and+characterization.">Flow-induced dispersion analysis (FIDA) for protein quantification and characterization.</a> Methods Mol Biol. 1972, 109-123 (2019).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1 (1), 100 (2010).</li></ol>

Peak Proteins هي منظمة بحثية تعاقدية توفر تعبير البروتين وتنقيته وقياس الطيف الكتلي والتحديد الهيكلي مقابل رسوم.

تسمح الأساليب المنهجية العامة لفحص الحالة باستخدام FSEC المعروضة هنا بالتحسين السريع لمعلمات الذوبان والتنقية لإنتاج بروتينات الغشاء. وهذا يعني أنه يمكن إنتاج البروتينات الغشائية المستقرة والنشطة وظيفيا بسرعة للدراسات الفيزيائية الحيوية والهيكلية. علاوة على ذلك ، يمكن تشغيل FSEC باستخدام معدات المختبرات التي من المحتمل أن تكون موجودة بالفعل في مختبرات البروتين الغشائي ، وبالتالي ، لا توجد حاجة لشراء أداة متخصصة لتشغيل المقايسات.
خطوات حاسمة الوقت المستغرق بين نقطة الذوبان من الخلايا في المنظفات إلى النقطة التي يتم فيها تمرير العينة إلى أسفل عمود SEC (الخطوات 2.1.5-3.2.5) حرج من الوقت ، ويجب ألا يكون هناك توقف مؤقت بين هذه الخطوات. يجب إجراء جميع الخطوات عند 4 درجات مئوية أو على الجليد ، ويجب الحفاظ على الوقت المستغرق لتنفيذ هذه الخطوات عند الحد الأدنى الممكن. هذه القيود الزمنية ودرجة الحرارة ضرورية من أجل تسجيل ملف تعريف FSEC لبروتين الغشاء قبل أي تكشف أو تدهور محتمل. بعد إذابة البروتين الغشائي ، هناك خطر أكبر من التكشف والتجميع والتدهور ، حتى عند 4 درجات مئوية. من الناحية المثالية ، يجب أن تمر أي عينات تتم مقارنة آثار FSEC لها إلى أسفل عمود SEC في نفس المدة الزمنية بعد خطوة الذوبان. من الناحية العملية ، هذا صعب ، خاصة إذا تم تمرير العينات بالتتابع أسفل عمود واحد ، ولكن من الممكن جمع ما يصل إلى خمسة آثار SEC في غضون 3 ساعات من بعضها البعض ، وفي هذا الإطار الزمني ، لا ينبغي أن يكون هناك تدهور كبير.
استكشاف الاخطاء إذا كانت هناك إشارة فلورسنت منخفضة أو معدومة عند إجراء تجربة FSEC ، فمن المحتمل أن البروتين الغشائي المعني لم يعبر عن خط الخلية المختار ، أو لديه تعبير منخفض جدا عن خط الخلية المختار ، أو لم يتم إذابته في المنظف المختار. إذا تم تخفيف العينات قبل جمع إشارة التألق وتسجيل تتبع FSEC ، فإن الخطوة الأولى البسيطة هي تجربة تخفيف أقل أو عدم تخفيف كسور SEC. إذا كان هذا لا يزال لا ينتج عنه أثر FSEC قابل للتفسير ، فيجب التحقق من تعبير البروتين وذوبانه.
يمكن تحقيق تحليل تعبير البروتين عن طريق التحقق من مضان العينة بعد الخطوة 2.2.2. إذا كانت هناك إشارة فلورسنت منخفضة جدا أو معدومة من هذه العينة (على سبيل المثال ، إشارة قريبة جدا من الخلفية) ، فمن المحتمل أن تكون هناك مشكلة في تعبير البروتين. يمكن اتخاذ خطوات لتحسين مستويات التعبير عن بروتين الغشاء ، مثل التبديل إلى خط خلية بديل أو ضبط ظروف النمو ، وتحريض التعبير ، والوقت بين الحث / العدوى / النقل والحصاد. ومع ذلك ، يمكن أن يشير تعبير البروتين الضعيف بشكل خاص إلى بروتين غشاء غير مستقر ، وبالتالي ، اختيار بناء ضعيف.
إذا تم فحص التعبير وكانت هناك إشارة فلورسنت واضحة فوق الخلفية قبل FSEC ، فيمكن التحقق من كفاءة الذوبان عن طريق قياس إشارة الفلورسنت المتبقية للعينة بعد الخطوة 2.4.3 (بروتين الغشاء القابل للذوبان) مقارنة بالعينة بعد الخطوة 2.2.2 (البروتين الكلي). من الشائع أن تكون كفاءة الذوبان 20٪ -30٪ ولا تزال تسمح بالتحليل الناجح وتنقية بروتين الغشاء. ومع ذلك ، إذا كانت كفاءة الذوبان أقل من 20٪ ، فقد تكون هناك حاجة إلى منظف مختلف للذوبان أو ظروف ذوبان مختلفة. إذا لم تنجح محاولات تحسين الذوبان ، فقد يشير ذلك إلى بروتين غشائي غير مستقر بشكل خاص ، وبالتالي ، اختيار بناء ضعيف.
إذا لوحظت ذروة استخلاص متأخرة جدا في تتبع FSEC (على سبيل المثال ، 18-24 مل) ، فهذا يشير إلى أن البروتين الفلوري له وزن جزيئي للبروتين أقل بكثير من المتوقع. يمكن أن يحدث هذا بسبب تحلل البروتين الغشائي محل الاهتمام ، مما يؤدي إلى GFP "مجاني". يجب على المرء التحقق مما إذا كان البروتين سليما قبل وبعد الذوبان باستخدام مضان GFP في الهلام. إذا بدا أن البروتين محل الاهتمام يتحلل أو يتحلل بالبروتين ، فيمكن زيادة كمية مثبطات الأنزيم البروتيني مرتين إلى أربعة أضعاف. ومع ذلك ، فإن الحساسية العالية للبروتياز أو البروتين المتحلل حتى قبل الذوبان يمكن أن تشير إلى بروتين غير مستقر بشكل خاص ، وبالتالي ، اختيار بناء ضعيف.
التعديلات والتطبيقات الإضافية ل FSEC عادة ما تكون علامة الفلورسنت المستخدمة في FSEC هي GFP أو eGFP ، كما هو موضح في هذا البروتوكول. ومع ذلك ، تتوفر العديد من علامات البروتين الفلوري المختلفة. يعتمد اختيار علامة الفلورسنت المراد استخدامها على وجود قارئ لوحة يمكنه تحقيق معلمات الإثارة والانبعاث الصحيحة لتسجيل إشارة الفلورسنت لعلامة الفلورسنت المحددة ووجود فلوروفور مع تغيير طفيف أو معدوم في العائد الكمي في الظروف البيئية المختلفة. علاوة على ذلك ، لا يقتصر FSEC على البروتينات الفلورية ولكن يمكنه أيضا العمل بشكل جيد مع البروتين الذي تم تمييزه بصبغة فلورية. على سبيل المثال ، يمكن استخدام صبغة NTA ، والتي من شأنها أن ترتبط بشكل إيجابي بتركيبات البروتين الغشائي الموسومة بالهستيدين. علاوة على ذلك ، إما أن الجسم المضاد المسمى بالفلورسنت المسمى كيميائيا بصبغة فلورية ومحدد لربط بروتين الغشاء محل الاهتمام أو علامة تنقية مضمنة في بنية بروتين الغشاء يمكن أن يصنف بشكل غير مباشر هدفا ل FSEC.
عند إجراء فحص المنظفات باستخدام FSEC ، يمكن اتخاذ قرار بشأن ما إذا كان المخزن المؤقت المستخدم لتشغيل عمود SEC يجب أن يحتوي على المنظف المطابق الذي تم إذابة البروتين فيه أو ما إذا كان يجب استخدام منظف قياسي في جميع عمليات التشغيل. سيتم الحصول على تمثيل أكثر دقة لسلوك البروتين إذا تم إجراء التجربة بأكملها باستخدام المنظف المطابق طوال الوقت. ومع ذلك ، يمكن أن يستغرق الأمر وقتا طويلا ومضيعة للمنظف إذا كان يجب إعادة توازن العمود في منظف جديد قبل تنفيذ كل تشغيل. علاوة على ذلك ، نظرا لأن الغرض الرئيسي من فحص المنظفات هو مقارنة الآثار ، فستظل الاتجاهات في الآثار حتى لو لم تكن الظروف مثالية. وبالتالي ، يمكن التوصل إلى حل وسط حيث يتم إذابة البروتين في المنظف محل الاهتمام ولكن يتم تشغيل العمود في مخزن مؤقت قياسي مع منظف واحد عبر جميع عمليات التشغيل (على سبيل المثال ، DDM) 11 ، مما يوفر الوقت والمواد الاستهلاكية للمنظفات.
من خلال تعديل معدات FLPC المستخدمة ، يمكن زيادة إنتاجية بروتوكول FSEC بشكل كبير ، ويمكن تقليل متطلبات العينة. على سبيل المثال ، يمكن تجهيز نظام FPLC أو HPLC بجهاز أخذ عينات تلقائي ، وعمود تحليلي أصغر حجما (مثل عمود SEC تحليلي 3.2 مل) ، وكاشف فلورسنت مضمن لمراقبة آثار FSEC المستمرة مباشرة من العمود. سيسمح الإعداد الناتج بإجراء المزيد من عمليات تشغيل FSEC في فترة زمنية أقصر وإزالة خطوة التخطيط اليدوي ، مما يسمح باختبار عدد أكبر من الشروط في إطار زمني أقصر. علاوة على ذلك ، سيتم تخفيض متطلبات العينة بشكل أكبر ، حيث سيتعين إعداد عدد أقل من العينات وتحميلها على عمود FSEC لكل تشغيل. وهذا من شأنه أن يفتح إمكانيات لاختزال ثقافات التعبير إلى شكل قائم على اللوحة، حيث ستكون هناك حاجة إلى القليل من المواد للتحليل.
نقاط القوة والضعف في FSEC مقارنة بالطرق الأخرى عيب FSEC هو أن تركيبات البروتين الغشائي تحتاج إلى تصميم لإدخال ملصق الفلورسنت ، وعند المقدمة ، هناك احتمال ضئيل أن يتداخل وضع الملصق مع وظيفة أو طي بروتين الغشاء محل الاهتمام. بالإضافة إلى ذلك ، يراقب بروتوكول FSEC ، كما هو موضح هنا ، خصائص بروتين الغشاء في وجود تحلل الخلية ، وهو خليط خام من البروتينات. قد يختلف سلوك البروتين الغشائي في هذه البيئة عما هو عليه عندما يخضع البروتين الغشائي محل الاهتمام لعمود SEC تحضيري في نهاية التنقية عند عزله تماما عن البروتينات الأخرى. علاوة على ذلك ، يوفر FSEC مقياسا نوعيا إلى حد ما لجودة البروتين. ومع ذلك ، من خلال تحويل تتبع FSEC إلى مؤشر أحادي التشتت ، كما هو موضح في الخطوة 4.3.3 من البروتوكول ، يمكن الحصول على مقياس كمي لجودة البروتين.
FSEC ليست الطريقة الوحيدة التي يمكن استخدامها في التحليل المبكر لتركيبات البروتين الغشائي ، وظروف الذوبان ، وتكوين المخزن المؤقت للتنقية. النهج البديلة لها مزايا وعيوب على حد سواء على FSSEC. على سبيل المثال ، توجد مقايسات الثبات الحراري القائمة على الفلوروفور ، لا سيما استخدام الصبغة 7-diethylamino-3- (4′-maleimidylphenyl) -4-methylcoumarin (CPM) 16,17. ميزة هذه الطريقة هي أنه ، على عكس FSEC ، الذي يوفر مقياسا نوعيا لجودة البروتين ، توفر مقايسات الثبات الحراري مقياسا كميا في شكل درجة حرارة انصهار نسبية. علاوة على ذلك ، لا يوجد شرط لإدخال علامة الفلورسنت على بنية البروتين. ومع ذلك ، فإن عيوب مقايسات الثبات الحراري مقارنة ب FSEC هي أنه يجب استخدام البروتين المنقى وأن الفحص غير متوافق مع جميع تركيبات البروتين ، لأنه يعتمد على المواضع المفيدة لبقايا السيستين الأصلية في البروتين المطوي.
هناك طريقة أخرى لها أوجه تشابه مع كل من FSEC ومقايسات الثبات الحراري القائمة على الفلوروفور وهي الفحص الذي يقيس حساسية درجة حرارة بروتين الغشاء. في هذا الفحص ، يتم تحدي البروتين بدرجات حرارة مختلفة ، ويتم اكتشاف البروتين الذي يبقى في المحلول بعد الطرد المركزي. تم إجراء الكشف في هذه الطريقة بعدة طرق ، بما في ذلك قياس التألق في المحلول18 ، أو مضان شريط هلام SDS-PAGE19 ، أو شدة الإشارة في اللطخة الغربية20. ومع ذلك ، فإن العيب الكبير لهذه الأساليب هو أن الفحص كثيف العمالة وعرضة للضوضاء العالية في النتائج ، حيث يجب جمع كل نقطة درجة حرارة فردية بشكل مستقل.
أخيرا ، يمكن استخدام العديد من التقنيات الفيزيائية الحيوية الأكثر تقدما لتقييم جودة البروتين الغشائي بطريقة مماثلة ل FSEC ، على سبيل المثال ، تحليل التشتت الناجم عن التدفق21 ، أو الرحلان الحراري المجهري22 ، أو SPR. وعلى الرغم من أن هذه الأساليب قوية جدا، فإن مساوئها هي الحاجة إلى أدوات عالية التخصص لإجراء التحليلات.
في الختام ، يوفر FSEC أداة لا تقدر بثمن للاستخدام في حملات إنتاج البروتين الغشائي ، وعلى الرغم من أنه ليس الخيار الوحيد ، إلا أنه يتمتع بالعديد من المزايا المميزة مقارنة بالطرق الأخرى ، كما هو مذكور أعلاه. يوصى دائما بالتحقق من صحة النتائج عن طريق المقايسات المتعامدة ، ولا تستبعد أي من الطرق التي تمت مناقشتها أعلاه بعضها البعض.

يستخدم كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) ، المعروف أيضا باسم كروماتوغرافيا ترشيح الهلام ، بشكل شائع في علم البروتين1. خلال SEC ، يتم فصل البروتينات بناء على نصف قطرها الهيدروديناميكي ، وهو دالة لحجم البروتين وشكله2. باختصار ، يتم تحقيق هذا الفصل من خلال تطبيق عينات البروتين تحت التدفق على طبقة معبأة من الخرز المسامي الذي يعمل كمنخل جزيئي. غالبا ما تكون الخرزات المستخدمة عبارة عن أغاروز متقاطع مع مجموعة محددة من أحجام المسام للسماح للبروتينات إما بالدخول أو الاستبعاد من مسام الخرز3،4،5،6،7. تقضي البروتينات ذات أنصاف الأقطار الهيدروديناميكية الأصغر نسبة أكبر من الوقت داخل المسام ، وبالتالي تتدفق عبر السرير المعبأ بمعدل أبطأ ، بينما تقضي البروتينات الأكبر نسبة أكبر من الوقت خارج الخرزات (الحجم المستبعد) وتتحرك عبر السرير المعبأ بمعدل أسرع. يمكن استخدام SEC كخطوة لتنقية البروتين عند استخدام عمود تحضيري1. عند استخدام عمود تحليلي ، يمكن استخدام SEC لتحليل جودة البروتين وخصائصه2. على سبيل المثال ، تميل مجاميع البروتين التي قد تكون موجودة في عينة وتشير إلى بروتين رديء الجودة إلى أن تكون كبيرة جدا ، مما يعني أنها تنتقل فقط في الحجم المستبعد ، وبالتالي ، يتم استخلاصها من العمود في أقرب نقطة ؛ يشار إلى هذا المجلد باسم العمود باطل أو مجلد باطل. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام معايير الوزن الجزيئي لمعايرة العمود ، مما يسمح باستيفاء الوزن الجزيئي المقدر للبروتين محل الاهتمام من منحنى قياسي.
عادة ، يتم استخدام امتصاص البروتين عند 280 نانومتر لمراقبة شطف البروتين من عمود استبعاد الحجم. هذا يقيد استخدام SEC كأداة تحليل حتى يصبح البروتين محل الاهتمام خاليا إلى حد كبير من البروتينات الملوثة ، على سبيل المثال ، في الخطوة الأخيرة من تنقية البروتين. ومع ذلك ، يستخدم SEC الفلوري (FSEC) بروتينا مثيرا للاهتمام يحمل علامة الفلورسنت. لذلك ، يمكن استخدام إشارة الفلورسنت لمراقبة شطف البروتين محل الاهتمام على وجه التحديد في وجود بروتينات أخرى أو حتى مخاليط خام 8,9. علاوة على ذلك ، نظرا لأن إشارات الفلورسنت حساسة للغاية ، يمكن إجراء تحليل ناجح على عينات ذات كميات منخفضة للغاية من البروتين. غالبا ما يتم تصنيف البروتين محل الاهتمام بالفلورسنت من خلال تضمين بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) أو علامة GFP المحسنة (eGFP) في بنية التعبير. يمكن بعد ذلك مراقبة إشارة الفلورسنت عن طريق الإثارة عند 395 نانومتر أو 488 نانومتر واكتشاف انبعاث الفلورسنت عند 509 نانومتر أو 507 نانومتر ل GFP أو eGFP ،على التوالي 10.
إن فائدة استخدام إشارة الفلورسنت لمراقبة شطف البروتين من عمود SEC تجعل FSEC أداة قيمة لتحليل عينات البروتين الغشائي عندما تكون مستويات التعبير ضعيفة بشكل خاص مقارنة بالبروتينات القابلة للذوبان. بشكل حاسم ، يمكن تحليل جودة وخصائص البروتينات الغشائية مباشرة بعد الذوبان من المحللين الخام دون الحاجة إلى تحسين عملية التنقية أولا11,12. لهذه الأسباب ، يمكن استخدام FSEC لتحليل جودة بروتين الغشاء بسرعة مع استكشاف العوامل المختلفة التي قد تكون مطلوبة لتحسين سلوك بروتين الغشاء في المحلول. على سبيل المثال ، من الشائع تجربة العديد من التركيبات التي تحتوي على علامات مختلفة ، واقتطاعات ، وحذف ، وإدخالات شريك الاندماج ، وطفرات التثبيت للعثور على واحدة لم يتم تجميعها بعد الاستخراج من الغشاء13,14. علاوة على ذلك ، فإن الغربلة العازلة لتحديد المنظفات أو المواد المضافة أو الرباط أو البوليمر التي توفر أكثر الظروف استقرارا لبروتين الغشاء يمكن أن تحدد أفضل تركيبة عازلة لتنقية البروتين أو لتوفير الاستقرار للاستخدامات النهائية ، مثل المقايسات الفيزيائية الحيوية أو التوصيف الهيكلي.
وبالتالي ، فإن الهدف العام لطريقة FSEC هو جمع ملف تعريف شطف عمود SEC لبروتين الغشاء المستهدف ذي الأهمية. علاوة على ذلك ، عند استخدام التألق ، يتم جمع تتبع SEC هذا في أقرب وقت ممكن في تحسين التركيبات والظروف قبل أي تنقية طويلة. يمكن استخدام تتبع FSEC كأداة مقارنة للحكم على احتمالية نجاح تنقية بروتين الغشاء بظروف عازلة مختلفة أو تركيبات بروتين غشائية. وبهذه الطريقة ، يمكن استخدام مجموعة ملفات تعريف FSEC كعملية تكرارية سريعة للوصول إلى تصميم البناء الأمثل وتكوين المخزن المؤقت قبل بذل الجهد لتوليد كميات البروتين النقي المطلوبة لطرق التحليل الأخرى.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL and 5 mL plastic syringes&#160;</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>Syringes for transfer of samples&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x EDTA Free Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab201111</td>
			<td>Protease inhibitors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes&#160;&#160;</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>15 mL tubes for pellet preparation and solubilisation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL ultra-centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>344625&#160;</td>
			<td>Tubes for ultra-centrifuge rotor&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>50 mL tubes for cell harvest&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well blocks&#160;</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>15922302</td>
			<td>For collecting 0.2 mL SEC fractions&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA&#160; V9-L loop valve</td>
			<td>Cytiva&#160;</td>
			<td>29011358</td>
			<td>5 posiiton loop valve&#160; for the &#196;KTA FPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA F9-C fraction collector</td>
			<td>Cytiva&#160;</td>
			<td>29027743</td>
			<td>6 position plate fraction collector for the &#196;KTA FPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA pure 25 L</td>
			<td>Cytiva&#160;</td>
			<td>29018224&#160;</td>
			<td>FPLC system for running the experiment&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge (e.g. Fisherbrand GT4 3L)&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>15828722&#160;</td>
			<td>Centrifuge for low-speed spin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt end filling needles&#160;</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>For transfer of samples&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top vacuum filter&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10005490</td>
			<td>Bottle top vacuum filter for filtering SEC buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesteryl hemisuccinate (CHS)&#160;</td>
			<td>Generon&#160;</td>
			<td>CH210-5GM&#160;</td>
			<td>Additive for detergent solubilisation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable multichannel reseviour&#160;</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>Resevior for addition of water or buffer to 96-well micro-plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecyl maltoside (DDM)&#160;</td>
			<td>Glycon&#160;</td>
			<td>D97002-C-25g&#160;</td>
			<td>Detergent for solubilisation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP protein standards</td>
			<td>BioVision</td>
			<td>K815-100</td>
			<td>eGFP standards for fluorescent calibration curve&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>11443297</td>
			<td>Glycerol for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>10411451</td>
			<td>HEPES for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High molecular weight SEC calibration standards kit</td>
			<td>Cytiva&#160;</td>
			<td>28403842</td>
			<td>Molecular weight calibration kit for SEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauryl maltose neopentylglycol (LMNG)&#160;</td>
			<td>Generon&#160;</td>
			<td>NB-19-0055-5G&#160;</td>
			<td>Detergent for solubilisation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low molecular&#160; weight SEC calibration standards kit</td>
			<td>Cytiva&#160;</td>
			<td>28403841</td>
			<td>Molecular weight calibration kit for SEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLA-130 ultra-centrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>367114&#160;</td>
			<td>Rotor for ultracentrifuge that fits 2 mL capacity tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opaque 96-well flat-bottom micro-plate&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10656853</td>
			<td>96-well for reading fluorescent signal in plate reader&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima MAX-XP ultra-centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>393315&#160;</td>
			<td>Centrifuge for high-speed spin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>For adjusting the pH of buffers during preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>Graphing software for plotting traces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary mixer&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>12027144&#160;</td>
			<td>Mixer for end over end mixing in the cold&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>10316943</td>
			<td>Sodium chloride for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>10488790</td>
			<td>Sodium hydroxide for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax ID3 Plate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>735-0391</td>
			<td>Micro-plate reader capable of reading fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirrer plate</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>For stirring buffers during preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrene maleic acid (SMA)&#160;</td>
			<td>Orbiscope&#160;</td>
			<td>SMALP 300&#160;</td>
			<td>Polymer for detergent free extraction&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL&#160;</td>
			<td>Cytiva&#160;</td>
			<td>28990944&#160;</td>
			<td>SEC column for running the experiment. The bed volume of this column is 24 mL. The recommended flow rate for this column in 0.9 ml/min (in water at 4 &#176;C). The maximum pressure limit for this column is 5 MPa.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16694-2-50-06</td>
			<td>For filtering and degassing buffers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid assessment of membrane protein quality by fluorescent size exclusion chromatography

أثناء التوضيح الهيكلي للبروتين الغشائي والتوصيف الفيزيائي الحيوي ، من الشائع تجربة العديد من تركيبات البروتين التي تحتوي على علامات مختلفة ، واقتطاعات ، وحذف ، وإدخالات شريك الاندماج ، وطفرات التثبيت للعثور على واحدة لا يتم تجميعها بعد الاستخراج من الغشاء. علاوة على ذلك ، يعد الفحص العازل لتحديد المنظف أو المادة المضافة أو الليجند أو البوليمر الذي يوفر أكثر الظروف استقرارا لبروتين الغشاء ممارسة مهمة. يوفر التوصيف المبكر لجودة البروتين الغشائي بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد حجم الفلورسنت أداة قوية لتقييم وترتيب التركيبات أو الظروف المختلفة دون الحاجة إلى تنقية البروتين ، كما تقلل هذه الأداة من متطلبات العينة. يجب وضع علامة على البروتينات الغشائية بشكل فلوري ، عادة عن طريق التعبير عنها بعلامة GFP أو ما شابه ذلك. يمكن إذابة البروتين مباشرة من خلايا كاملة ثم توضيحه بشكل فظ عن طريق الطرد المركزي. بعد ذلك ، يتم تمرير البروتين إلى أسفل عمود استبعاد الحجم ، ويتم جمع أثر الفلورسنت. هنا ، يتم تقديم طريقة لتشغيل FSEC وبيانات FSEC التمثيلية على GPCR يستهدف مستقبلات سفينغوسين -1 فوسفات (S1PR1) ومستقبلات السيروتونين (5HT2AR).

أولا ، تم التحقيق في النطاق الديناميكي والحدود الدنيا للكشف عن eGFP لقارئ اللوحة المستخدم في هذه الدراسة. تم تخفيف معيار eGFP المنقى للتركيز المعروف في حجم نهائي 50 ميكرولتر إلى 50 نانوغرام · ميكرولتر − 1 ، 25 نانوغرام · ميكرولتر − 1 ، 12.5 نانوغرام · ميكرولتر − 1 ، 6.25 نانوغرام · ميكرولتر − 1 ، 3.125 نانوغرام · ميكرولتر − 1 ، 0.78125 نانوغرام · ميكرولتر − 1 ، و 0.390625 نانوغرام · ميكرولتر − 1 ، وتمت قراءة التألق باستخدام إثارة 488 نانومتر وانبعاث 507 نانومتر (الشكل 2 ). أشارت هذه التجربة إلى أن قارئ الألواح لديه حد اكتشاف أقل يبلغ 30 نانوغرام من البروتين المسمى eGFP لكل بئر ونطاق ديناميكي يصل إلى 500 نانوغرام من البروتين المسمى eGFP لكل بئر قبل تشبع الإشارة. باستخدام قيمة الحد الأدنى وبافتراض أن شطف البروتين يقتصر على 0.33 من حجم العمود ، يلزم أقل من 1.28 ميكروغرام من البروتين المسمى eGFP محل الاهتمام لتحميل عمود SEC من أجل ملاحظة إشارة FSEC قابلة للاكتشاف.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64322/64322fig02.jpg"> الشكل 2: المنحنى القياسي eGFP. الرسم البياني المبعثر للإشارة الفلورية لمعيار eGFP المنقى المخفف إلى 50 ng·μL−1 و 25 ng·μL−1 و 12.5 ng·μL−1 و 6.25 ng·μL−1 و 3.125 ng·μL−1 و 1.5625 ng·μL−1 و 0.390625 ng·μL−1. (أ) تعرض جميع التخفيفات، بما في ذلك التخفيفات ذات الإشارة المشبعة. (B) رسم بياني مبعثر مكبر، يتضمن فقط المعايير التي تقع في النطاق الديناميكي لقارئ اللوحة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64322/64322fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
ثانيا ، تمت معايرة عمود 24 مل المستخدم في هذه الدراسة بمعايير الوزن الجزيئي. باستخدام نفس ظروف المخزن المؤقت والتشغيل المستخدمة في تحليل FSEC ، تم حقن معايير الوزن الجزيئي الأزرق ديكستران (>2000 كيلو دالتون) ، والفيريتين (440 كيلو دالتون) ، والألدولاز (158 كيلو دالتون) ، والكونالبومين (75 كيلو دالتون) ، والبيضاوي (43 كيلو دالتون) بشكل فردي وتشغيله عبر العمود ، وتم جمع آثار الشطف عند امتصاص 280 نانومتر. كانت أحجام الشطف المسجلة 8.9 مل و 12.4 مل و 15.2 مل و 16.9 مل و 18 مل على التوالي. عندما تم تحويل أحجام الشطف هذه إلى Kav (المعادلة 1) ورسمها مقابل الأوزان الجزيئية اللوغاريتمية ، يمكن أن يكون المنحنى القياسي مناسبا. وقد سمح ذلك بتقدير الوزن الجزيئي ل GPCRs التي تم اختبارها في هذه الدراسة عن طريق استيفاء المنحنى القياسي (الشكل 3). على سبيل المثال ، أشار تتبع FSEC لمستقبلات السيروتونين GPCR 2A (5HT2AR) بعد الذوبان في المنظف DDM إلى حجم شطف يبلغ 13.4 مل. يقع حجم الشطف 5HT2AR بين أحجام الشطف المسجلة للفيريتين والألدولاز ويوفر وزنا جزيئيا يقدر بحوالي 300 كيلو دالتون. يبلغ حجم بنية 5HT 2A R المستخدمة في هذه الدراسة حوالي 50 كيلو دالتون (بما في ذلك علامة eGFP) ، مما يعني أنه إذا افترض أن 5HT2AR أحادي الحجم ، فيمكن أن يعزى250كيلو دالتون من الوزن الجزيئي إلى مذيلة المنظفات / الدهون DDM. معادلة تحويل أحجام الشطف هي كما يلي (المعادلة 1):
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64322/64322eq01.jpg" style="margin: auto;">(المعادلة 1)
حيث V e هو حجم الشطف ، V0 هو حجم فراغ العمود ، و Vc هو إجمالي حجم العمود.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64322/64322fig03.jpg"> الشكل 3: منحنى معايرة عمود SEC باستخدام معايير الوزن الجزيئي. (أ) تتبع FSEC تمثيلي ل 5HT2AR قابل للذوبان في DDM ، مع مواضع الشطف النسبية لمعايير الوزن الجزيئي الأزرق ديكستران (باطل) ، فيريتين ، ألدولاز ، كونالبومين ، وألبومين البيضاوي ملحوظ. يتم تلوين الفيريتين والألدولاز والكونالبومين والبيضاوي باللون الأخضر والأرجواني والأحمر والسماوي على التوالي. (B) منحنى معايرة الوزن الجزيئي باستخدام مواضع الشطف للمعايير بعد التحويل إلى Kav (المعادلة 1) المرسومة مقابل الوزن الجزيئي اللوغاريتمي (Mr). تم استيفاء Mr من 5HT2AR في DDM من المنحنى باستخدام Kav ويتم عرضه على المنحنى (المربع الأزرق). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64322/64322fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
ثم تم استخدام FSEC لتقييم جودة وخصائص مستقبلات GPCR sphingosine-1-phosphate (S1PR1)15. تمت معالجة خلايا الحشرات التي تعبر عن S1PR 1 البشري الموسوم ب GFP من أجل FSEC كما هو موضح في البروتوكول (الشكل 1).
أولا ، تم استكشاف ظروف استخراج الغشاء المثلى من خلال اختبار المنظفات DDM و LMNG ضد الاستخراج الخالي من المنظفات باستخدام SMA (الشكل 4A). تم استخدام مؤشر التشتت الأحادي لتقييم جودة عينة البروتين والنسبة بين البروتين في الفراغ (~ 8 مل احتفاظ العمود) مقارنة بالعينة أحادية التشتت (14-15 مل احتفاظ العمود). أظهرت العينة القابلة للذوبان في LMNG ملف تعريف FSEC متفوقا مع شكل ذروة مونومر أفضل وذروة إجمالية أقل للبروتين ، مما يشير إلى أن الذوبان والتنقية في LMNG كانا أكثر الظروف استقرارا لهذا البروتين الغشائي. في المقابل ، كان للعينة القابلة للذوبان في DDM ملف تعريف FSEC أفقر نسبيا ، مع ذروة إجمالية أكبر وقمة أحادية أوسع ، مما يشير إلى تعدد التشتت في العينة.
ثانيا ، تم فحص تأثير إضافة الربيطة على ملف FSEC عن طريق إضافة sphingosine-1-phosphate (S1P) إلى العينة أثناء الذوبان. في هذه الحالة ، تم استخدام DDM ككاشف للذوبان ، وتمت مقارنة آثار FSEC ل S1PR1 في وجود وغياب S1P (الشكل 4B). أظهرت العينة القابلة للذوبان في وجود S1P تتبع FSEC متفوقا مع تجميع منخفض. يشير هذا إلى أن التنقية في وجود ليجند كانت مفيدة لتحسين جودة عينة البروتين عن طريق تثبيت المستقبل في المحلول ولكنها كانت مفيدة أيضا كعلامة بديلة لنشاط البروتين ، حيث أشارت النتائج إلى أن البروتين مطوي بشكل صحيح ومختص بربط الرباط.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64322/64322fig04.jpg"> الشكل 4: FSEC باستخدام مستخلص خام من S1PR 1 يشير إلى ظروف استخراج الغشاء المثلى وربط الليجند. (أ) مقارنة آثار FSEC ل S1PR1 المذاب في البوليمر المشترك لحمض الستايرين والماليك (SMA؛ أزرق)، لوريل مالتوز نيوبنتيل جلايكول (LMNG؛ أحمر)، أو دوديسيل مالتوسيد (DDM؛ أسود). (B) مقارنة آثار FSEC ل S1PR 1 القابلة للذوبان في DDM في وجود (أحمر) أو غياب (أسود) لناهض سفينغوسين-1-فوسفات (S1P). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64322/64322fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
تم استخدام FSEC أيضا للتحقيق في الاستقرار طويل المدى ل 5HT2AR في ظل ظروف مختلفة. تم إذابة 5HT 2A R البشري الموسوم ب GFP من أغشية خلايا الحشرات إما في المنظفات (DDM) أو بوليمرSMAوتم تحليلها بواسطة FSEC في عدة نقاط زمنية بعد التخزين عند 4 درجات مئوية أو درجة حرارة الغرفة (الشكل 5). بعد عدة أيام من الحضانة ، أظهر 5HT2AR في DDM انخفاضا كبيرا في ارتفاع الذروة الأحادية عند أي من درجتي الحرارة ، ولوحظت زيادات كبيرة في الذروة الكلية. في المقابل ، لم يظهر 5HT 2A R في جسيمات الدهونSMA(SMALP) انخفاضا كبيرا في ارتفاع الذروة الأحادية على مدار التجربة ، مما يشير إلى أن البروتين في SMALP ظل مستقرا لفترة أطول ، حتى في درجات الحرارة غير المواتية. قد يكون هذا مهما عند النظر في الاستعدادات البروتينية للتطبيقات الفيزيائية الحيوية النهائية مثل تجارب رنين البلازمون السطحي (SPR) التي تتطلب أن تكون العينة مستقرة ونشطة على مدى فترة زمنية طويلة لإكمال تجارب الربط بنجاح.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64322/64322fig05.jpg"> الشكل 5: تأثير الوقت ودرجة الحرارة على جودة 5HT 2A R المستخرجة من الغشاء باستخدام DDM أو SMALP ، كما تم تحليلها بواسطة FSEC. (A) آثار FSEC التمثيلية ل 5HT2AR قابلة للذوبان في DDM وتخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة يوم واحد (رمادي) أو يومين (أخضر) أو 5 أيام (أزرق). (ب) الرسوم البيانية لارتفاع الذروة الأحادي الطبيعي لعينات DDM المخزنة عند 4 درجات مئوية (أزرق) أو RT (أخضر) مقارنة بعينات SMALP المخزنة عند 4 درجات مئوية (رمادي) أو RT (أسود). أشرطة الخطأ تمثل SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64322/64322fig05large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography at JoVE.com

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

يصف هذا البروتوكول إجراء لإجراء كروماتوغرافيا استبعاد حجم الفلورسنت (FSEC) على البروتينات الغشائية لتقييم جودتها للتحليل الوظيفي والهيكلي النهائي. يتم عرض نتائج FSEC التمثيلية التي تم جمعها للعديد من المستقبلات المقترنة بالبروتين G (GPCRs) في ظل ظروف خالية من المنظفات وخالية من المنظفات.

التقييم السريع لجودة البروتين الغشائي بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد حجم الفلورسنت

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...

ملف تعريف SEC هو وسيلة قوية لتحليل جودة البروتين. الهدف هو جمع ملف تعريف SEC لبروتين الغشاء باستخدام مضان ، والذي يمكن أن يبلغ عن جودة العينة. يستخدم FSEC كميات صغيرة من العينات ويمكن إجراؤه للتنقية ، وهو بسيط نسبيا ، ويمكن تنفيذه على المعدات المتوفرة في العديد من المختبرات.سيوضح الإجراء جاك رايت ، كبير علماء البروتين من Peak Proteins. ابدأ بتحضير لوحات الخلايا عن طريق إذابة لوحة الخلايا المخزنة في درجة حرارة الغرفة تحت الصفر عند درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ، أو حتى تختفي العينة مجمدة. انقل العينة على الفور إلى الثلج.لإعادة تعليق العينة وإذابتها ، أضف ملليلتر من المخزن المؤقت للذوبان إلى لوحة الخلية. احتضان مع انعكاس طرف إلى طرف عند أربع درجات مئوية لمدة 15 إلى 30 دقيقة. ثم أضف مرق المنظفات المخلوط مسبقا لعمل تركيز نهائي قدره 1٪ دوديسيل مالتوسيد ، أو DDM ، و 0.1٪ كوليسترول هيميسوكسينات ، أو CHS.يذوب لمدة 30 دقيقة مع انعكاس طرف إلى طرف عند أربع درجات مئوية. لأداء خطوة طرد مركزي منخفضة السرعة ، قم بطرد العينة في جهاز طرد مركزي على الطاولة باستخدام دلو متأرجح للخارج وأجهزة طرد مركزي عند 2000 جرام لمدة 15 دقيقة. ثم قم بإجراء الطرد المركزي عالي السرعة عن طريق نقل المادة الطافية من جهاز الطرد المركزي منخفض السرعة إلى أنابيب الطرد المركزي الفائقة باستخدام إبرة حادة متصلة بحقنة سعة خمسة ملليلترات.تأكد من عدم إزعاج اللوحة. بعد موازنة أزواج الأنابيب ، ضعها في دوار طرد مركزي فائق الزاوية وجهاز طرد مركزي بزاوية ثابتة عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة عند 250،000 جرام. قم بإعداد كروماتوغرافيا البروتين السائل السريع ، أو نظام FPLC عن طريق ملء النظام بالكروماتوغرافيا استبعاد الحجم ، أو المخزن المؤقت SEC ، وتطهير مضخات الهواء.قم بتوصيل عمود SEC ب FPLC ، مما يضمن عدم دخول الهواء إلى العمود. قم بموازنة عمود SEC مسبقا عن طريق غسله في أحجام أعمدة 1.5 مرة من الماء المقطر والمصفى من الدرجة المختبرية ، متبوعا بأحجام أعمدة 1.5 مرة من المخزن المؤقت SEC بمعدل التدفق والضغط الموصى بهما للعمود. لتشغيل تجربة SEC ، انقل المادة الطافية من خطوة الطرد المركزي عالية السرعة إلى حقنة سعة ملليلتر واحد باستخدام إبرة حادة متصلة بالمحقنة.اضبط حلقة العينة على التحميل. قم بملء حلقة عينة سعة 500 ميكرولتر عن طريق حقن 600 إلى 700 ميكرولتر من العينة من المحقنة في منفذ التحميل. بعد ذلك ، قم بحقن العينة من الحلقة في العمود عن طريق إفراغها بأربعة ملليلتر من المخزن المؤقت SEC بمعدل التدفق والضغط الموصى بهما.قم بتشغيل العمود بنفس معدل التدفق حتى مرور 1.5 ضعف حجم المخزن المؤقت ، وابدأ في جمع 90 كسرا من 0.2 ملليلتر بعد تمرير 0.25 ضعف حجم العمود. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، انقل 90 ميكرولترا من الماء المقطر من الدرجة المختبرية من خزان إلى كل بئر من صفيحة معتمة مسطحة القاع ذات 96 بئرا. ثم انقل 10 ميكرولترات من العينات من صفيحة 96 بئرا إلى لوحة معتمة ، مسطحة القاع ، 96 بئرا ، وضع لوحة البئر في قارئ الصفيحة.بالنسبة إلى GFP المسمى بالفلورسنت ، et الإثارة أقرب ما يمكن إلى 488 نانومتر واكتشاف انبعاث الفلورسنت في أقرب وقت ممكن من 507 نانومتر قبل قياس الإشارة. أشار التحقيق في النطاق الديناميكي والحدود الدنيا للبروتين الفلوري الأخضر المحسن ، أو اكتشاف EGFP لقارئ اللوحة ، إلى أن قارئ اللوحة لديه حد كشف أقل يبلغ 30 نانوجرام ونطاق ديناميكي يصل إلى 500 نانوجرام من البروتين المسمى EGFP لكل بئر قبل تشبع الإشارة. سمح تحويل أحجام الشطف إلى Kav ورسمها مقابل الأوزان الجزيئية اللوغاريتمية بتقدير الوزن الجزيئي للمستقبلات المقترنة بالبروتين G عن طريق استيفاء المنحنى القياسي.تم استكشاف ظروف استخراج الغشاء المثلى من خلال اختبار DDM و lauryl maltose neopentyl glycol ضد الاستخراج الخالي من المنظفات باستخدام كوبوليمر حمض الماليك الستايرين. تم فحص تأثير إضافة الربيطة على ملف كروماتوغرافيا استبعاد حجم التألق عن طريق إضافة سفينغوسين-1-فوسفات ، أو S1P ، إلى العينة أثناء الذوبان. أظهرت العينة القابلة للذوبان في وجود S1P أثرا فائقا مع تجميع منخفض.أشار التحقيق في الاستقرار طويل الأجل لمستقبلات السيروتونين 5HT2AR في ظل ظروف مختلفة إلى أن البروتين الموجود في جزيئات دهون حمض المالئيك الستايرين ظل مستقرا لفترة أطول ، حتى في درجات الحرارة غير المواتية. الوقت بين نقطة الذوبان والعينة التي تمر أسفل عمود SEC حرج للوقت. يجب ألا يكون هناك توقف مؤقت ، ويجب أن تبقى العينة باردة.بعد FSEC ، سيتم اكتساب فهم لأفضل بنية أو منظف أو مخزن مؤقت. وهذا يسمح بتحسين تنقية البروتين ويدعم التوصيف البيوفيزيائي والهيكلي النهائي.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

على الانترنت الحجم الاستبعاد والتبادل الأيوني اللوني على SAXS خط الأشعة

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

هضم البروتين، أولترافيلتراتيون، وحجم الاستبعاد اللوني لتحسين عزل اكسوسوميس من بلازما الدم البشري والمصل

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

تحليل الغشاء ثايلاكويد البروتين المجمعات بالتفريد جل الأصلي الأزرق

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

تحليل الطيفي تقلب Fluorescence من تفاعلات البروتين البروتين في الخلية جهات الاتصال

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

بنية حل أزرق نيون البروتين باستخدام ميشاندكوليكت

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

قياس حساسية عالية من الانتماءات الملزمة الحمض النووي عامل النسخ بالتنافسية معايرة باستخدام مجهر الأسفار

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

توصيف البروتينات حسب الحجم والاستبعاد الكروماتوغرافيا المقترنة بتشتت الضوء متعدد الزوايا (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

تقييم تفاعلات البروتين والبروتين باستخدام تقنية الهضم على الغشاء

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

التحديد الكمي المطلق لاستقلاب تخليق البروتين الخالي من الخلايا بواسطة الفصل اللوني السائل للمرحلة المعكوسة

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...